荧光分析法基本概念
荧光分析法实验版
后期作图 1.打开origin软件→ →x.txt→找到已保存的文件（两个通 道）→Add→OK 点击 → →Add→ →Add→OK。 出现光谱图 2.双击X AXTS TITLE，出现对话框，改为x/nm,双击y Ax改为 y/F.点击 图标，移动鼠标到峰点，再点T图标，再点左键 ，输入数值297nm 重复再输入另一峰值 重复输入excitation emission 即成 3.再点击File(电脑左上方) →（save project）点击，输入文件 名，点保存。 4．最后点击→Edit(在File后)，点击copy page,即可复制在 word文档。 这件完整的图形即可在用U盘拷贝了。
O C COO
荧光物质（荧光素）
菲荧光物质（酚酞）
取代基团
温度 溶剂 pH值
荧光熄灭 由于荧光物质分子间或与其它物质相互作用，引起荧光强度显著下降的 现象叫做荧光熄灭（quenching ）或猝灭。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭 剂，如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物和羧基化
光强度F（即激发光波长扫描）。然后以激发
光波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，
就可得到该荧光物质的激发光谱。
激发光谱上荧光强度最大值所对应的波长
就是最大激发波长，是激发荧光最灵敏的波长。 物质的激发光谱与它的吸收光谱相似，所不同 的是纵坐标。
2. 荧光光谱 荧光光谱，又称发射光谱。保持激发光波
由光源发出的光，通过激发单色器后变成单色光，而后照
在荧光池中的被测样品上，由此激发出的荧光被发射单色器收
集后。经单色器分散成单色光而照射在光电倍增管上转换成相
应的电信号，经放大器放大反馈入A/D转换单元，将模拟电信 号转换成相应的数字量。并通过显示器或打印机显示记录下被 测样品的图谱。这就是荧光光度计的基本工作原理。
荧光分析法的基本原理
荧光分析法的基本原理
荧光分析法是一种常用的分析化学方法，它利用物质在受到激发后发出的荧光
来进行定量或定性分析。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、分析速度快等优点，因此在生物医学、环境监测、食品安全等领域得到了广泛的应用。
荧光分析法的基本原理是物质受到激发后发出的荧光强度与其浓度成正比。
当
物质受到特定波长的激发光照射后，其中的分子会吸收能量并处于激发态，随后分子会自发地返回基态并释放出能量，这种能量以荧光的形式发射出来。
荧光分析法利用荧光强度与物质浓度的关系来进行分析，通过测量样品的荧光强度，可以间接地推断出样品中目标物质的浓度。
荧光分析法的基本原理还包括激发光源、激发光和荧光检测器。
激发光源通常
采用紫外灯或激光器，用于提供足够的能量来激发样品中的分子。
激发光是指对样品进行激发的光线，其波长通常由样品的特性决定。
荧光检测器则用于测量样品发出的荧光强度，并将其转化为电信号进行处理和分析。
在实际应用中，荧光分析法可以应用于各种领域。
在生物医学领域，荧光分析
法可以用于检测生物标记物、药物浓度、蛋白质含量等，具有灵敏度高、特异性强的优点。
在环境监测领域，荧光分析法可以用于检测水体中的重金属离子、有机物污染物等，能够快速、准确地进行分析。
在食品安全领域，荧光分析法可以用于检测食品中的添加剂、农药残留、重金属等有害物质，为食品安全提供可靠的分析手段。
总之，荧光分析法作为一种灵敏度高、选择性好的分析方法，具有广泛的应用
前景。
通过深入理解荧光分析法的基本原理，结合实际应用需求，可以更好地利用这一分析方法，为各个领域的分析工作提供更加准确、快速、可靠的支持。
荧光分析法
荧光分析法一、基本原理某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluorescence analysis）。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。
在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。
跃迁到较高能级的分子，很快（约10-8s）因碰撞而以热的形式损失部分能量，由所处的激发态能级下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。
由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。
荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。
物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。
如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（excitation spectrum）。
实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。
在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。
在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。
激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。
对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。
荧光物质的线性范围一般在0.00005-100微克/ml,当荧光物质溶液的吸光度小于或等于0.05时荧光强度和浓度才成线性关系。
荧光分析法
E h
式中:
hc
p
h
h——普朗克常数，等于6.626×10-34 J· s; c——光速，等于2.998× 1010cm/s.
