山羊褪黑激素受体1A基因HinfⅠ酶切多态性及其与产羔数性状的关联分析_本科毕业论文

本科毕业论文题目：山羊褪黑激素受体1A基因Hin fⅠ酶切多态性及其与产羔数性状的关联分析姓名：学号专业：动物科学指导教师：职称分类号密级华中农业大学本科毕业论文山羊褪黑激素受体1A基因Hin fⅠ酶切多态性及其与产羔数性状的关联分析Hin fⅠ-RFLP of Melatonin receptor 1 A(MTNR1A) gene and the association with the litter size traits in goat目录摘要 (4)ABSTRACT (5)前言 (6)1.材料与方法 (7)1.1材料 (7)1.1.1 试验动物 (7)1.1.2 实验材料 (7)1.1.3主要试剂的来源 (7)1.1.4主要仪器设备 (8)1.1.5主要试剂的配置 (8)1.1.6主要分子生物学软件................................ 错误！未定义书签。

1.2方法 (9)1.2.1.山羊基因组DNA的提取 (9)1.2.2.引物设计及其序列 (10)1.2.3.PCR扩增及其电泳检测 (10)1.2.4. 限制性内切酶消化扩增产物以及电泳检测 (12)1.2.5.统计分析 (13)2 结果与分析 (13)2.1PCR扩增结果 (13)2.2酶切结果 (14)2.3褪黑激素基因频率和基因型频率分析结果 (15)2.4MTNR1A基因型与波尔山羊头胎产羔数性状的关联分析 (15)2.5MTNR1A基因型与经产产羔数性状的关联分析 (16)3 讨论 (16)3．1不同山羊品种基因型频率及基因频率差异 (16)3．2MTNR1A不同基因型对波尔山羊头胎和经产羔数的影响 (17)参考文献 (17)致谢 (18)山羊褪黑激素受体1A基因Hin fⅠ酶切多态性及其与产羔数性状的关联分析摘要本研究以褪黑激素受体1A 基因为候选基因，分析该基因多态性对山羊产羔数性状的影响。

采用限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length polymorphism，PCR-RFLP）方法，检测了65只波尔山羊和51马头山羊褪黑激素受体1A基因Hin fⅠ酶切多态性及其与产羔数性状的关联分析。

结果表明，褪黑激素受体1A基因在波尔山羊中存在Hin fⅠ酶切多态性，而在马头山羊样本中则无多态性。

在波尔山羊中，检测到AA、GG两种基因型，未检测到AG型；其中AA基因型个体在出现频率最高，为0.554，GG型为0.446；A、G等位基因频率分别为0.554和0.446。

性状关联分析结果表明：波尔山羊的AA基因纯合型头胎平均产羔数比GG基因杂合型多0.07只，加性效应值为0.035，显性效应值为-1.42；经产羔数的AA型比GG型多0.09只；加性效应值为0.046，显性效应值为-1.84。

A等位基因可能与波尔山羊产羔数呈正相关，该位点主要以加性方式起作用。

关键词：山羊；繁殖性状；褪黑激素受体；PCR—RFLPHin fⅠ-RFLP of Melatonin receptor 1 A（MTNR1A）gene and the association with the litter size traits in goatAbstractIn the present study，Melatonin receptor 1 A gene （MTNR1A）was analysed to find the assocation with litter size in goat as a candidate gene. Hin fⅠ-RFLP （Restriction Fragment Length polymorphism，RFLP）of MTNR1A was found in 65 Boer goats and 51 goats Ma Tou. No polymorphism was detected in Ma Tau goats . Two genotypes AA，GG were found in Boer goats. The frequency of AA genotype was higher than GG genotype，which were 0.554 and 0.446，respectively. The allele frequencies for A and G were 0.554 and 0.446. The results of traits association analysis showed that individuals with AA genotype had additional 0.07 average litter size at first kidding in Boer Goat. The additive effect value was 0.035，while the dominant effects value -1.42. Moreover，AA genotype had additional 0.09 average litter size for multiparity，the additive and dominant effects value were 0.046 and -1.84，respectively. Allele A was possiblely positively correlated with litter size in Boer goats. The additive effect was dominant at the site.Key words: Goat；Reproductive traits；MTNR1A；PCR-RFLP前言褪黑激素主要是由松果体合成的，其它合成部位还有:视网膜、眼眶腔的副泪腺、唾液腺、肠的嗜铬细胞及红细胞，松果体把对外界光照形成的神经信息经下丘脑视交叉上核转变成体液信息—MEL。

1.褪黑激素生理功能、作用机制；褪黑激素对生殖系统作用的机理主要是通过光作用于视网膜，然后通过视网膜- 下视丘至视交叉上核，再经过一系列复杂的神经交换至颈上神经节，其节后交感神经作用于松果体。

