分子诊断与临床-精品文档

合集下载

分子病理学

免疫细胞化学细胞学 FISH (HER-2,
UroVysion) 图象分析细胞遗传学 (FISH) 分子病理诊断流式细胞计数
专项实验室免疫组织（细胞）化学
专项实验室
流式细胞学
分子诊断
接收和传递
诊断
记录, 归档和切片归还
Modern Pathologist
二.分子病理学的概念和任务
分子病理学是在蛋白质和核酸水平，应用分子生物学技术研究疾病发生发展过程的病理学的一个分支学科
分子病理学是在研究生命现象的分子基础上，探索疾病状态及其愈复过程中出现的细胞生物学和分子生物学现象
第二节分子病理学的研究内容
疾病的病因发病机制病理变化转归功能变化
第三节目前的研究现状
病因学研究多基因疾病
发病机制研究中的分子问题病理诊断中的分子问题
附：分子病理诊断技术简介
A. 分子诊断方法
DNA和RNA：PCR、Real－time PCR、 RT-PCR、ISH、DNA测序、 DNA微阵列
蛋白质：蛋白组学、组织阵列、免疫组化、流式细胞检查
分子病理学
分子病理学
绪
论
第一节病理学与分子病理学的概念和性质
一、病理学的概念和性质
①研究疾病的原因(病因学)
②探索疾病的发生机制
③描述疾病发生发展过程中可见的形态学变化
④揭示各种疾病所引起的功能异常
器官病理学细胞病理学超微病理学分子病理学
病理学微生物学和病毒学
化学病理学或临床生物化学免疫学
关键措施 1.优化操作流程 2.优选放大系统
(2) 体外酶促核酸扩增技术演进
凝胶电泳 ELISA样实验 (酶联免疫吸附) FRET方法 (荧光共振能量交换)