在光致激发和去激发光中，价电子可以处在不同的自选状态，
常用电子自旋状态的多重性来描述。 一个所有电子自旋都配对的分子的电子态称为单重态，用S表示， 基态为单重态的分子具有最低电子能，用S0 表示如果电子在跃 迁过程中改变了自旋方向，使分子具有两个自旋平行的电子， 这样的电子态称为三重态，用T表示
3.温度的影响
荧光强度对温度较敏感，因此荧光分析一定要严格控制温度。
温度升高，绝大多数荧光物质的荧光效率降低，荧光强度减低。 因为温度升高，激发态分子与溶剂分子的碰撞频率增大，增加 了外转移的非辐射过程，导致溶液荧光强度降低，因此，可通 过降低温度的方法提高荧光效率和荧光强度。
4.溶液pH的影响
荧光分析法可采用足够强的光源和高灵敏度的检测放大系统，从而 获得比可见光吸光度法高的多的灵敏度。
影响荧光强度的因素
1.溶剂的影响
而增强。
• 荧光峰的波长随溶剂的介电常数增大而增大，强度随极性的增大
• 2.溶液粘度的影响
• 荧光强度随着介质粘度的升高而增强，这是由于介质粘度增强，
减少了分子碰撞，从而减少了能量损失的结果
激发单色器 光源 样品池 垂直
指示器· 放大器 记录器
发 射 单 色 器 检测器
国产970CRT型荧光分光光度计
1.激发光源
荧光测量中所用的光源一般比紫外-可见分光光度计所使用的光
源发光强度大，激发光源通常采用发射强度高的汞弧灯、氢灯
或氙弧灯。氙弧灯产生强烈的连续辐射，其波长范围在
荧光分析法
（1）振动弛豫：同一电子激发态上的电子从高 的振动能级返回到最低振动能级。
电子能级 原因：分子碰撞
振动能级
结果：释放热能、无辐射跃迁
（2）内部能量的转移
两个激发态之间的能量接近，振动能级部分 重叠时，激发态分子常由高电子能级以无辐射 跃迁方式转移至低电子能级
电子能级
振动能级
（3）荧光发射 从任一激发单线态，通过内转换及振动弛豫， 回到第一激发单线态最低振动能级，再以辐射形 式发射光量子而回到基态的任一振动能级。
（5）体系间的跨越 激发态分子的电子发生自旋反转，其多重性发 生变化（激发单线态—激发三线态） 发生条件：物质中含有重原子如Br、I等
电子能级
振动能级
分子由激系间跨越的分子降至三线 态最低能级，跃迁至基态而发生的光。
电子能级
振动能级
第二激发态 第一激发态 电子能级
振动能级
特点：荧光的能量小于激发光能量。 荧光发射所需时间为10-9~10-7s。
（4）外部能量的转移
激发态分子与溶剂分子及其它溶质分子之间 相互碰撞而失去能量，常以热能的形式放出。 常发生在第一激发单线态或第一激发三线态 的最低振动能级向基态转换的过程中
外部能量转换可降低荧光强度，有时也称为 荧光猝灭或荧光熄灭。
特点：（1）λ（磷光）>λ（荧光）
（2）寿命10-4—10s
（3）室温下溶液很少呈现磷光（需冷冻）
处于激发态的分子回基态的途径： ①发射荧光 ②发射磷光 ③内部能量转换 ④ 外部能量转换
速度最快，激发态寿命最短的途径占优势。
（a）吸收 （b）振动弛豫 （c）内部能量转换 （d）荧光 （e）体系间跨越 （f）磷光
荧光效率 0.11
（2）分子的刚性和共平面性
化学分析中的荧光分析法基础原理
化学分析中的荧光分析法基础原理荧光分析法是一种广泛应用于化学分析中的方法。
它利用物质在吸收能量后会发生荧光现象的特性，来测定样品中所含物质的质量浓度、元素组成等信息。
荧光分析法有很多种，其中最常见的是荧光光谱分析法和荧光化学分析法。
本文将重点介绍这两种方法的基本原理及其在化学分析中的应用。
荧光光谱分析法荧光光谱分析法是基于研究物质在吸收外部能量（通常是光能）后所发出的荧光现象。
荧光分析的关键是光谱，而荧光光谱是物质吸收光后所产生的荧光强度与波长之间的关系图。
通常情况下，荧光光谱会产生波峰和波谷，其中波峰对应着荧光峰，荧光峰的位置、强度以及荧光的寿命都可以直接反映出物质的成分、组成、形态等性质。
荧光光谱分析法是一种非破坏性的检测方法，对样品的破坏仅仅是因为光的吸收引起样品的发光。
虽然这种方法与分子的单重态和三重态的能级有关，然而它依然是一种化学分析方法，因为荧光分析法的结果是由物质的成分和结构来决定的。
荧光光谱分析法非常适用于分析质量浓度比较低，并且需要分析多个成分的样品。
荧光化学分析法除了荧光光谱分析法以外，荧光化学分析法也是一种常见的荧光分析方法。
这种方法是利用荧光物质和待测物质结合形成荧光物质-待测物质复合体，进而检测出待测物质的浓度。
荧光化学分析法常用于分析有机化合物、生物大分子以及环境中的污染物等。
荧光化学分析法可以通过两种方式进行：荧光标记法和荧光敏感材料法。
荧光标记法是把荧光酶、荧光染料或者其他荧光探针标记到待测物质上，形成荧光检测体系。
这种检测方式是在分子水平上实现的，因此具有足够高的灵敏度并且避免了直接接触待测物质的问题。
荧光标记法在生物化学、生物医学等领域都得到广泛的应用。
荧光敏感材料法是基于荧光材料敏感性对待测物质的反应来进行的。
这种方法利用化学或生物体系使荧光物质发生特定的荧光变化，从而检测待测物质的浓度。
荧光敏感材料法依靠荧光物质的基质，具有选择性和快速性，并且对待测物质有更加广泛的适用性。
荧光分析法
第二节 基本原理
一、荧光与磷光的产生过程 二、激发光谱与荧光(磷光)光谱
2020/6/12
一、荧光与磷光的产生过程
1.电子激发态的多重度
电子激发态的多重度：M=2S+1
S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；
平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应 单重态能级低；
大多数有机分子的基态处于单重态；
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定荧光测量波长(选最大发射波长),测定得到的化合物 发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线 图中曲线I
