微生物发酵产酶(五、一)

来源：淀粉及其水解物—淀粉水解糖、糖蜜、或含淀粉的 原料如大米、薯类、玉米、麸皮、米糠等。
此外有些微生物可以采用脂肪、石油、乙醇等为碳源。
注意：在选择碳源时，应尽量选择对所需酶有诱导作用的 碳源，而不使用或少使用有分解代谢物阻遏作用的碳源。
2、氮源：提供氮元素。
来源：①有机氮：常利用农副产品的籽实榨油后的 副产品，如豆饼、花生饼、菜子饼等；
易于在实验室操作、生长迅速，而 且营养要求低。
应用最广泛的产酶菌，一般分泌胞内 酶。常在工业生产中应用于生产谷氨 酸脱羧酶、天冬氨酸酶、限制性核酸 内切酶等。
醋酸杆菌（Acetobacter）
▪ 菌体从椭圆至杆状，单个、 成对或成链，革兰氏阴性， 不生芽孢。含糖、乙醇和 酵母膏的培养基上生长良 好。
（1）不同的微生物有不同的最适生长温度。
（2）有些微生物生长最适温度与发酵产酶的最适温度有所不 同。 例： 酱油曲霉生产蛋白酶，28℃时蛋白酶产量比在40 ℃条件下 高2~4倍，在20℃条件下发酵，则蛋白酶产量更高，但细胞生 长速率较慢。
为此，在有些酶的发酵生产过程中，要在不同的发酵阶段 控制不同的温度，即在微生物生长阶段控制在生长的最适温度 范围，而在产酶阶段控制在产酶最适温度范围。
黑曲霉 α-淀粉酶
pH值中性
↑
pH值偏酸性 ↓
糖化酶 ↓ ↑
（4）影响pH值的因素
① 一般来说，培养基成分中C/N比高，发酵液倾向于酸性， pH低；C/N比低，发酵液倾向于碱性，pH高。
① 不同盐的利用对pH也会产生影响。
① pH值还与通气量有关。
（5）生产中控制pH值的方法 ①调节培养基的原始pH，保持一定的C/N比； ②添加缓冲液维持一定的pH值（如磷酸盐）； ③发酵液中pH过高，加糖或淀粉来调节。反之，加尿素 或液氨； ④通过调节通气量来实现； ⑤ 加酸、碱。
第二节 产酶微生物的特点
用于酶发酵生产的微生物必 需具备的条件：
（1）酶的产量高 （2）容易培养和管理 （3）产酶稳定性好 （4）利于酶的分离纯化 （5）安全可靠
（一）常用的产酶微生物
1、细菌
大肠杆菌（Escherichia coli）
形态：杆状，革兰氏阴性，运动或不 运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈 白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。
酶的发酵生产是现在产酶的主要方法。
一、酶发酵生产的类型
1、固体培养发酵：主要适于各种霉菌的发酵产酶
培养基以麸皮、米糠等为主要原料，经灭菌后，接入产酶 菌株，在一定条件下发酵。
例:
麸皮、米糠 酒曲、酱油曲 淀粉酶、蛋白酶
优点：设备简单，操作方便，酶浓度高。
缺点：劳动强度大，原料利用率低，生产周期长。
（1）不受培养基中某种物质阻遏时，可随着细胞生长而开始 合成；受阻遏的酶，要在细胞生长一段时间或进入稳定期后， 解除阻遏，酶才开始合成。
（2） mRNA稳定性高的，可在细胞停止生长后继续合成其对 应的酶；稳定性差的，随着细胞生长停止而终止酶的合成。
（3）在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵 周期，最理想的合成模式是延续合成型。
（3）温度的控制方法
一般采用热水升温，冷水降温。因此，在发酵罐中均设有 足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管，夹套、喷淋管等。
2、pH值的调节控制
（1）不同微生物，其生长繁殖的最适pH值有所不同。 （2） 微生物生长的最适pH值与产酶最适pH值往往不同。 （3）有些微生物可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过 控制培养基的pH，往往可以改变各种酶之间的产量比例。
一、生产种子的制备
生产种子：由原始保藏菌种，经过活化，扩大培养，用 于发酵罐接种的大量菌体。
1、种子制备工艺过程
保藏菌种
活化培养
逐级摇瓶培养
种子罐培养
接种至发酵罐
二、培养基
培养基是人工配制的供微生物生长、繁殖及合成酶的营养 物质的混合物。
碳源、氮源、无机盐、生长因素、水等。
1、碳源：提供碳元素；能源。
{液态酶制剂}
[ 原始菌种 ] ↓
试管斜面培养(活化) ↓
摇瓶等分级扩大培养 ↓
种子罐培养 ↓
[ 发酵罐(液体发酵) ]
↓
↓ 培养
↓ [ 发酵液 ]
↓
↓ ↓下游加工
↓
{各种精制酶制剂}
[ 麸皮等原料 ] ↓
[ 配制培养基] (灭菌)
[ 发酵池(固体发酵) ]
[ 成品曲 ]
{固体粗酶制剂}
酶发酵生产的一般工艺流程图
（1）同步合成型 （2）延续合成型 （3）中期合成型 （4）滞后合成型
1、同步合成型
▪酶的生物合成与细胞的生长同步进行，又称生长偶联型。 大部分组成酶和部分诱导酶的生物合成属于同步合成型。
特点：
（1）发酵开始，细胞生长， 酶也开始合成，说明不受分解 代谢物和终产物阻遏。
（2）生长至平衡期后，酶浓 度不再增长
2、液体深层发酵（目前酶发酵生产的主要方式 ）