CRISPR-Cas系统在病原微生物分子诊断中的研究进展

㊃综述㊃D O I:10.3969/j.i s s n.1672-9455.2024.05.023C R I S P R-C a s系统在病原微生物分子诊断中的研究进展*龙文巧1,许永杰2综述,张华1,2ә审校1.遵义医科大学,贵州遵义563000;2.贵州省人民医院检验科,贵州贵阳550000摘要:快速㊁灵敏㊁准确的病原微生物检测方法对感染性疾病的诊治及防控至关重要㊂基于成簇规律间隔短回文重复序列(C R I S P R)-C R I S P R相关蛋白(C a s)系统的检测技术在病原微生物核酸检测中具有高灵敏度和高特异度的特点,该文概述了C R I S P R-C a s系统的作用机制及不同C a s的核酸酶活性,总结了基于C I S P R-C a s系统的检测技术在病原微生物核酸检测中的研究现状,对该系统在核酸检测应用中的挑战进行了综合分析,并提出了目前存在的一些解决方案㊂目前基于C R I S P R-C a s系统的非核酸分析物检测仍处于前期研究阶段,但其在扩大检测范围㊁缩短检测时间㊁提高检测灵敏度等方面具有较大潜力,为开发基于C R I S P R-C a s系统的病原微生物检测平台提供新思路㊂关键词:成簇规律间隔短回文重复序列-成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白系统;病原微生物;核酸检测;非核酸分析物检测;应用中图法分类号:R446文献标志码:A文章编号:1672-9455(2024)05-0687-06A d v a n c e s i n C R I S P R-C a s s y s t e m s-b a s e d m o l e c u l a r d i a g n o s i s o f p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s*L O N G W e n q i a o1,X U Y o n g j i e2,Z HA N G H u a1,2ә1.Z u n y i M e d i c a l U n i v e r s i t y,Z u n y i,G u i z h o u563000,C h i n a;2.D e p a r t m e n t o f C l i n i c a lL a b o r a t o r y,G u i z h o u P r o v i n c i a l P e o p l e's H o s p i t a l,G u i y a n g,G u i z h o u550000,C h i n aA b s t r a c t:R a p i d,s e n s i t i v e a n d a c c u r a t e d e t e c t i o n o f p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s i s c r i t i c a l f o r t h e d i a g n o-s i s,t r e a t m e n t,p r e v e n t i o n a n d c o n t r o l o f i n f e c t i o u s d i s e a s e s.B a s e d o n t h e h i g h s e n s i t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y c h a r-a c t e r i s t i c s o f d e t e c t i o n t e c h n i q u e s o f c l u s t e r e d r e g u l a r l y i n t e r s p a c e d s h o r t p a l i n d r o m i c r e p e a t s(C R I S P R)-C R I S P R-a s s o c i a t e d p r o t e i n(C a s)s y s t e m s.T h i s r e v i e w s u mm a r i z e s t h e m e c h a n i s m o f C R I S P R-C a s s y s t e m, t h e n u c l e a s e a c t i v i t i e s o f d i f f e r e n t C a s a n d t h e r e s e a r c h s t a t u s o f C R I S P R-C a s d e t e c t i o n t e c h n o l o g y i n t h e d e-t e c t i o n o f p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s.M o r e o v e r,t h e c h a l l e n g e s o f t h e C R I S P R-C a s s y s t e m i n t h e a p p l i c a t i o n o f n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n a r e c o m p r e h e n s i v e l y a n a l y z e d,a n d s o m e e x i s t i n g s o l u t i o n s a r e p r o p o s e d.A t p r e s e n t, t h e d e t e c t i o n o f n o n-n u c l e i c a c i d t a r g e t s b a s e d o n t h e C R I S P R-C a s s y s t e m i s s t i l l i n t h e p r e l i m i n a r y r e s e a r c h s t a g e,b u t i t h a s g r e a t p o t e n t i a l t o e x p a n d t h e d e t e c t i o n f i e l d,s h o r t e n t h e d e t e c t i o n t i m e a n d i m p r o v e t h e d e t e c-t i o n s e n s i t i v i t y,w h i c h p r o v i d e s a n e w w a y f o r t h e d e v e l o p m e n t o f p a t h o g e n i c m i c r o b i a l d e t e c t i o n p l a t f o r m s b a s e d o n t h e C R I S P R-C a s s y s t e m.K e y w o r d s:C R I S P R-C a s s y s t e m;p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s; n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n; n o n-n u c l e i c a c i d a n a l y t e s d e t e c t i o n;a p p l i c a t i o n常见的病原微生物如病毒㊁细菌㊁真菌等引起的感染性疾病仍是危害人类健康的主要原因之一[1]㊂因此,快速㊁灵敏㊁准确㊁简便的检测方法对感染性疾病的诊断㊁疗效评估及预防控制具有重要意义㊂基于成簇规律间隔短回文重复序列(C R I S P R)-C R I S P R相关蛋白(C a s)系统的检测技术因具有高灵敏度㊁高特异度㊁快速㊁便携等优点而广泛应用于病原微生物的检测中[2]㊂1987年I S H I N O等[3]在大肠杆菌中首次发现了C R I S P R基因组,2005年H A F T等[4]鉴定了C a s的功能,随后P O U R C E L等[5]证明了C R I S P R-C a s系统是细菌抵抗噬菌体入侵的适应性免疫系统㊂目前C R I S P R-C a s系统除了应用于基因编辑技术外,还广泛应用于病原微生物核酸检测技术[6]㊂基于C R I S P R-C a s系统的核酸检测技术表现出高灵敏度㊁高特异度㊁快速等优点,可实现现场检测,在感染性疾病诊断方面具有巨大应用前景㊂同时,基于C R I S P R-C a s系统的核酸检测技术的进一步应用也存在许多挑战,这些挑战包括开发快速高效的核酸提取方式㊁简便的检测程序及高通量检测技术等[7]㊂随着基于㊃786㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n,M a r c h2024,V o l.21,N o.5*基金项目:国家自然科学基金项目(82160026)㊂ә通信作者,E-m a i l:780837482@q q.c o m㊂C R I S P R-C a s系统的核酸检测技术的发展,非核酸分析物的检测也成为当前研究热点[8]㊂本文概述了C R I S P R-C a s系统的作用机制和不同效应蛋白的核酸酶活性,综述了C R I S P R-C a s系统在病原微生物核酸检测中的应用研究进展和挑战,并进一步介绍了C R I S P R-C a s系统在抗原㊁血清学抗体㊁病原体等非核酸分析物检测方面的最新研究热点㊂1 C R I S P R-C a s系统概述C R I S P R-C a s系统由存储记忆的C R I S P R和C a s 基因组成,这两部分共同作用形成C R I S P R-C a s效应复合体,参与核酸识别㊁切割过程[4]㊂C R I S P R-C a s系统通过将外来噬菌体D N A储存到细菌宿主染色体中形成记忆,进而阻止噬菌体再次感染㊂C R I S P R-C a s 系统遵循免疫的3个主要阶段[9]:(1)适应㊂对外来核苷酸序列识别㊁处理后将间隔序列整合到C R I S P R 基因座中,由此存储首次感染的记忆㊂(2)C R I S P R R N A(c r R N A)成熟㊂间隔序列翻译成c r R N A和反式激活R N A通过碱基配对形成向导R N A(s g R N A),用于募集C a s㊂(3)干扰㊂C a s通过结合s g R N A形成效应复合物,在原间隔相邻基序(P AM)的协助下对靶标识别并切割,完成对外来核苷酸序列的特异性清除㊂不同的C a s具有不同的核酸内切酶活性,当前研究主要集中于C a s9㊁C a s12㊁C a s13㊁C a s14,C a s9结合s g R N A后特异性识别和切割靶标,通过对切割产物的分析实现靶标的检测[10]㊂而C a s12㊁C a s13㊁C a s14识别并结合c r R N A及靶标后形成效应复合体,该复合体可非特异性切割任意单链D N A或单链R N A,该过程被称为反式切割㊂此类蛋白反式切割大量带有标记的单链D N A或单链R N A报告探针,进而输出检测信号㊂基于C R I S P R-C a s系统的病原微生物检测技术可分为两类[11]:第1类是通过提取基因组,联合C R I S P R-C a s系统建立核酸检测方法;第2类是通过适配体或抗体识别非核酸分析物,直接或间接与C R I S P R-C a s系统联合,实现非核酸分析物的检测㊂2基于C R I S P R-C a s系统的病原微生物核酸检测基于C R I S P R-C a s系统的核酸检测技术常通过对样品中的微量核酸进行特异性识别和信号放大完成相关检测㊂目前,基于C R I S P R-C a s9/C a s13/ C a s12/C a s14系统的检测技术具有高特异度㊁高灵敏度㊁快速等特点,已被广泛应用于核酸检测中㊂基于C R I S P R-C a s9系统的检测技术依赖于该系统识别及切割双链D N A(d s D N A)的能力,用于病原微生物的核酸检测㊂P A R D E E等[12]将基于C R I S P R-C a s9及含有激发序列的t o e h o l d传感器联合依赖核酸序列的扩增(N A S B A)方法开发一种显色纸片检测技术,建立了可视化检测寨卡病毒检测技术,该技术通过比色法输出检测信号,检测灵敏度可达3f m o l/L,能鉴别美洲和非洲寨卡病毒株,且不需要昂贵的设备㊂但N A S B A需要3种酶使得反应成本较高,反应成分较复杂,检测时间较长㊂选择合适的核酸扩增方法对提高检测平台的综合检测性能至关重要㊂此外,去核酸酶活性的C a s9(d C a s9)保留了d s D N A的结合能力,对目标核酸序列无切割活性,也可用于核酸检测㊂H A I J I A N等[13]开发了C R I S P R芯片(C R I S P R-C h i p)技术,该技术将d C a s固定于石墨烯电子晶体管,在s g R N A辅助下,加入目标d s D N A后在晶体管上形成d C a s-s g R N A-d s D N A复合物,该复合物会改变晶体管电导率,可根据电导率变化得出检测结果㊂C R I S P R-C h i p技术无须对靶标进行检测前扩增,可直接检测到1.7f m o l/L的目标d s D N A,耗时15m i n㊂C a s9和d C a s9常用于核酸检测,但此类技术的信号放大及输出过程较复杂㊂C a s12a㊁C a s13a㊁C a s14等具有反式切割活性的发现为开发更简便㊁快速㊁精准的基于C R I S P R-C a s系统的检测平台提供更多可能㊂基于C R I S P R-C a s12/C a s13/C a s14系统的检测技术通常利用C a s的反式切割活性直接切割带标记的检测探针,从而产生各种信号(如荧光㊁比色㊁电化学等),直接㊁快速地获得较高的检测灵敏度㊂K E L L-N E