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光 强度最大；
2020/6/12
2.荧光光谱(或磷光光谱)
固定激发光波长(选
最大激发波长),测定得 到的化合物发射的荧光(
S0→T1 禁阻跃迁； 通过其他途径进入 (见能级图)；进入的 几率小；
2020/6/12
一、荧光与磷光的产生过程
2Hale Waihona Puke 分子能级与跃迁：分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；
基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：
吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速
T1 → S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁）
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-4～100 s 。
2020/6/12 光照停止后，可持续一段时间。
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？
第一节 概述
一、什么是荧光？ 当某物质吸收特定波长的光之后，除产
荧光分析法基本概念
紫外可见吸收光谱一紫外吸收光谱分析基于物质对200-800nm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。
它属于分子吸收光谱，是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。
二紫外光谱的产生物质分子的能量具有量子化的特征（即物质分子的能量具有不连续的特征）。
一个分子有一系列能级，其中包括许多电子能级，分子振动能级以及分子转动能级。
分子吸收特定的波长的光而产生吸收光谱分子的紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的，从化学键的性质上考虑，与电子光谱有关的主要是三种电子：（1）形成单键的σ电子；（2）形成双键的π电子；（3）分子中非键电子即n 电子。
化合物不同，所含的价电子类型不同，所产生的电子跃迁类型不同，根据分子轨道理论，分子中这三种电子能级的高低次序大致是：（σ）＜（π）＜（n）＜（π*）＜（σ* ）σ,π是成键轨道，n 是非键轨道，σ* ,π* 是反键轨道由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。
即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。
二紫外光谱的表示方法紫外光谱图是由横坐标、纵坐标和吸收曲线组成的。
横坐标表示吸收光的波长，用nm（纳米）为单位。
纵坐标表示吸收光的吸收强度，可以用A(吸光度)、T(透射比或透光率或透过率)、1-T(吸收率)、 (吸收系数) 中的任何一个来表示。
吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。
曲线最大吸收峰的横坐标为该吸收峰的位置，纵坐标为它的吸收强度。
四、紫外光谱中常用的几个术语1.发色基团和助色基团发色基团：是能导致化合物在紫外及可见光区产生吸收的基团，不论是否显示颜色都称为发色基团。
一般不饱和的基团都是发色基团（C=C、C=O、N=N 、三键、苯环等）助色基团：指那些本身不会使化合物分子产生颜色或者在紫外及可见光区不产生吸收的一些基团，但这些基团与发色基团相连时却能使发色基团的吸收带波长移向长波，同时使吸收强度增加。
分析化学第11章--荧光分析法
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： 基态分子 hv 激发单重态(s1*,s2*)
激发三重态
2）激发态能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 磷光 系间跨越内转换 外转换 振动弛豫
1.无辐射跃迁
a.振动驰豫(vibrational relexation):
处于激发态各振动能级的分子通过 与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子则返回 到同一电子激发态的最低振动能级 的过程。
2)电子能态的多重性：
M=2S+1
S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0
M=2S+1=1
对应基线单重态；
对于激发态
s1=1/2,s2=1/2,
S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍
8-羟基喹啉
8－羟基喹啉镁
弱荧光
强荧光
刚性和共面性增加，可以发射荧光或增 强荧光。
c.位阻效应
NaO3S
N(CH3)2
NaO3S
N(CH3)2
1-二甲氨基萘-7-磺酸钠 f＝0.75
1-二甲氨基萘-8-磺酸钠 f ＝0.03
荧光分析法的基本原理
荧光分析法的基本原理荧光分析法是一种常用的分析技术，它利用样品在受到激发光照射后发出的荧光信号来进行分析。
该方法具有灵敏度高、选择性好、操作简便等优点，在生物医药、环境监测、食品安全等领域得到了广泛的应用。
荧光分析法的基本原理是基于物质在受到激发光照射后会发出荧光的特性。
当分子处于基态时，吸收一定波长的激发光后，电子跃迁至激发态，再从激发态返回基态时会放出荧光。
荧光分析法利用这一原理，通过测量样品在受到激发光后发出的荧光强度来确定样品中所含物质的种类和含量。
在荧光分析法中，激发光源会激发样品中的分子，使其处于激发态，然后测量样品发出的荧光信号。
荧光信号的强度和波长分布可以提供关于样品成分和结构的信息。