松果体分泌褪黑激素，通过下丘脑—垂体性腺轴影响生殖系统。

褪黑激素对生殖系统的作用因动物种类、生理状态不同而表现出抑制、促进或无作用的多重性（焦传珍，2005）。

多项研究结果表明，褪黑激素虽然对牛、鼠类、禽等动物和人的生殖系统的发育有抑制作用，但是对绵羊、山羊、鹿等动物则明显表现出促进作用。

2．褪黑激素受体类型、作用机制；褪黑激素受体属于G蛋白耦联受体家族。

根据其分子生物学方法又可分为MTNR1A、MTNR1B、M TNR1C三种亚型（张凯等，2006）。

目前在哺乳动物中还没有发现MTNR1C受体，而具有明显季节性繁殖特征的动物仅在垂体结节部发现MTNR1A受体，提示垂体结节部可能是褪黑激素繁殖效应的作用位点。

3．褪黑激素受体分子标记在其它动物中的研究进展目前国内外对绵羊M TNR1A基因已经有所研究已经很多了。

Messer等（1997）和Notter等（2003）用M n lⅠ和R saⅠ酶分别对白面杂种羊、萨福克羊、特克塞尔羊、柯泊华斯羊和合成系绵羊群体M TNR1A 基因外显子2 的824 bp 扩增产物进行消化，发现M n lⅠ在5 个绵羊群体中都存在286 bp和236 bp 多态片段， R saⅠ都存在295 bp 和290 bp 多态片段。

Pelletier等（2000）用M n lⅠ限制性内切酶消化2组发情行为有明显差异（常年发情和季节性发情）的Merinos d′Arles母绵羊以及季节性发情明显的Ile2de2France 母绵羊M TNR1A 基因外显子2的824 bp扩增产物，发现存在303 bp和236 bp 多态片段。

季从亮等（2003）和Chu等（2003）用M n lⅠ和R saⅠ对常年发情的小尾寒羊和湖羊以及季节性发情的多赛特羊和萨福克羊共146只绵羊M TNR1A基因外显子2的824 bp 扩增产物进行PCR-RFLP多态性分析，发现M n lⅠ在4个绵羊品种中都存在303 bp和236 bp多态片段， R saⅠ都存在290 bp和267 bp 多态片段。

在绵羊中的研究结果表明，该基因对绵羊繁殖性能存在影响。

但是，对于山羊，只有对产绒或营养调控的研究，目前尚未发现有对山羊繁殖性能影响的相关报道。

4．本实验目的意义本实验室滑国华等（2006）在山羊MTNR1A中共发现7个SNPs，对其中4个SNPs分析结果显示：MTNR1A不同基因型对山羊产羔数性状有一定的影响。

为进一步研究该基因对山羊产羔数性状的影响，本试验选取G493A突变位点，采用引入酶切位点方法，即限制性片段长度多态性Forced PCR-RFLP（Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphsim），分析该位点在马头山羊和波尔山羊中的分布情况，并分析该位点对波尔山羊产羔数影响，为山羊标记辅助选择提供理论依据。

1.材料与方法1.1 材料1.1.1 试验动物马头山羊51头，采自湖北省十堰市；波尔山羊65头，采自湖北省宜都市波尔山羊种羊场。

颈静脉采血10ml/只，EDTA抗凝，-20℃保存。

1.1.2 实验材料1.5ml Eppendorf管、双面板、微量移液枪（1000μl、200μl、40μl、10μl、2.5μl）及枪头、一次性PE塑料手套。

1.1.3主要试剂的来源TagDNA聚合酶购自上海生工生物工程技术有限公司；DNA限制性内切酶Hin fⅠ购自晶美生物工程有限公司；分子量标准100bp DNA Ladder和PBR322DNA/Msp I购自上海生工生物工程技术有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、苯酚、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠（SDS）、甲酰胺、丙烯酰胺（Acrylamide，Acr）、N－N’－亚甲基丙烯酰胺（Bisacrylamide）、琼脂糖、溴化乙锭（EB）、琼脂糖、乙二胺乙二酸二钠盐（EDTANa2）等均购自武汉凌飞科技有限公司。

1.1.4主要仪器设备表1 主要仪器设备Table 1 Laboratory equipment and instruments仪器设备名称型号生产厂家电热恒温水浴锅GD120 英国Grant公司台式离心机TGL-16G 上海安亭科学仪器厂梯度PCR仪T1 Thermo cyler德国Biometra公司冷冻离心机Centrfuge 5810 德国eppendorf公司恒温摇床HS80 中国科学院武汉科学仪器厂自动双重纯水蒸馏器SZ-93 上海亚荣生化仪器厂紫外分析仪UV-IV 北京市新科技应用研究所电泳槽DYY-III 北京六一仪器厂稳压稳流电泳议DYY-2 北京六一仪器厂手提式高压灭菌锅YXQ-SG46-280A 上海博讯实业有限公司医疗设备厂超纯水仪WaterPro 美国LABCONCO公司移液器1ml；200μl；40μl；10μl；2.5μl芬兰Labsystems公司1.1.5主要试剂的配置1.1.5.1用于血液样品采集的溶液的配制1)1M Tris.cl储备液：称取121.4g Tris碱溶于800ml双蒸水中，加浓盐酸调至pH=8.0，定容到1000ml。