R等[2]将重组酶聚合扩增技术(R P A)联合C R I S P R-C a s13a系统,建立了S H E R L O C K技术㊂该技术通过切割淬灭的荧光报告探针放大和输出检测信号,在寨卡病毒检测中可达到单碱基分辨率,并极大地提高了检测的灵敏度㊂此外,C a s12a同样具有强大的反式切割活性,C H E N等[14]将C R I S P R-C a s12a 系统联合R P A开发了D E T E C T R技术㊂S H E R-L O C K及D E T E C T R技术具有高灵敏度㊁高特异度和快速等优点,并为开发更多新的基于C R I S P R-C a s 系统的检测技术提供基础㊂但此类技术有两步反应,增加了检测过程中被污染的风险,进一步的研究可通过将核酸扩增过程与C R I S P R检测过程整合于单一反应体系中进而降低检测过程被污染的风险㊂基于C R I S P R-C a s系统的检测技术在实际应用中面临着复杂的核酸提取方式和检测程序,以及难以实现对单一c r R N A及C a s进行多重靶标检测等挑战,这些挑战限制了新技术在实际样本检测中的应用㊂3病原微生物核酸检测的挑战基于C R I S P R-C a s系统的病原微生物核酸检测在临床应用上面临需开发简易的核酸提取方法,简化检测程序,建立多重检测平台等诸多挑战[7],笔者进一步讨论了目前的一些解决方案㊂3.1核酸提取的简化简化核酸提取过程仍然是快速核酸检测技术发展的主要瓶颈,因此需要开发快速高效的核酸提取方法促进基于C R I S P R-C a s系统的检测技术的应用㊂MY H R V O L D等[15]建立了样本加㊃886㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n,M a r c h2024,V o l.21,N o.5热消除核酸酶非提取(HU D S O N)技术,将HU D S O N 与S H E R L O C K技术联合,在提取和纯化D N A或R N A的情况下裂解病毒,可以直接从临床样本中检测病毒核酸,极大地简化了操作步骤,降低了气溶胶污染的风险㊂然而,HU D S O N技术缺乏纯化和浓缩核酸的步骤,可能会降低检测复杂样本中目标核酸的能力㊂纳米材料和技术可以通过简便的工艺从复杂样品中提取目标核酸㊂纳米级的隔离膜具有较大的比表面积,R O D R I G U E Z等[16]开发了基于纸张核酸扩增的流控芯片技术,该技术使用的隔离膜通过静电作用和氢键结合力将高盐溶液中的目标核酸快速㊁高效地分离,使吸附在膜上的核酸保持稳定的结合,通过环介导等温扩增(L AM P)技术在原位扩增,实现目标序列的富集㊁纯化和扩增,完成从样品到结果的集成检测㊂目前,芯片上的等温放大步骤需要外部热源,该技术使用加热模块来辅助等温扩增,因此,若在基于纸张的微流控检测平台中整合一个集成的加热系统将大大加强其便携性㊂3.2检测过程的简化大多数基于C R I S P R-C a s系统的检测技术仍然使用标准的两步检测法,此类方法增加了检测的时间和检测过程中交叉污染的风险,这促使研究者开发单管检测策略㊂常规两步检测法首先利用核酸扩增技术提高靶标的浓度,再联合C R I S P R-C a s系统产生放大的检测信号[2]㊂但核酸扩增技术扩增靶标的同时,还增加了非特异性扩增的风险,故研究者们开发了无须靶标扩增的超灵敏的检测方法㊂3.2.1单管检测策略基于C R I S P R-C a s系统的单管检测技术将核酸扩增和C R I S P R-C a s系统反应整合于一个缓冲体系,用于快速现场检测㊂单管检测是在反应管底部添加核酸扩增试剂,在反应管盖上也添加C a s12a和c r R N A试剂,反应管底部的核酸扩增完成后,将预先加在管盖上的C a s12a和c r R N A试剂通过离心移至管底,使C a s12a和c r R N A试剂与扩增子混合,实现在1管内完成扩增和检测,避免了气溶胶污染[17]㊂但此技术先进行靶标扩增再将扩增产物与C R I S P R-C a s系统反应,检测时间较长㊂因此,研究者们将靶标的扩增与C R I S P R-C a s系统整合于一个缓冲系统中同时进行反应,缩短了检测时间㊂根据核酸扩增步骤和C R I S P R-C a s系统反应的温度偏好, J O U N G等[18]将L AM P介导的核酸扩增反应(55~ 65ħ)与耐高温的C a s12b(31~59ħ)集中于一管中同时完成核酸扩增与信号检测,建立了单管检测技术㊂该技术不但降低了交叉污染的风险,还明显缩短了检测时间㊂同样,该技术的核酸扩增过程也需要加热,未来的研究可通过开发集成加热系统,进一步简化工作流程,进而在不同环境下均可进行相关核酸检测㊂3.2.2无扩增检测策略无核酸扩增步骤的检测策略具有快速㊁避免非特异性扩增㊁不易产生交叉污染等优势,但可能会造成检测灵敏度下降㊂为解决灵敏度下降这一问题,研究者们通常使用超灵敏信号报告系统㊁信号级联放大技术,以及微小体积等方式提高灵敏度[13]㊂首先,电化学传感器㊁金属纳米材料㊁高性能的表面增强拉曼散射技术等可放大来自C R I S P R-C a s系统的微弱信号,超灵敏地检测低浓度靶标㊂其次,因实验中C R I S P R-C a s系统反应速率与C a s-c r R N A复合物的数量呈正比,基于C R I S P R-C a s系统的检测用多个C a s-c r R N A复合物直接靶向目标序列的不同位点,通过加快信号积累速率,在更短的时间内达到检测信号阈值[19]㊂此外,根据C a s的反式切割活性与底物浓度呈正比的原理,空间限制检测体系可浓缩底物进而提高检测灵敏度[20]㊂不同无扩增策略的组合可提高检测的灵敏度㊂基于C R I S P R-C a s系统的无扩增数字R N A检测技术通过采用多个C a s13a-c r R N A复合物靶向多个位点在空间限制体系(反应体积减小到n L水平)中检测新型冠状病毒(S A R S-C o V-2),检测限为5f m o l/L,耗时5m i n[21]㊂因此,合理整合上述策略可以实现无扩增㊁快速㊁灵敏的靶标检测㊂但由于缺乏靶标扩增步骤,用来增加灵敏度的策略可能会增加检测方法的复杂性和费用,在选择或设计检测方法时,必须综合考虑这些策略的优缺点㊂3.3多重检测多重检测可以提高诊断效能,实现大规模样本的高通量检测㊂G O O T E N B E R G等[22]利用P s m C a s13b㊁L w a C a s13a㊁C c a C a s13b和C a s12a分别切割富含特定核苷酸序列的报告探针,实现了四重检测㊂但在该检测方法中,C a s的反式切割可能会产生信号重叠以降低检测的特异度,且该技术涉及较多的蛋白质种类,导致检测成本较高㊂因此,一种通过D N A阻断剂调控C a s反式切割活性的检测方法以单一蛋白实现了多重靶标的检测一定程度上降低了检测成本㊂H A N等[23]开发了一种基于C a s12a-D N A 阻断剂的多重检测(C A S T I)技术㊂C A S T I可以通过联合R P A扩增靶标,以一种C a s实现人乳头瘤病毒(H P V)16和H P V18基因的检测,检测限为1a m o l/L㊂该多重检测平台有助于在设备有限的条件下进行病原微生物的检测㊂然而,与检测人工合成的D N A靶标相比,该技术在细胞系和临床样本中检测目标D N A的效率较低,因此,需要进一步优化实验条件以避免样本中其他D N A或R N A的干扰㊂此外,A C KE R MA N等[24]将核酸多重评估的组合排列反应(C A R M E N)联合C R I S P R-C a s13a系统,开发一种多通道检测方法(C A R M E N-C a s l3)㊂C A R M E N-C a s l3已可同时检测169种人类病毒,还能区分多种㊃986㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n,M a r c h2024,V o l.21,N o.5亚型的流感病毒,检测时间为5m i n㊂C A R M E N-C a s13的灵敏度和特异度可与S H E R L O C K技术匹配,这对病原微生物高通量检测及流行病学研究至关重要㊂该技术可检测来自不同人群的数千份样本,需要专业人员对检测结果进行仔细分析解释㊂该技术若能与移动电话应用程序连接将直接读出检测结果,会有更大的应用潜力㊂4基于C R I S P R-C a s系统相关的病原微生物非核酸分析物检测病原微生物及其抗原和血清学抗体等非核酸分析物往往在发病早期和治疗开始后以低浓度出现㊂灵敏和可定量的基于C R I S P R-C a s系统的检测技术有助于发现早期病变和准确评估疾病疗效[25]㊂近年来,基于C R I S P R-C a s系统的检测技术已用于检测多种类型靶标,包括病原体㊁抗原㊁血清学抗体等㊂4.1基于C R I S P R-C a s系统相关的病原微生物直接检测基于C R I S P R-C a s系统的病原微生物直接检测常通过抗体或适配体识别致病菌,再与C R I S P R-C a s系统联合放大检测信号,实现免培养㊁免提取的病原微生物直接检测㊂基于抗体的检测方法利用抗体对靶细菌识别,通过免疫夹心法联合C R I S P R-C a s12a 系统输出检测结果㊂D U A N等[26]开发了一种基于C R I S P R-C a s12a系统引导㊁无D N A提取和扩增㊁可快速直接检测病原体的生物传感器(C A T C H E R)㊂C A T C H E R通过免疫夹心结构(标记鼠伤寒抗体的磁珠㊁靶细菌㊁标记鼠伤寒抗体和D N A核酸内切酶Ⅰ的胶体金),经磁分离后巧妙地利用D N A核酸内切酶Ⅰ将溶液中单链D N A激活探针降解为短寡核苷酸,改变C R I S P R-C a s12a系统生物活性,进而输出检测结果,检测限为7.9ˑ101C F U/m L㊂该方法为非核酸分析物的检测提供了一个通用平台㊂相比价格较贵的抗体识别方法,适配体识别方法成本较低且步骤更简便㊂基于适配体的方法,研究者通常识别适配体靶标后释放一个D N A或R N A激活探针用于激活C R I S P R-C a s系统,进而完成信号的放大及输出㊂S H E N等[27]开发了将核酸变构探针(A P)与C R I S P R-C a s13a系统联合的A P C-C a s检测方法㊂该方法通过A P识别靶细菌后暴露引物结合位点,引物在D N A聚合酶和T7启动子作用下进行D N A序列的延伸和转录,产生大量单链R N A激活探针及C R I S P R-C a s13系统,通过荧光信号输出结果㊂该技术可快速㊁直接㊁定量检测各种样本中肠炎单胞菌数(1~ 105C F U/m L)㊂以上病原微生物直接检测技术省去了检测前核酸提取和扩增步骤,明显缩短了检测时间㊂4.2基于C R I S P R-C a s系统相关的病原微生物抗原检测病原微生物抗原与致病力密切相关,抗原检测也是传染性疾病诊断的主要方式之一㊂基于C R I S P R-C a s系统的检测技术检测抗原时大多需利用适配体识别抗原后将抗原转化为核酸信号,联合C R I S P R-C a s系统放大检测信号,实现抗原快速检测㊂生物毒素是细菌产生的一类重要抗原,会引起人类急性中毒㊁致癌或致畸等,生物毒素的检测有助于评估细菌感染严重程度和预防毒素引发的休克㊂A B-N O U S等[28]利用核酸适配体联合C R I S P R-C a s12a系统识别黄曲霉毒素M1(A F M1),开发了简便㊁高效的抗原检测技术㊂在添加了A F M1的牛奶样品中,该技术在0.5~50.0n g/L呈现出较宽的线性关系㊂该技术利用比色法,通过颜色的变化输出检测结果,不需要昂贵设备,信号输出方式简便,便于现场检测,但比色这一信号输出方式灵敏度相对较低㊂研究者可探索使用包括金属有机框架在内的新型纳米材料来提高传感器的灵敏度㊂此外,病毒抗原往往决定了病毒的宿主㊁组织嗜性及其致病的能力,也成为检测的重要靶标㊂通过适配体联合C R I S P R-C a s12a系统,研究者建立了S A R S-C o V-2抗原的电化学检测平台[29],实现核衣壳蛋白的检测㊂与常规抗原检测法相比,基于C R I S P R-C a s系统的抗原检测技术提高了抗原检测的特异度和灵敏度,并可对抗原进行定量检测㊂4.3基于C R I S P R-C a s系统相关的病原微生物抗体检测抗体检测在疾病诊断㊁疗效评估和流行病学调查中具有重要意义㊂B A R B E R等[30]建立了C R I S P R-C a s9系统介导的自组装固定肽(P I C A S S O)技术㊂P I C A S S O技术通过将能与靶分子特异性结合的重组肽段与d C a s9融合形成复合物,利用s g R N A引导该复合物与微阵列表面上特定位置的D N A进行自组装,构建D N A-蛋白质微阵列,用于检测不同抗体㊂P I C A S S O技术能快速识别样本中的上千种抗体,实现了病原微生物血清学抗体快速高通量检测㊂P I C-A S S O技术已被用于检测新型冠状病毒感染(C O V-I D-19)恢复期患者血清S A R S-C o V-2的抗体㊂但该技术难以避免非特异性背景信号,未来的研究可通过改变微阵列表面寡核苷酸的间距密度及d C a s9与其融合蛋白之间的连接长度等进一步优化实验条件,提高检测特异度㊂5总结与展望基于C R I S P R-C a s系统的检测技术在病原微生物核酸和非核酸靶标的检测中迅速发展,实现对超低浓度样品的精确㊁灵敏检测㊂本文归纳了基于C R I S P R-C a s系统的检测技术的构建和应用,讨论了该技术目前存在的挑战及可能的解决办法,进一步阐述了基于C R I S P R-C a s系统的检测技术在病原微生物非核酸分析物检测方面的最新研究热点㊂核酸靶标的检测通过开发简易的核酸提取方法,简化检测程㊃096㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n,M a r c h2024,V o l.21,N o.5序,建立多重检测平台等方式提高了检测性能㊂非核酸靶标的检测则需通过适配体㊁抗体及其他方式将靶标转换成核酸信号进一步完成检测,在病原微生物检测领域展现出了更广阔的应用前景㊂尽管C R I S