通过测量样品的荧光强度和波长分布，可以对样品中的化合物进行定性和定量分析。
荧光分析法的基本原理包括激发和发射两个过程。
激发过程是指样品受到激发光照射后，分子从基态跃迁至激发态的过程；发射过程是指分子从激发态返回基态时发出荧光的过程。
荧光分析法利用这两个过程进行分析，可以实现对样品中微量物质的高灵敏度检测。
荧光分析法的灵敏度高，可以检测到样品中极微量的物质。
同时，荧光分析法具有良好的选择性，可以通过选择合适的激发光源和检测波长，对不同物质进行区分和分析。
此外，荧光分析法的操作简便，只需一台荧光分析仪和相应的荧光标记剂即可进行分析，无需复杂的前处理步骤，适用于现场快速检测和大样品量分析。
总之，荧光分析法是一种灵敏度高、选择性好、操作简便的分析技术，具有广泛的应用前景。
随着荧光标记技术和荧光分析仪器的不断发展，荧光分析法将在生物医药、环境监测、食品安全等领域发挥越来越重要的作用。
化学分析技术中的荧光法
化学分析技术中的荧光法荧光法是化学分析技术中常用的一种方法，其基本原理是利用物质吸收能量后产生的激发态分子的自发辐射。
荧光法具有高灵敏度、高选择性、快速、非破坏性等优点，因此在分析领域中得到了广泛应用。
一、荧光现象荧光现象是很多物质在受激光照射或吸收其他电磁波后，从基态跃迁到激发态，再从激发态衰减到基态时，自然辐射出的光现象。
其光谱分布与吸收光谱不同，一般在较长波长处产生。
荧光的激发带宽度很大（可以从两纳米到上百纳米），且激发光对物质的化学性质影响较小，因此在分析领域中具有独特的优势。
二、荧光分析法1. 直接测量法荧光分析法一般分为直接测量法和间接测量法两类。
直接测量荧光分析法中，荧光物质为测量对象，测量时将激发光辐射到样品中，测量样品发出的荧光强度，然后通过与标准曲线比较，可以计算出样品中荧光物质的浓度。
直接测量荧光分析法具有快速、灵敏度高、稳定性好等优点。
但它也面临着无法消除因测量系统的几何位置和分析效果差异而引起的扰动信号等问题。
2. 间接测量法另一种荧光分析法是间接测量法。
它是通过荧光物质与已知物质的相互作用来测定未知物质的量。
例如，糖类物质可以被邻苯二甲酸酐（PA）酰化成PA-糖酐，这种物质能够与荧光比爱琴素（ANS）结合产生荧光，而且糖酐的数量与荧光信号的强度成正比。
通过对标准曲线的制备，可以计算出未知糖酐的浓度。
间接测量荧光分析法的优点是可以避免测量系统的几何位置和分析效果差异而引起的扰动信号的干扰，但它也存在某种程度上的样品处理和校准难度大的问题。
三、荧光分析在生命科学中的应用荧光分析方法在生命科学领域中已经得到了广泛的应用，例如，在生化学、免疫学、细胞、化学生物学等各个领域。
在免疫学中，荧光抗体标记技术被广泛用于检测蛋白质和微生物。
常用的标记染料包括荧光素和菲罗达胺等。
荧光分析方法还能够用于细胞成像和病理学分析。
蛋白质标记生物发光剂（luciferase）能够被转染到细胞内，进而检测细胞中的信号通路或者探究细胞蛋白质之间的交互作用。
荧光分析法仪器结构
• 发展多元荧光分析技术，提高测量的选择性
• 实现仪器的自动化和智能化，提高测量通量和准确度
荧光分析法仪器的市场前景
荧光分析法仪器在生物化学、环境监测、材料科学
等领域具有广泛的应用前景
荧光分析法仪器市场竞争激烈，但仍存
在创新机遇和市场空间
• 随着生命科学、环境科学、材料科学
• 荧光分析法仪器市场将面临来自国内
• 蛋白质研究：荧光标记、荧光共振能量转移等
• 核酸研究：荧光定量PCR、荧光原位杂交等
荧光分析法在环境监测领域的应用
• 水质监测：荧光探针检测重金属离子、有机物等
• 大气监测：荧光探针检测气态污染物、颗粒物等
荧光分析法在材料科学领域的应用
• 荧光染料：制备荧光纳米材料、荧光传感器等
• 荧光探针：研究材料表面性质、应力分布等
⌛️
02
荧光分析法仪器结构及组成部件
荧光分析仪的基本结
构
• 荧光分析仪主要由光源、样品池、检测器和数据处理系统组成
• 光源：提供激发光和荧光的照射
• 样品池：用于放置和培养样品，可以是试管、比色皿等
• 检测器：用于接收荧光信号，将其转换为电信号
• 数据处理系统：对电信号进行处理、分析和显示
荧光分析仪的主要组成部件
温控系统：用于控制样品池的温度，以满足荧光测量的要求
02
光纤：用于传导激发光和荧光信号，提高测量精度和灵敏度
03
滤波器：用于选择合适的激发光和荧光波长，提高测量选择性
03
荧光分析法仪器的工作原理及操作流程
荧光分析法仪器的工作原理
• 荧光分析法仪器的工作原理
• 利用光源产生激发光，照射样品池中的样品
荧光分析法
发射光谱：固定激发光的波长和强度，改变荧 光的测定波长（即发射波长），并记录相应的 强度。 以发射波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图， 得到物质的荧光光谱。
荧光物质的最大激发波长（lex）和最大 发射波长（lem）是鉴定物质的根据；也是定 量测定最为灵敏的条件。
荧光光谱的普遍特性 1.斯托克斯位移(Stokes shift):
3.1-二甲氨基－5－氯化磺酰萘
lex 365nm
lem 500nm
4.测定无机离子的荧光试剂
三、影响荧光强度的外部因素
1.温度 温度增加，荧光效率和荧光强度下降。
2.溶剂
随着溶剂的极性的增加，荧光物质的π→π* 跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也 发生红移；溶剂粘度提高，荧光强度提高。
（二）荧光的激发光谱和发射光谱
激发光谱（excitation spectrum）：固定荧光的发 射波长，不断改变激发光（即入射光），记录荧 光强度的变化。 以激发波长为横坐标，荧光强度为纵坐标，可得 荧光物质的激发光谱。
注意：激发光谱与其吸收光谱极为相似，但激发光 谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则 是吸光度与波长的关系曲线，两者性质是不同的。
3.荧光光谱与激发光谱的镜像关系
激发光谱与荧光光谱成对称镜像关系。