液体培养基，经灭菌、冷却后，接入产酶细胞，在一定条件 下发酵。
适于微生物、动植物细胞。
优点：机械化强度高，酶 产率高，产品回收率高
缺点：技术管理要求高
3、固定化细胞发酵（70年代后期发展）
将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。
优点：细胞密度高，可反复使用，利于产品分离纯化 缺点：需要特殊的固定化细胞反应器，只适用胞外酶 生产
3、溶解氧的调节控制
溶解氧指溶解在培养基中的氧。微生物一般只能利用溶 解氧。
▪调节溶氧速率的方法 （1）调节通气量； （2）调节氧的分压； （3）调节气液接触时间； （4）调节气液接触面积； （5）改变培养液性质。
4、泡沫
▪形成：通气搅拌、培养基中某些成分的变化、代谢产生的气体。 ▪危害：阻碍CO2的排除，影响氧的溶解；引起染菌。 ▪消泡方法：机械消泡、化学消泡。
②无机氮：含氮的无机化合物，如（NH4）2SO4、 NH4NO3 、NaNO3和（NH4）3PO4等。
3、无机盐：大量元素和微量元素。 基本功能：构成细胞的成分； 构成酶产品的组分； 作为酶的激活剂。
4、生长因子
指微生物生长繁殖所必不可缺的微量有机物，主要包括各 种氨基酸、嘌呤或嘧啶、维生素等三类物质。
米曲霉（Aspergillus oryzae ）
生产糖化酶、蛋白酶、氨基酰化酶、磷酸二酯 酶、果胶酶等。
红曲霉（Monascus）
生产α-淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。
青霉（Penicillium）
青霉是世界分布最广的几类真菌之一。生产葡萄糖氧化酶、苯 氧甲基青霉素酰化酶、纤维素酶等。
木霉（Trichoderma）
酶制剂中所用的生长因子，大多是由天然原料提供，如玉 米浆、麦芽汁、豆芽汁、麸皮、米糠、酵母膏等。
5、水
微生物发酵产酶培养基举例
1、枯草杆菌BF7658 ａ-淀粉酶发酵培养基：
玉米粉 8%
豆饼粉 4%
磷酸氢二钠 0.8%
硫酸铵
0.4%
氯化钙
0.2%
氯化铵
0.15%
自然pH
三、发酵条件的控制 1、温度的调节控制
浓度
细胞浓度 酶浓度
时间(h)
2、中期合成型
▪酶的合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进 入稳定期后，酶的合成也停止。
浓度
特点：
（1）该类酶的合成受分解代 谢物阻遏。
细胞浓度 酶浓度
时间(h)
3、延续合成型
▪酶的合成伴随着细胞生长而开始，但在细胞进入稳定期后， 酶还可以延续合成较长的一段时间。
▪ 木霉具有较强分解纤维素能力。在木质素、纤维素丰富的基
质上生长快，传播蔓延迅速。棉籽壳、木屑、段木都是其良 好的营养物。
▪ 生产纤维素酶的重要菌株。
根霉(Rhizopus)
▪ 根霉因有假根（Rhizoid） 而得名（假根的功能是在 培养基上固着，并吸收营 养）。
▪ 分布于土壤、空气中，常 见于淀粉食品上，可引起 霉腐变质和水果、蔬菜的 腐烂。
特点：
（1）该类酶不受分解代谢产 物阻遏和终产物阻遏。
浓度
酶浓度 细胞浓度
时间(h)
4、滞后合成型
▪只有当细胞生长一段时间或者进入稳定期以后，酶才开始 合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。
特点：
（1）该类酶受分解代谢物 阻遏作用的影响，阻遏解除 后，酶才大量合成。
浓度
酶浓度 细胞浓度
霉菌与产酶
▪ 选用不同的霉菌作为发酵菌种，不仅可以酿制酱、 酱油、醋、豆腐乳等食品，还可以应用于生产有机 酸、酶制剂、维生素、生物碱及激素等多种产品;
▪ 据统计，在550种酶制剂中有近1/3是霉菌产生的。
霉菌产酶举例
黑曲霉（Aspergillus niger）
生产糖化酶、α -淀粉酶、酸性蛋白酶、果 胶酶、过氧化氢酶、脂肪酶等；
时间(h)
属于滞后合成型的酶，之所以要在细胞生长一段时 间甚至进入稳定期以后才开始合成，主要原因是由于受 到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的 生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开 始大量合成。 若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成 可以转为延续合成型。
小结：
▪影响酶生物合成模式的主要因素：培养基中阻遏物的存在和 mRNA的稳定性。
4、固定化原生质体发酵（80年代中期发展）
原生质体是指除去了细胞壁的微生物细胞或植物细胞。
优点：解除细胞壁扩散阻碍；易于细胞间质中的酶的 分泌；可反复或连续使用
缺点：制备复杂，维持较高的渗透压，需防止细胞壁 再生
二、酶生物合成的调节
1、酶合成的诱导作用
在培养基中加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速进 行的现象，称为诱导作用。
▪ 应用：有机酸(食醋等） 葡萄糖异构酶(高果糖浆 )