P R-C a s系统在病原微生物检测中具有各种优势,但仍有一些挑战需要克服㊂(1)靶基因片段选择的局限性㊂C R I S P R-C a s系统在C a s锚定目标序列时依赖于P AM,在选择检测的靶基因片段时存在一定的局限性㊂(2)c r R N A和单链D N A㊁单链R N A报告探针在添加R N A酶抑制剂的临床复杂样本中仍存在降解风险㊂(3)C a s存在一定的背景活性,不同批次的背景活性不同,导致样品检测结果不同㊂基于C R I S P R-C a s系统的检测技术在临床应用上具有巨大的潜力㊂基于C R I S P R-C a s系统的检测技术与人工智能相结合,可以促进感染性疾病的早期诊断,直接向卫生专家甚至普通人群发出警报㊂此外,基于C R I S P R-C a s系统技术的检测结果可以通过移动电话应用程序连接到云数据进行分析和储存,可用于构建医疗大数据分析平台,为临床诊疗及科学研究提供有力证据㊂C R I S P R-C a s系统现在能够检测的不仅是基因组材料,还有望扩展到更多领域㊂除病原微生物及其抗原和血清学抗体等非基因组目标外, C R I S P R-C a s系统在癌症生物标志物㊁人体样本罕见突变㊁食品水样污染检测㊁植物病原微生物检测等领域的新应用仍有待进一步探究㊂参考文献[1]D I L N AWA Z F,A C HA R Y A S,K A N U N G O A.A c l i n i c a lp e r s p e c t i v e o f c h i t o s a n n a n o p a r t i c l e s f o r i n f e c t i o u s d i s e a s e m a n a g e m e n t[J].P o l y m B u l l(B e r l),2023:1-25. [2]K E L L N E R M J,K O O B J G,G O O T E N B E R G J S,e t a l.S H E R L O C K:n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n w i t h C R I S P R n u c l e a-s e s[J].N a t P r o t o c,2019,14(10):2986-3012. [3]I S H I N O Y,S H I N A G AWA H,MA K I N O K,e t a l.N u c l e-o t i d e s e q u e n c e o f t h e i a p g e n e,r e s p o n s i b l e f o r a l k a l i n e p h o s p h a t a s e i s o z y m e c o n v e r s i o n i n E s c h e r i c h i a c o l i,a n d i-d e n t i f i c a t i o n o f t h e g e n e p r o d u c t[J].J B a c t e r i o l,1987,169(12):5429-5433.[4]HA F T D H,S E L E N G U T J,MO N G O D I N E F,e t a l.Ag u i l d o f45C R I S P R-a s s o c i a t e d(C a s)p r o t e i n f a m i l i e s a n dm u l t i p l e C R I S P R/C a s s u b t y p e s e x i s t i n p r o k a r y o t i c g e-n o m e s[J].P L o S C o m p u t B i o l,2005,1(6):e60.[5]P O U R C E L C,S A L V I G N O L G,V E R G N A U D G.C R I S P Re l e m e n t s i n Y e r s i n i a p e s t i s a c q u i r e n e w r e p e a t s b y p r ef e r e n-t i a l u p t a k e o f b a c t e r i o p h a g e D N A,a n d p r o v i d e a d d i t i o n a l t o o l s f o r e v o l u t i o n a r y s t u d i e s[J].M i c r o b i o l o g y(R e a d i n g), 2005,151(P t3):653-663.[6]V A N B E L J O UW S P B,S A N D E R S J,R O D RÍG U E Z-MO L I N A A,e t a l.R N A-t a r g e t i n g C R I S P R-C a s s y s t e m s[J].N a t R e v M i c r o b i o l,2023,21(1):21-34.[7]Q I U M,Z HO U X M,L I U L.I m p r o v e d s t r a t e g i e s f o rC R I S P R-C a s12-b a s e d n u c l e i c a c i d s d e t e c t i o n[J].J A n a lT e s t,2022,6(1):44-52.[8]L I Y,D E N G F,G O L D Y S E M.A s i m p l e a n d v e r s a t i l eC R I S P R/C a s12a-b a s e d i mm u n o s e n s i n g p l a t f o r m:t o w a r d s a t t o m o l a r l e v e l s e n s i t i v i t y f o r s m a l l p r o t e i n d i a g n o s t i c s[J].T a l a n t a,2022,246:123469.[9]J I N E K M,C H Y L I N S K I K,F O N F A R A I,e t a l.A p r o-g r a mm a b l e d u a l-R N A-g u i d e d D N A e n d o n u c l e a s e i n a d a p-t i v e b a c t e r i a l i mm u n i t y[J].S c i e n c e,2012,337(6096): 816-821.[10]K O O N I N E V,MA K A R O V A K S,Z HA N G F.D i v e r s i-t y,c l a s s i f i c a t i o n a n d e v o l u t i o n o f C R I S P R-C a s s y s t e m s [J].C u r r O p i n M i c r o b i o l,2017,37:67-78.[11]L I J J,Y A N G S S,Z U O C,e t a l.A p p l y i n g C R I S P R-C a s12a a s a s i g n a l a m p l i f i e r t o c o n s t r u c t b i o s e n s o r s f o rN o n-D N A t a r g e t s i n u l t r a l o w c o n c e n t r a t i o n s[J].A C S S e n s,2020,5(4):970-977.[12]P A R D E E K,G R E E N A A,T A K A HA S H I M K,e t a l.R a p i d,l o w-c o s t d e t e c t i o n o f z i k a v i r u s u s i n g p r o g r a mm a-b l e b i o m o l ec u l a r c o m p o n e n t s[J].C e l l,2016,165(5):1255-1266.[13]HA J I A N R Z,B A L D E R S T O N S,T R A N T,e t a l.D e t e c-t i o n o f u n a m p l i f i e d t a r g e t g e n e s v i a C R I S P R-C a s9i mm o-b i l i z e d o n a g r a p h e n e f i e l d-e f f ec t t r a n s i s t o r[J].N a t B i-o m e d E n g,2019,3(6):427-437.[14]C H E N J S,M A E B,H A R R I N G T O N L B,e t a l.C R I S P R-C a s12a t a r g e t b i n d i n g u n l e a s h e s i n d i s c r i m i n a t e s i n g l e-s t r a n-d e d D N a s e a c t i v i t y[J].S c i e n c e,2018,360(6387):436-439.[15]MY H R V O L D C,F R E I J E C A,G O O T E N B E R G J S,e ta l.F i e l d-d e p l o y ab l e v i r a l d i a g n o s t ic s u s i n g C R I S P R-C a s13[J].S c i e n c e,2018,360(6387):444-448.[16]R O D R I G U E Z N M,WO N G W S,L I U L N,e t a l.A f u l l y i n-t e g r a t e d p a p e r f l u i d i c m o l e c u l a r d i a g n o s t i c c h i p f o r t h e e x t r a c-t i o n,a m p l i f i c a t i o n,a n d d e t e c t i o n o f n u c l e i c a c i d s f r o m c l i n i c a l s a m p l e s[J].L a b C h i p,2016,16(4):753-763.[17]W A N G B,W A N G R,W A N G D Q,e t a l.C a s12a V D e t:aC R I S P R/C a s12a-B a s e d p l a t f o r m f o r r a p i d a n d v i s u a l n u c l e i ca c i d d e t e c t i o n[J].A n a l C h e m,2019,91(19):12156-12161.[18]J O U N G J,L A D HA A,S A I T O M,e t a l.D e t e c t i o n o fS A R S-C o V-2w i t h S H E R L O C K o n e-p o t t e s t i n g[J].NE n g l J M e d,2020,383(15):1492-1494.[19]D I N G X,Y I N K,L I Z Y,e t a l.U l t r a s e n s i t i v e a n d v i s u a ld e t e c t i o n o f S A R S-C o V-2u s i n g a l l-i n-o n e d u a l C R I S P R-C a s12a a s s a y[J].N a t C o mm u n,2020,11(1):4711.[20]T I A N T,S HU B W,J I A N G Y Z,e t a l.A n u l t r a l o c a l i z e dC a s13a a s s a y e n a b l e s u n i v e r s a l a n d n u c l e i c a c i d a m p l i f i c a-t i o n-f r e e s i n g l e-m o l e c u l e R N A d i a g n o s t i c s[J].A C S N a n o,2021,15(1):1167-1178.[21]F O Z O U N I P,S O N S,DÍA Z D E L E N D E R B Y M,e t a l.A m p l i f i c a t i o n-f r e e d e t e c t i o n o f S A R S-C o V-2w i t hC R I S P R-C a s13a a n d m o b i l e p h o n e m i c r o s c o p y[J].C e l l, 2021,184(2):323-333.(下转第717页)㊃196㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n,M a r c h2024,V o l.21,N o.5e t a l.T h e p r e d i c t i v e v a l u e of t h r o m b o e l a s t og r a m i n th e e-v a l u a ti o n o f p a t i e n t s w i t h s u s p e c t e d a c u t e v e n o u s t h r o m-b o e m b o l i s m[J].Ac t a H a e m a t o l,2020,143(3):272-278.