二、荧光与分子结构
（一）荧光寿命和荧光效率 荧光寿命(fluorescence lift time)：当除去激发光 源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的 1/e所需的时间，用 f 表示。
荧光效率（fluorescence efficiency):常用 f 表示。
二、定量分析方法
优点 1.灵敏度高
比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级； 检测下限：0.1～0.001g/mL 2.选择性强 既可依据发射光谱特征，又可根据激发光谱特征； 3.试样量少和方法简单
荧光分析法实验版1
分子吸收能量后，从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发
态或更高电子激发态的不同振动能级（这一过程速度很快， 大约10-15 s），成为激发单重态分子。激发态分子不稳定， 可以通过以下几种途径释放能量返回基态。 1. 振动驰豫 2. 内转换 3. 荧光 4. 系间窜跃 5. 磷光
合物等。
造成荧光熄灭的原因有多种： （1）激发态荧光分子和熄灭剂分子碰撞，将能量转移到熄灭剂而使荧光熄灭； （2）荧光分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配合物； （3）荧光物质分子中引入重原子后，易发生系间窜越而转变为三重态； （4）当荧光物质浓度较大时，激发态分子和基态分子发生碰撞，产生荧光自
长不变（即固定激发单色器），依次改变荧光
发射波长，测定样品在不同波长处发射的荧光
强度F。以发射波长为横坐标，以荧光强度F为
纵坐标作图，得到荧光发射光谱。荧光发射光
谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大发
射波长。
三、影响荧光产生及荧光强度的因素
（一）物质产生荧光的必要条件 一种物质能否发荧光以及荧光强度的高低，与它的分子结构 及所处的环境密切相关。能够发射荧光的物质都应同时具备两个 条件：
行定量测定。
荧光分析法（fluorescence analysis）就是利 用物质的荧光特征和强度，对物质进行定性和定量分 析的方法。
1.荧光的定义
在紫外光或波长较短的可见光照射 后，一些物质会发射出比入射光波长更 长的光 --------荧光。以测量荧光的强度 和波长为基础的分析方法叫做荧光光度 分析法。
后期作图 1.打开origin软件→ →x.txt→找到已保存的文件（两个通 道）→Add→OK 点击 → →Add→ →Add→OK。 出现光谱图 2.双击X AXTS TITLE，出现对话框，改为x/nm,双击y Ax改为 y/F.点击 图标，移动鼠标到峰点，再点T图标，再点左键 ，输入数值297nm 重复再输入另一峰值 重复输入excitation emission 即成 3.再点击File(电脑左上方) →（save project）点击，输入文件 名，点保存。 4．最后点击→Edit(在File后)，点击copy page,即可复制在 word文档。 这件完整的图形即可在用U盘拷贝了。
分析化学第十一章荧光分析法
由于自旋平行比自旋配对的状态更稳定，故三重 态的能级比单重态的能量略低。
每个电子能级都有ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ个振动能级，在同一个电子 能级中，最低的线代表该能级的振动基态。
吸收过程发生在10-15s左右的时间内。
分析化学第十一章荧光分析法
分子吸收和发射过程的Jablonski能级能级图
由分子多重性的定义有M=2S+1=1,称之为单
重态。 基态单重态以S0表示，S1和S2则分别代表分
子的第一和第二激发单重态。 当分子处于激发态时，若分子的电子自旋与
基态相同，仍然是单重态，即分子处于S1和S2。
分析化学第十一章荧光分析法
在激发态中，分子的某个电子也有可能改变自 旋，即自旋平行则S=1，所以多重性M=2S+1=3,分子 处于这样的激发态称为三重态，
体系的荧光增强；反之，则使体系的荧光减弱。
分析化学第十一章荧光分析法
三、荧光的激发光谱和发射光谱
任何荧光分子都具有两种特征的光谱，即激 发光谱和荧光光谱。 ⒈荧光激发光谱
激发光谱是通过固定发射波长，扫描激发波
长而获得的荧光强度(F)—激发波长(λex)的关系
分析化学第十一章荧光分析法
㈡荧光效率
荧光效率也称荧光量子效率，是发射荧光的分子数与 总的激发态分子数之比。也可定义为物质吸光后发射的 荧光的光子数与吸收的激发光的光子数之比。
f
发 射 荧 光 的 光 子 数 吸 收 激 发 光 的 光 子 数
荧光的去激发过程：
①发射荧光返回基态(强的荧光物）
②无辐射跃迁回到基态(低荧光物质)
分析化学第十一章荧光分析法
⑹磷光发射 激发态分子经过系间跨越到达激发三重态
荧光分析法基本概念
荧光分析法基本概念荧光分析法是一种基于物质发射和吸收荧光现象的分析技术。
荧光是指物质吸收电磁辐射后，经激发而发出的光辐射。
荧光分析法利用物质在激发射线的激发下产生的荧光进行定性和定量分析。
它具有高灵敏度、高选择性和高准确性等优点，广泛应用于化学、生物、医学、环境等领域。
荧光原理：荧光原理是指物质在吸收电磁波能量后，部分或全部转化为光能并发出荧光。
荧光的激发和发射有两种机制：分子吸收电磁辐射后跃迁到激发态，然后再从激发态返回基态释放能量发光；分子之间发生能量传递，从激发的分子接收能量并转化为荧光发射。
荧光分析原理：荧光分析技术基于物质的荧光性质。
荧光分析法通过测量物质在特定激发光激发下产生的荧光强度或荧光寿命，来获取物质的信息。
荧光分析法包括荧光光谱分析和荧光寿命分析。
荧光光谱分析：荧光光谱分析是指根据物质在激发下发射的荧光光谱特性来进行定性和定量分析。
荧光光谱是物质荧光发射的光波长与相应的荧光强度之间的关系。