[8]B R OWN W,L U N A T I M,MA C E R O L I M,e t a l.A b i l i t y o f T h r o m b o e l a s t o g r a p h y t o d e t e c t h y p e r c o a g u l a b i l i t y:a s y s t e m a t i c r e v i e w a n d m e t a-a n a l y s i s[J].J O r t h o p T r a u-m a,2020,34(6):278-286.[9]V A N HA R E N R M,T HO R S O N C M,V A L L E E J,e ta l.H y p e r c o a g u l ab i l i t y a f t e r b u r n i n j u r y[J].J T r a u m a A-c u t e C a r e S u r g,2013,75(1):37-43.[10]L L O Y D-D O N A L D P,V A S U D E V A N A,A N G U S P,e t a l.C o a g u l a t i o n i n a c u t e l y i l l p a t i e n t s w i t h s e v e r e c h r o n i c l i v-e r d i s e a s e:i n s i g h t sf r o m t h r o m b o e l a s t og r a ph y[J].J C ri tC a r e,2017,38:215-224.[11]F A N D,O U Y A N G Z,Y I N G Y,e t a l.T h r o m b o e l a s t o g r a-p h y f o r t h e p r e v e n t i o n o f p e r i o p e r a t i v e v e n o u s t h r o m b o-e m b o l i s m i n o r t h o p e d i c s[J].C l i n A p p l T h r o m b H e m o s t, 2022,28:10760296221077975.[12]R Y A N M L,V A N HA R E N R M,T HO R S O N C M,e ta l.T r a u m a i n d u c e d h y p e r c o a g u l ab l i t y i n p e d i a t r ic p a t i e n t s[J].J P e d i a t r S u r g,2014,49(8):1295-1299. [13]S C H E R E R A G,WH I T E I K,S HA I K H K A,e t a l.R i s ko f d e e p v e n o u s t h r o m b o s i s i n e l e c t i v e n e u r o s u r g i c a l p r o-c e d u r e s:a p r o s p e c t i v e,d o p p l e r u l t r a s o u n d-b a s e d s t u d y i n c h i l d r e n12y e a r s o f a g e o r y o u n g e r[J].J N e u r o s u r g P e d i-a t r,2017,20(1):71-76.[14]HA R A H S H E H Y,D U F F O C,HO K M.T h r o m b o e l a s-t o g r a p h y p r e d i c t s t h r o m b o e m b o l i s m i n c r i t i c a l l y i l l c o a g-u l o p a t h i c p a t i e n t s[J].C r i t C a r e M e d,2019,47(6):826-832.[15]M E I Z O S O J P,K A R C U T S K I E C A,R A Y J J,e t a l.As i m p l i f i e d s t r a t i f i c a t i o n s y s t e m f o r v e n o u s t h r o m b o e m b o-l i s m r i s k i n s e v e r e l y i n j u r e d t r a u m a p a t i e n t s[J].J S u r g R e s,2017:138-144.[16]R I Z Z A A,R I C C I Z,P E Z Z E L L A C,e t a l.K a o l i n-a c t i v a t e d t h r o m b o e l a s t o g r a p h y a n d s t a n d a r d c o a g u l a t i o n a s s a y s i n c y a n o t i c a n d a c y a n o t i c i n f a n t s u n d e r g o i n g c o m p l e x c a r d i a c s u r g e r y:a p r o s p e c t i v e c o h o r t s t u d y[J].P a e d i a t r A n a e s t h, 2017,27(2):170-180.[17]HAWK I N S R B,R A YMO N D S L,HA R T J E S T,e t a l.R e v i e w:t h e p e r i o p e r a t i v e u s e o f t h r o m b o e l a s t o g r a p h y f o r l i v e r t r a n s p l a n t p a t i e n t s[J].T r a n s p l a n t P r o c,2018,50(10):3552-3558.[18]杨涛.儿童骨折流行病学调查[D].重庆:重庆医科大学, 2018.[19]M I R A B E L L A L,C O T O I A A,C O L A C I C C O G,e t a l.R e f e r-e n c e v a l u e sf o r c o ag u l a t i o n a s s e s s m e n t i n f u l l-t e r m n e w-b o r n s[J].M i n e r v a A n e s t e s i o l,2017,83(4):369-374.[20]S C HO T T N J,E M E R Y S P,G A R B E E C,e t a l.T h r o m-b o e l a s t o g r a p h y i n t e r m n e o n a t e s[J].J M a t e r n F e t a l N e o-n a t a l M e d,2018,31(19):2599-2604.(收稿日期:2023-09-11修回日期:2023-12-22)(上接第691页)[22]G O O T E N B E R G J S,A B U D A Y Y E H O O,K E L L N E R M J,e t a l.M u l t i p l e x e d a n d p o r t a b l e n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n p l a t f o r m w i t h C a s13,C a s12a,a n d C s m6[J].S c i e n c e, 2018,360(6387):439-444.[23]HA N J,S H I N J,L E E E S,e t a l.C a s12a/b l o c k e r D N A-b a s e d m u l t i p l e x n uc l e i c a c id de t e c t i o n s y s t e mf o r d i ag n o-s i s o fhi g h-r i s k h u m a n p a p i l l o m a v i r u s i n f e c t i o n[J].B i o-s e n s B i o e l e c t r o n,2023,232:115323.[24]A C K E R MA N C M,MY H R V O L D C,T HA K K U S G,e ta l.M a s s i v e l y m u l t i p l e x e d n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n w i t hC a s13[J].N a t u r e,2020,582(7811):277-282.[25]Z HO U B,X U K,Z H E N G X,e t a l.A p p l i c a t i o n o f e x o-s o m e s a s l i q u i d b i o p s y i n c l i n i c a l d i a g n o s i s[J].S i g n a l T r a n s d u c t T a r g e t T h e r,2020,3;5(1):144.[26]D U A N M L,L I B Y,Z HA O Y J,e t a l.A C R I S P R/C a s12a-m e d i a t e d,D N A e x t r a c t i o n a n d a m p l i f i c a t i o n-f r e e,h i g h l y d i r e c t a n d r a p i d b i o s e n s o r f o r S a l m o n e l l a T y p h i-m u r i u m[J].B i o s e n s B i o e l e c t r o n,2023,219:114823. [27]S H E N J J,Z HO U X M,S HA N A A,e t a l.S e n s i t i v e d e-t e c t i o n o f a b a c t e r i a l p a t h o g e n u s i n g a l l o s t e r i c p r o b e-i n i t i-a t e d c a t a l y s i s a n d C R I S P R-C a s13a a m p l i f i c a t i o n r e a c t i o n[J].N a t C o mm u n,2020,11(1):267.[28]A B N O U S K,D A N E S H N M,R AM E Z A N I M,e t a l.An o v e l c o l o r i m e t r i c a p t a s e n s o r f o r u l t r a s e n s i t i v e d e t e c t i o n o f a f l a t o x i n M1b a s e d o n t h e c o m b i n a t i o n o f C R I S P R-C a s12a,r o l l i n g c i r c l e a m p l i f i c a t i o n a n d c a t a l y t i c a c t i v i t yo f G o l d n a n o p a r t i c l e s[J].A n a l C h i m A c t a,2021,1165: 338549.[29]L I U N,L I U R,Z HA N G J J.C R I S P R-C a s12a-m e d i a t e dl a b e l-f r e e e l e c t r o c h e m i c a l a p t a m e r-b a s e d s e n s o r f o r S A R S-C o V-2a n t i g e n d e t e c t i o n[J].B i o e l e c t r o c h e m i s t r y, 2022,146:108105.[30]B A R B E R K W,S H R O C K E,E L L E D G E S J.C R I S P R-b a s e d p e p t i d e l i b r a r y d i s p l a y a n d p r o g r a mm a b l e m ic r o a r-r a y s e l f-a s s e m b l y f o r r a p i d q u a n t i t a t i v e p r o t e i n b i n d i n ga s s a y s[J].M o l C e l l,2021,81(17):3650-3658..(收稿日期:2023-08-16修回日期:2023-11-08)㊃717㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n,M a r c h2024,V o l.21,N o.5。

临床分子诊断实验室的风险点与风险评估

临床分子诊断实验室的风险点与风险评估近年来，风险管理的理念在医学实验室管理中日益受到广泛重视。

风险管理指如何在一个肯定有风险的环境里把风险减至最低的管理过程。

风险管理方法是基于对风险的认识、衡量和分析，选择最有效的方式，主动地、有目的、有计划地处理风险，以最小成本争取获得最大安全保证的管理方法。

对于医学实验室的风险管理，指当检验结果影响患者安全时，实验室应评估工作过程和可能存在的问题对检验结果的影响，应修改过程以降低或消除识别出的风险，并将做出的决定和采取的措施文件化。

实验室风险评估包括实验室风险估计和风险评价两个过程。

风险估计是将危害发生概率与严重程度赋值的过程，接下来进行风险评价，估计风险与给定标准的比较，确定风险的可接受性。

总结起来，即判断实验室有哪些风险点，然后判断风险点发生的概率与它的严重程度，进而评价可接受性。

其目的是与实验室预定风险进行比较，把风险设定在可接受或可控的范围。

在临床实践中有学者认为实验室风险评估仅仅是生物安全管理，实际上实验室风险管理是基于实验室生物安全，加入检测项目风险和设备医疗安全等，最大程度保证检测人员和病人的安全。

实验室风险管理相关规范、标准有风险管理原则及指南IS027001和IS031000。

关于生产商风险管理的标准有医疗设备风险管理IS014971、识别和控制实验室误差来源的风险管理技术（FMEA、FTA x FRACAS）、CLSIEP18和CLSlEP23o基于风险管理的实验室质量控制规范可以学习ISO22367o 医学实验室可通过风险管理和持续改进减少错误，本文以分子实验室为例，介绍了实验室风险管理的实施过程。

1、标本采集的风险评估临床实验室的风险评估涉及检验前、中、后的风险评估。

1.标本采集运输保存：(1)检验前。

方法选择和标本类型关乎结果，对于新冠核酸检测可以做普通的荧光定量PCR、测序或等温扩增。

标本采集、运送和保存是质量保证的关键性环节，在采集点是否需要放置冰箱、在常温放置多久等问题都直接关系到检验质量，可通过验证放置时间、提取效率是否降低来保证质量。

分子诊断应用说明

5.3.2.1 实验室应建立试剂和关键耗材（如离心管、带滤芯的吸头）的验收程序，相应程序中应有明确的判断符合性的方法和质量标准（宜参考附录A）。 5.3.2.3 实验室应对新批号或同一批号不同货运号的试剂和关键耗材进行验收，验收试验至少应包括：（a）外观检查：肉眼可看出的，如包装完整性、有效期等；（b）性能验证：通过实验才能判断的，如试剂的核酸提取效率和核酸扩增效率、试剂的批间差异、关键耗材的抑制物等。试剂性能验证记录应能反映该批试剂的核酸提取效率和核酸扩增效率。一般情况下，临床实验室在新批号试剂或关键耗材使用前，应验证试剂批间差异和耗材的抑制物，符合附录A.6要求即可视为满足要求。特殊情况下，如实验室怀疑提取试剂有质量问题，可采用凝胶电泳试验比较核酸提取物与核酸标准物确认核酸片段提取的完整性、260nm紫外波长测定确认核酸提取的产率、260nm/280nm比值确认核酸提取的纯度。用于定性检验的试剂，选择阴性和弱阳性的样品进行试剂批号验证。用于定量检验的试剂，应进行新旧试剂批间的差异验证，方法和要求参照附录A.6要求。耗材的抑制物验收：对关键耗材应检测是否存在核酸扩增的抑制物，方法和要求参照附录A.6要求。
5.7 检验后过程 5.7.2 原始样品、核酸提取物和/或核酸扩增产物应规定保存期，便于复查。为便于追溯，凝胶图像和斑点杂交条带和/或通过扫描、拍照等方式保留的结果应作为技术记录保存，保存期限参照相关行业要求。 5.8 结果报告 5.8.3 除了通用要求外，适用时，分子诊断报告内容还应包括方法的局限性、进一步检测的建议、相关咨询人员姓名及联系方式。 5.9 结果发布 5.10 实验室信息管理
5.4 检验前过程
5.4.4.3 应规定分子诊断样品留取的具体要求，如：（a）使用无DNase和/或无RNase的一次性密闭容器；（b）正确使用抗凝管：通常全血和骨髓样品应进行抗凝处理，EDTA和枸橼酸盐为首选抗凝剂，不使用肝素抗凝（核酸提取采用吸附法而不受肝素干扰时除外）；（c）用于RNA（如HCV RNA）扩增检测的血样品宜进行抗凝处理，并尽快分离血浆，以避免RNA的降解；如未作抗凝处理，则宜尽快分离血清。（d）分泌物、拭子、肿瘤组织等样品留取的注意事项等。 5.4.6 e) 基于组织/细胞学形态基础的分子检测项目应由具有病理诊断资质的医师确认样品是否满足检测要求。 5.4.7样品应尽快处置并以适当方式储存，以尽可能减少核酸降解。超长期储存后的标本，使用前应再次评估标本的完整性。检测样品若为组织，应采用10%中性缓冲的福尔马林固定，固定液的量和固定时间应符合检测要求。