通常，物质的荧光光谱有较为特征的波长范围和特定的峰。
荧光寿命分析：荧光寿命是指物质从激发态到基态的转变所需的平均时间，也称为物质的荧光衰减曲线。
荧光寿命分析利用物质的荧光寿命来进行定性和定量分析，可以通过测量荧光寿命来确定物质的存在和浓度等信息。
常见的荧光分析方法有荧光光谱仪、荧光显微镜、荧光染料、荧光标记等。
荧光光谱仪是荧光分析的重要工具，可以测量物质的荧光光谱，并通过荧光光谱来判断物质的性质和含量。
荧光显微镜是利用物质的荧光特性来观察样品的工具。
荧光染料是一种通过吸收和发射荧光的物质，常用于生物分子的标记和显色。
荧光标记是一种将荧光染料或荧光物质与分析物相结合，通过测量标记物的荧光特性来进行定性和定量分析。
荧光分析法在化学、生物、医学和环境等领域有广泛应用。
在化学分析中，荧光分析法可以用于分析确定荧光染料的结构、测定荧光染料的含量和纯度等。
在生物和医学领域，荧光分析法可以用于检测和定量分析蛋白质、核酸、细胞和微生物等生物分子和生物体。
荧光分析法
射时间长,约为10-4~10
秒（原因是分子激发三 重态的寿命较长） 。
S2* S1*
b
ν ν ν ν ν02134
c
b
ν ν ν ν ν02134
e
ννννν02134
T1
S0
a
d
f
ννννν02134
a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换；d.荧光；e.体系间跨 越；f.磷光
二、基本原理
• 4、影响荧光强度的外部因素
b. 光致发光：指处于激发态的分子或原子通过发射出 一定波长的光，以辐射的形式回到基态，这种能级的 变化叫光致发光(辐射跃迁)。
▲最常见的两种光致发光：荧光和磷光。
二、基本原理
• 2、激发光谱和发射光谱
（1）激发光谱 （excitation spectrum)
它指不同激发波长的辐 射引起物质发射某一波长的 荧光所得的光谱。即固定发 射光波长λem ，依次改变激 发波长λex测荧光强度F， 以F-λ激作得荧光物质的激 发光谱（见右图（a))。
b
ννννν02134
c
b
ννννν02134
e
ννννν02134
T1
特点：两个电子的能级 非常靠近以致其振动能 级有重叠时内部转换易
S0
a
d
f
ννννν02134
a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换；d.荧光；e.体系间跨 越；f.磷光
发生。 10-1~10-13秒可
荧光和磷光产生的示意图
完成。
H H
H
H
反式强荧光
顺式无荧光
对于顺反异构体，顺式分子的两个基团在同一 侧，由于空间位阻原因使分子不能共平面而没有荧光。
荧光分析法
基态时分子中的电子对填充在能量最低的轨道，
且自旋相反，即总自旋量子数s为0
电子能级多重性：M＝2s+1 单重态S M＝1 自旋相反 三重态T M＝3 自旋相同
4
基态
被激发跃迁过程中：
通常电子不发生自旋方向的改变,电子对自旋相反， 电子发生自旋方向的改变,电子对自旋相同，总自旋
总自旋量子数s为0,处于激发单重态。
第十一章 荧光分析法
（Fluorescence）
1
分子发光（molecular luminescence）
某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后， 返回基态的过程中伴随发光的现象。
hγ
概述
M+ 能量 →M＊
M
2
分类
原子荧光 荧光 分子荧光 光致发光（PL） 紫外可见荧光 磷光 化学发光（CL） 红外荧光 X射线荧光 电致发光（EL） 生物发光（BL）
19
3）荧光光谱与激发光谱镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱
形状一样）成镜像对称关系
基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振 动能级分布类似；
20
镜像关系?
固定em=620nm 固定ex=290nm (MAX)
IF
4 3 2 1
4800 4400
1→ 4 1→ 3
S1
4000
44
4.胶束增敏荧光分析 当单体表面活性剂浓度增大到临界胶束浓度，
会缔合为球状胶束， 利用胶束溶液对荧光物质有
增溶、增敏和增稳的作用，对荧光物质进行保护
45
荧光分析法的应用 1.无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定 2.生物与有机化合物的分析
实验二—荧光分析
激发光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大激发
波长，是激发荧光最灵敏的波长。
发射光谱(emission spectrum)
保持激发光波长不变（即固定激发单色器），依次
改变荧光发射波长，测定样品在不同发射波长处的
荧光强度。以发射波长为横坐标，以荧光强度为纵 坐标作图，得到荧光发射光谱。
荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是 最大发射波长。
发与发射波长。
定量分析
取6支试管，按下表加入试剂 1 2 0.2 0 3 0.4 0 4 0.6 0 5 0.8 0 6 0 0.3
实 验 步 骤
0.5μg/mL荧光素钠 mL 被测溶液 mL
0Hale Waihona Puke 01 mol/L NaOH mL 对应含量×200 g
INT
1 0
1 20
1 40
1 60
1 80
1 X
酸度的影响
实 验 步 骤
取3支试管，各加入0.8 mL 荧光素钠标 准溶液，取其中两支分别加入1 mL NaOH、1 mL HAc，用去离子水冲稀至 20 mL，摇匀，测INT，比较其大小。
思 考 题
荧光定量分析法的原理是什么？ 荧光素钠的荧光强度与酸度有何 关系？
efficiency）。也称荧光量子产率，用 表示。
激发光谱和发射（荧光）光谱
荧光检测
图1 荧光分光光度计示意图