分子诊断项目标本采集、运输与保存程序

分子诊断项目标本采集、运输与保存程序1 目的临床分子诊断中多采用血液为标本，次为病理组织，少数是其他体液（如唾液、脑脊液、胸腹水、羊水等）。

标本的成分含量可因标本采集和处理不当等因素的影响而发生变化，从而影响测定结果的准确性，因此，在取标本时要考虑到并设法消除这些因素的影响。

本程序旨在规范临床分子诊断中心进行分子诊断项目标本采集及运输与保存过程，保证临床分子诊断中心检测标本的质量，确保检测结果的准确。

2 适用范围临床分子诊断中心所有进行分子检测的标本。

3 职责3.1 临床分子诊断中心负责人根据项目检测种类需要编写各类标本采集及运输、保存程序，经科主任批准后执行。

3.2 临床分子诊断中心质量监督员负责样品采集与运输、保存过程中各个环节的人员培训及宣教，并进行监督。

4 样品种类4.1 实体瘤标本4.1.1 石蜡标本为了保证石蜡标本中基因组 DNA、RAN 提取的成功率和正常的检测周期，请按照如下要求准备送检标本：a. 切片厚度 4~10μm，切片数量取决于肿瘤组织横切面的大小。

例如：对于成人拇指盖大小面积，8~10 张切片即可满足 DNA 提取需要；如果肿瘤组织切片的面积较小，请按比例增加切片的数量。

b. 为保证切片组织中含有足够比例的肿瘤细胞，需请病理科医生事先对该切面的肿瘤组织进行 HE 染色，确保所切层面中肿瘤组织占 40%以上、且坏死组织所占比例不高于10%。

3. 切片结束后，不必进行铺片和贴片处理，直接用干净的镊子将组织切片转移至干净的 1.5 ml 离心管中。

4. 请尽可能在送检时请提供两管待测标本，其中一管用于检测，另一管作为备用材料。

5. 标本常温保存、运输。

6. 为保证石蜡标本 DNA 提取的成功率，请尽可能送检 2~3 年以内的石蜡标本。

4.1.2 新鲜组织标本为了保证新鲜组织标本中基因组 DNA、RNA 提取的成功率和正常的检测周期，请按照如下要求准备送检标本：a. 要求新鲜肿瘤组织标本≥100mg，未坏死肿瘤组织比例在 70%以上。

分子诊断试剂质控标准物质制备

分子诊断试剂质控标准物质制备-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述部分旨在介绍分子诊断试剂质控标准物质制备这一主题的背景和重要性。

分子诊断试剂质控标准物质是进行分子诊断测试时非常关键的一环，它们被用作质量控制的参照物质，能够评估各种分子诊断试剂的准确性和可靠性。

分子诊断试剂质控标准物质的制备是确保诊断结果的准确性和可比性的重要步骤。

分子诊断试剂质控标准物质制备的核心目标是研发和制备一系列具有已知特性和浓度的参照物质，在分子诊断试剂的开发、质量控制和临床应用等领域中发挥作用。

这些标准物质可以包括特定基因、蛋白质、病毒、菌种等，通过准确测量其浓度和特性，可以为分子诊断试剂的准确性和可靠性提供有效保证。

分子诊断试剂质控标准物质的制备需要符合一定的规范和严格的过程控制，确保其稳定性、可重复性和可比性。

对于不同类型的试剂，制备方法和步骤也会有所差异，但总的原则是确保制备出的标准物质与临床样本具有相似的特性和浓度。

文章的剩余部分将对分子诊断试剂质控标准物质制备的重要性、背景、方法与步骤以及质量控制与验证进行详细探讨。

这将有助于读者全面了解分子诊断试剂质控标准物质的制备过程，以及它们在分子诊断领域的重要作用。

最后，我们将对分子诊断试剂质控标准物质制备的意义进行总结，并展望未来在这一领域的发展前景。

通过这篇文章的阅读，读者将能够深入了解分子诊断试剂质控标准物质制备的关键要点和研究进展，为临床分子诊断的发展与应用提供有益的参考和指导。

1.2 文章结构本文主要介绍了分子诊断试剂质控标准物质制备的相关内容。

文章分为引言、正文和结论三个部分。

在引言部分，我们首先概述了分子诊断试剂质控标准物质制备的背景和重要性。

通过介绍其在分子诊断领域中的作用和意义，让读者对本文的内容有一个初步的了解。

随后，我们给出了本文的目的，明确了我们撰写文章的目标和意图。

接下来，正文部分详细介绍了分子诊断试剂质控标准物质的重要性和制备的背景。

分子诊断发展简史

分子诊断发展简史：一场由“螺旋双杰”引发的发明分子诊断发展四阶段第一阶段：利用分子杂交技术进行遗传病基因诊断：通过婴儿胚胎期进行产前诊断，超早期预知某些疾病发生、发展和预后。

1978年著名没计划以科学家简悦威等应用液相DNA 分子杂交成功进行了镰形细胞贫血症的基因诊断。

第二阶段：以PCR为基础的分子诊断：PMullis发明PCR技术后迅速发展，标志着传统基因诊断发展到更全面的分子诊断技术。

第三阶段：以生物芯片技术为代表的高通量检测技术：1992年美国Affymetrix制作出第一章基因芯片，标志着分子诊断进入生物芯片技术阶段。

生物芯片技术解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量的问题。

第四阶段：以NIPT为代表的第二代测序技术：Ronaghi分别于1996年与1998年提出了在固相与液相载体中通过边合成边测序的方法-焦磷酸测序。

目前常见的高通量第二代测序平台主要有Roche454、IlluminaSolexa、ABISOLiD和LifeIon Torrent等，其均为通过DNA 片段化构建DNA文库、文库与载体交联进行扩增、在载体面上进行边合成边测序反应，使得第1代测序中最高基于96孔板的平行通量扩大至载体上百万级的平行反应，完成对海量数据的高通量检测。

1代、2代测序区别分子诊断三座丰碑1953年，沃森和克里克发现了DNA双螺旋的结构，开启了分子生物学时代，使遗传的研究深入到分子层次，“生命之谜”被打开，人们清楚地了解遗传信息的构成和传递的途径。

在以后的近50年里，分子遗传学、分子免疫学、细胞生物学等新学科如雨后春笋般出现，一个又一个生命的奥秘从分子角度得到了更清晰的阐明。

DNA双螺旋结构的出现时分子生物学行程的重要标志，对人们认识蛋白质合成、DNA复制和突变具有重要意义，为分子诊断的蓬勃发展奠定基础。

“DNA之父”Wa tson、Crick50年前，科学界的“八大恶棍”之一凯利•穆利斯还只是美国某制药公司的小职员，整天做着把先天致病基因给剔除掉的白日梦，然而先要复制DNA，才有足够的时间慢慢修复。