激发光谱 (excitation spectrum )
保持荧光发射波长不变（即固定发射单色器），依次改
变激发光波长（即调节激发单色器），测定不同波长的
激发光激发下得到的荧光强度。然后以激发光波长为横 坐标，以荧光强度为纵坐标作图，就可得到该荧光物质 的激发光谱。
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紫外可见吸收光谱一紫外吸收光谱分析基于物质对200-800nm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。
它属于分子吸收光谱，是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。
紫外光谱的产生物质分子的能量具有量子化的特征(即物质分子的能量具有不连续的特征) 。
一个分子有一系列能级，其中包括许多电子能级，分子振动能级以及分子转动能级。
分子吸收特定的波长的光而产生吸收光谱分子的紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的，从化学键的性质上考虑，与电子光谱有关的主要是三种电子： (1)形成单键的c电子；(2)形成双键的n电子；(3) 分子中非键电子即n电子。
化合物不同，所含的价电子类型不同，所产生的电子跃迁类型不同，根据分子轨道理论，分子中这三种电子能级的高低次序大致是：(c)v(n)v( n) v(n * )v( c * ) c，冗是成键轨道，n是非键轨道，c* , n *是反键轨道由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。
即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。
紫外光谱的表示方法紫外光谱图是由横坐标、纵坐标和吸收曲线组成的横坐标表示吸收光的波长，用nm （纳米）为单位。
纵坐标表示吸收光的吸收强度，可以用 A （吸光度）、T （透射比或透光率或透过率）、 1-T （吸收率）、?（吸收系数）中的任何一个来表示。
吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。
曲线最大吸收峰的横坐标为该吸收峰的位置, 纵坐标为它的吸收强度。
250A /nm翠腔的紫外光谨图 四、紫外光谱中常用的几个术语1. 发色基团和助色基团发色基团：是能导致化合物在紫外及可见光区产生吸收的基团，不论是否显示颜色 都称为发色基团。
一般不饱和的基团都是发色基团（ C=C C=O N=N、三键、苯环等）200 3001.振动驰豫助色基团：指那些本身不会使化合物分子产生颜色或者在紫外及可见光区不产生吸收的一些基团，但这些基团与发色基团相连时却能使发色基团的吸收带波长移向长波，同时使吸收强度增加。
助色基团通常是由含有孤对电子的元素所组成（-NH2 , -NR 2, -OH -OR , -Cl等），这些基团借助P- n共轭使发色基团增加共轭程度，从而使电子跃迁的能量下降2 •红移、蓝移、增色效应和减色效应由于有机化合物分子中引入了助色基团或其他发色基团而产生结构的改变、或者由于溶剂的影响使其紫外吸收带的最大吸收波长向长波方向移动的现象称为红移。
与此相反，如果吸收带的最大吸收波长向短波方向移动，则称为蓝移。
由于化合物分子结构中引入取代基或受溶剂的影响，使吸收带的强度即摩尔吸光系数增大或减少的现象称为增色效应或减色效应、分子荧光分析法、荧光的产生物质分子的能级包括一系列电子能级、振动能级和转动能级。
分子吸收能量后，从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态的不同振动能级（这一过程速度很快, 大约10-15s），成为激发单重态分子。
激发态分子不稳定，可以通过以下几种途径释放能量返回基态丁. ：》.*览空式损失部分能量, 从这一过程只彳能页3较高振动能级下降到该电子能级的最低振动能级上。
由于这一部分能量以热的形式释放, 而不是以光辐射形式发出，故振动驰豫属于无辐射跃迁。
2. 内转换即激发态分子将多余的能量转变为热能，从较高电子能级降至较低的电子能级。
内转换也属于无辐射跃迁3. 系间窜跃有些物质的激发态分子通过振动驰豫和内转换下降到第一电子激发态的最低振动能级后，有可能经过另一个无辐射跃迁转移至激发三重态，这一过程伴随着自旋方向的改变，称为系间窜跃。
对于大多数物质，系间窜跃是禁阻的。
如果分子中有重原子（如I、Br等）存在，由于自旋-轨道的强偶合作用，电子自旋方向可以改变，系间窜跃就变得容易了4. 磷光经系间窜跃的分子再通过振动驰豫降至激发三重态的最低振动能级，停留一段时间（10-4〜10 s，称作磷光寿命），然后以光辐射形式放出能量返回到基态各振动能级，这时发出的光称为磷光（phosphoresce nee ）。
由于激发三重态能量比激发单重态最低振动能级能量低，故磷光辐射的能量比荧光更小，即磷光的波长比荧光更长。
5、1/. 荧光较高激发态分子经无辐射跃迁降至第一电子激发单重态的最低振动能级后，仍不稳定，停留较短时间后（约10-8 s，称作荧光寿命），以光辐射形式放出能量，回到基态各振动能级，这时所发射的光称为荧光。
当然也可以无辐射跃迁形式返回基态、激发光谱和荧光光谱荧光检测光源发出的紫外可见光通过激发单色器分出不同波长的激发光，照射到样品溶液上，激发样品产生荧光。
样品发出的荧光为宽带光谱，需通过发射单色器分光后再进入检测器，检测不同发射波长下的荧光强度F。
由于激发光不可能完全被吸收，可透过溶液，为了防止透射光对荧光测定的干扰，常在与激发光垂直的方向检测荧光（因荧光是向各个方向发射的）。
激发光谱与荧光发射光谱的形成任何荧光物质，都具有两种特征光谱，即激发光谱（excitation spectrum）和荧光发射光谱（fluorescence emission spectrum）。