《分子诊断学》课程教改略述

［稿Ｅ期］２１－２２收ｔ００．１１［金项目］蚌埠医学院校级教研课题资助基
网上学习分子生物学知识。二是更新和修订教学大纲。根据医学检验专业学生的知识结构和专业特点，我们对教学大纲进行了修订：减少分子生物学
病的易感性以及疾病的分期分型、疗效监测、预后
培养方案，借鉴兄弟院校经验。２００６年，把诊断分
子生物学课程名称正式改为分子诊断，学时数进行
调整，增加实验课学时数，作为医学检验专业必修课。分子诊断学教学中存在两个实际问题：一是在
理论部分学时数，基因组结构，要求学生 ห้องสมุดไป่ตู้解，如仅
掌握的内容主要是基本概念；授课重点针对临床常
用的分子诊断技术（ｒＰＲ、荧光定量ＰＲ、核酸￣Ｃｔ３Ｃ分子杂交等）、以临床常见感染性疾病（乙型肝炎如病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒等）及遗
四加强师资队伍建设由于分子诊断不仅涉及分子生物学基本理论和技术还需要有一定的临床疾病诊断的知识储因此在分子诊断师资队伍的选择和培养方面我们综合考虑了教师的知识背景选派具有医学背景的青年教师外出参加分子生物学技术和分子诊断培训班及研讨会即提升分子生物学基本技能也提高其临床诊断分析能力
课堂教学
杨清玲，陈昌杰，武文娟，等：《子诊断学》课程教改略述分
求学生把生物化学遗传信息传递复习，另外我们建

分子病理学在诊断学中的应用与研究

Asian Case Reports in Vascular Medicine 亚洲心脑血管病例研究, 2019, 7(1), 8-15Published Online February 2019 in Hans. /journal/acrvmhttps:///10.12677/acrvm.2019.71002Research and Application of MolecularPathology in DiagnosticsJiandong Han, Hongkang Wang, Jianmin Wang, Jiaxuan Dong, Jie Zhang, Hao Zhou,Ting Yang, Eerdun*Inner Mongolia Medical University, Hohhot Inner MongoliaReceived: Feb. 23rd, 2019; accepted: Mar. 13th, 2019; published: Mar. 20th, 2019AbstractAdvances in molecular biology technology have provided new ideas for molecular diagnosis. Com-pared with traditional culture and phenotypic identification, molecular diagnostic technology has greatly shortened the time required for diagnosis, while improving sensitivity and specificity, and is easy to operate and easy to repeat. Molecular diagnostic methods mostly perform molecular identification of pathogenic fungi on the basis of culture. It is also reported that some molecular biology techniques can directly detect pathogens from liquid culture bottles and even clinical samples. With the continuous development of molecular biology theory and technology, molecular diagnostic techniques based on nucleic acids and proteins have begun to be gradually applied in clinical practice. The diagnostic techniques at the molecular level require short time, high speci-ficity and sensitivity, and overcome to some extent. The defects of traditional diagnostic methods can achieve early and specific diagnosis of pathogenic bacteria, improve patient prognosis and improve patient survival rate. The nucleic acid isothermal amplification technology can complete the amplification of DNA or RNA at a certain temperature. Compared with the traditional PCR me-thod, the nucleic acid isothermal amplification technology greatly simplifies the requirements of the instrument, and the constant temperature water bath can complete the reaction, and the time is also greatly shortened; it can meet the needs of simple and fast diagnosis. Loop-mediated iso-thermal amplification techniques design two pairs of primers for six independent fragments of the gene sequence to achieve specific amplification of the nucleic acid fragments.KeywordsPathology, Diagnosis, Cancer分子病理学在诊断学中的应用与研究韩建冬，王红康，王建民，董佳轩，张杰，周浩，杨庭，额尔敦*内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特*通讯作者。

质谱技术在肿瘤分子诊断中的应用进展

分子诊断学是将分子生物学技术应用于诊断、预后和（或）治疗的一门学科。从分子层面上说，肿瘤是一种异质性疾病，肿瘤和个体间存在包括ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白和代谢物等分子的差异。通过对上述分
子进行检测，将肿瘤相关信号通路进行综合整理，可以提高我们对肿瘤及其异质性的认识，针对相应靶点进行新药的研发、寻找分子标志物用于疾病的诊断、预后评估和疗效预测具有重大意义；根据治疗靶
ＤＯＩ：１０．１１７４８／ｂｊｍｙ．ｉｓｓｎ．１００６－１７０３．２０１９．０６．０４２收稿日期：２０１８１２２３；修回日期：２０１９０１２３基金项目：国家重大新药创制科技重大专项（编号：２０１８ＺＸ０９２０１００３）；中国医学科学院医学与健康科技创新工程（编号：
２０１７Ｉ２Ｍ１０１０）通讯作者：韩晓红，博士生导师，主要从事肿瘤分子标志物方面研究。Ｅｍａｉｌ：ｈａｎｘｈ＠ｃｉｃａｍｓ．ａｃ．ｃｎ
标记免疫分析与临床２０１９年６月第２６定治疗获益的人群，这是实现肿瘤个体化医疗的关键所在。质谱技术在此方面逐渐显示出其强大的检测优势。早年质谱技术主要用于同位素测定和无机元素分析［１］，直到２０世纪８０年代末诞生了新的电离技术，如基质辅助激光解吸离子化技术和电喷雾离子化技术［２］这两项“软电离”技术，质谱技术才逐渐进入生物大分子领域，成为检测和鉴定生物大分子如多肽、蛋白质、核酸等的有力手段［３］。质谱技术常与其他分析方法联用，如色谱仪、电泳等，这使质谱的应用范围进一步扩大。目前在生物医药行业常见的质谱类型主要有液相色谱串联质谱，主要用于小分子物质的定量分析［４６］；气相色谱串联质谱，用于挥发性化合物检测［７］；飞行时间／轨道离子肼分析器，用于多肽、蛋白和未知物检测；基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（ｍａｔｒｉｘａｓｓｉｓｔｅｄｌａｓｅｒｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｔｉｍｅｏｆｆｌｉｇｈｔｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ）用于多肽、蛋白、微生物鉴定等［８１０］；电感耦合等离子体质谱［１１１２］主要用于元素分析。因此，质谱作为一种功能强大的综合性技术在分子诊断学研究中发挥着重要的作用。１蛋白质质谱仪是蛋白质生物标志物检测和鉴定的首选方法，它不仅能够定性和定量地检测生物标本中蛋白质多肽，还能发现蛋白质的结合位点和蛋白翻译后修饰情况，包括磷酸化［１３１４］、乙酰化［１５］、甲基化［１６］、Ｎ末端乙酰化［１７］、泛素化［１８］、糖基化［１９］和蛋白水解［２０］等，有助于更全面地了解疾病或治疗使机体发生变化的过程。ＷＡＮＧ等首［２１］先用一级质谱比较健康人与肿瘤晚期患者血浆中酶解后肽段，鉴定出６４１个肽段为候选差异标志物，然后将二维色谱与选择反应监测（ＳＲＭ）模式的二级质谱联用进行评估，最终发现来自肽酰胺基脯氨酰基顺反异构酶（ＰＰＩＡ）的两个肽链ＶＳＦＥＬＦＡＤＫ（２０／３５）和ＦＥＤＥＮＦＩＬＫ（１４／３５）在卵巢癌患者中丰度较高，而健康人血浆中没有表达（０／１４），因此得出这２个肽链可能是与卵巢癌诊断相关的特异性标志物。ＲＥＰＥＴＴＯ等［２２］根据肿瘤退缩分级（ＴＲＧ）将１５例直肠癌患者分为３组：对新辅助化疗反应好的ＴＲＧ１２、反应中等的ＴＲＧ３及反应差的ＴＲＧ４，提取这３组患者在接受新辅助化疗前肿瘤组织中的蛋白，通过２Ｄ胶图像软件分析发现有四个点在ＴＲＧ３和ＴＲＧ４