1. 激发光谱保持荧光发射波长不变（即固定发射单色器），依次改变激发光波长（即调节激发单色器），测定不同波长的激发光激发下得到的荧光强度 F （即激发光波长扫描）。
然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，就可得到该荧光物质的激发光谱。
激发光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大激发波长，是激发荧光最灵敏的波长。
物质的激发光谱与它的吸收光谱相似，所不同的是纵坐标。
2. 荧光光谱荧光光谱，又称发射光谱。
保持激发光波长不变（即固定激发单色器），依次改变荧光发射波长，测定样品在不同波长处发射的荧光强度F。
以发射波长为横坐标，以荧光强度F 为纵坐标作图，得到荧光发射光谱。
荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大发射波长发射光谱与激发光谱的关系1. 发射光谱形状与激发光波长无关由于荧光是分子从第一电子激发态的最低振动能级返回到基态的各振动能级时释放的光辐射，与分子被激发至哪一个电子激发态无关。
2. 发射光谱比激发光谱波长为长由于分子吸收激发光被激发至较高激发态后，先经无辐射跃迁（振动驰豫、内转换）损失掉一部分能量，到达第一电子激发态的最低振动能级，再由此发出荧光。
因此，荧光发射能量比激发光能量低，发射光谱波长比激发光波长长。
3. 镜像对称对于高度对称的有机分子，其荧光发射光谱与吸收光谱呈镜像对称关系。
解释：能级结构相似性荧光为第一电子激发单重态的最低振动能级跃迁到基态的各个振动能级而形成，即其形状与基态振动能级分布有关。
激发光谱是由基态最低振动能级跃迁到第一电子激发单重态的各个振动能级而形成，即其形状与第一电子激发单重态的振动能级分布有关。
由于激发态和基态的振动能级分布具有相似性，因而呈镜像对称。
、影响荧光产生及荧光强度的因素1. 物质产生荧光的必要条件一种物质能否发荧光以及荧光强度的高低，与它的分子结构及所处的环境密切相关。
能够发射荧光的物质都应同时具备两个条件：1. 物质分子必须有强的紫外吸收（有？〜?*跃迁）；2. 物质具有较高的荧光效率（fluorescence efficiency ）。
荧光效率也称荧光量子产率，用?f 表示。
可见，凡是使k F增加，使其它去活化常数降低的因素均可增加荧光量子产率。
通常，k F由分子结构决定（内因），而其它参数则由化学环境和结构共同决定。
2. 影响荧光及其强度的因素跃迁类型：如上所述，物质必须在紫外可见区有强吸收和高荧光效率才能产生荧光。
具有?—?* 跃迁的分子才有强吸收。
?—?* 跃迁的?大。
共轭效应：大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂环，具有共轭的?〜?* 跃迁。
其共轭程度愈大，荧光效率也愈大，且最大激发和发射波长都向长波长方向移动，如苯、萘、刚性平面结构：当荧光分子共轭程度相同时，分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大荧光物质（荧光素）非荧光物质（酚酞）芴（①=1.0 ）联苯（①=0.2 ）有些物质本身不发荧光或荧光较弱，但和金属离子形成配合物后，如果刚性和共平面性增加，就可以发荧光或增强荧光。
如8-羟基喹啉是弱荧光物质，与Mg+、A|3+等金属离子形成的配合物的荧光增强，利用这一特点可以间接测定金属离子。
8-羟基喹啉8- 羟基喹啉-铝取代基团荧光分子上的各种取代基对分子的荧光光谱和荧光强度都有很大影响。
给电子取代基如一NH、一OH —OCH—CN —NHR —NR等，能增加分子的n电子共轭程度，使荧光效率提高。
而-COOH —NO、—C=O —F、—Cl等吸电子取代基，可减弱分子n电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭。
还有一类取代基则对荧光的影响不明显，如一R、一SOH —NH 等。
温度温度对被测溶液的荧光强度有明显的影响。
当温度升高时，介质粘度减小，分子运动加快，分子间碰撞几率增加，从而使分子无辐射跃迁增加，荧光效率降低。
故降低温度有利于提高荧光效率及荧光强度。
由于荧光仪器光源的光强度大、温度较高，容易引起溶液温度升高，加之分析过程中室温可能发生变化，从而导致荧光强度改变。
另外，有些荧光物质的溶液在激发光较长时间的照射下，还会发生光分解，使荧光强度下降。
因此，试样不应长时间受光照射，只在测定荧光强度时才打开光闸，其余时间应关闭。
在较高档的荧光分光光度计中，样品室四周设有冷却水套或配有恒温装置，以使溶液的温度在测定过程中保持恒定。
溶剂：同一种荧光物质在不同的溶剂中，其荧光光谱的位置和荧光强度可能会有一定的差别，尤其是那些分子中含有极性取代基的荧光物质，它们的荧光光谱易受溶剂的影响。
溶剂的影响可以分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。
一般溶剂效应是指溶剂极性的影响。
通常情况下，随着溶剂极性增大，？〜?*跃迁所需的能量差?E减小，跃迁几率增加，从而使荧光波长长移，荧光强度增大。
一般而言，探针激发态的偶极矩大于基态偶极矩，当荧光基团被激发后，溶剂的偶极子在激发态的荧光基团的周围重新定向而降低激发态的能量，溶剂的极性越大，荧光团激发态能量降低的越多，因而从激发态跃迁回基态时发射的能量越低，发射的波长就越长特殊溶剂效应是指溶剂与荧光物质形成化合物，或溶剂使荧光物质的电离状态改变，使荧光峰的波长和荧光强度都发生较大变化。
如在萘胺的乙醇溶液中加入盐酸，随着溶液中盐酸浓度的增加，萘胺的—NH2 基逐渐被—NH3Cl 基所代替，而—NH3Cl 基对萘环特征频率的影响小于一NH,因此溶液的荧光光谱趋近于萘的荧光光谱。
pH值：溶液的酸度(pH值)对荧光物质的影响可以分两个方面：1．若荧光物质本身是弱酸或弱碱时,溶液pH 值改变,物质分子和其离子间的平衡也随之发生变化,而不同形体具有其各自特定的荧光光谱和荧光效率。