地木耳中藻蓝蛋白的分离与纯化
双水相萃取法富集分离地木耳中的藻蓝蛋白
第３２卷 第６期华侨大学学报（自然科学版）Ｖｏｌ．３２ Ｎｏ．６ ２０１１年１１月Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕａｑｉａｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）Ｎｏｖ．２０１１ 文章编号： １０００－５０１３（２０１１）０６－０６７２－０４双水相萃取法富集分离地木耳中的藻蓝蛋白甘林火（华侨大学化工学院，福建泉州３６２０２１）摘要： 采用聚乙二醇（ＰＥＧ ４０００）／硫酸盐双水相体系，经一次萃取从地木耳细胞破碎液中富集分离藻蓝蛋白．分别考察萃取时间、硫酸盐种类及浓度、ＰＥＧ ４０００浓度、溶液ｐＨ值和离子强度对双水相萃取分离地木耳中藻蓝蛋白的影响．结果表明：在萃取时间为３０ｍｉｎ，Ｎａ２ＳＯ４的质量分数为１５％，ＰＥＧ ４０００的质量分数为１２％，加入ＫＣｌ的质量分数为１％，ｐＨ值为３．０的最优条件下，藻蓝蛋白萃取率可达９５．２％，纯度为４．８．关键词： 地木耳；藻蓝蛋白；聚乙二醇；双水相体系；萃取中图分类号： ＴＱ ９３６．２；ＴＱ ０２８．３＋２文献标志码： Ａ藻蓝蛋白（ＰＣ）是从藻类中分离出的一种深蓝色物质．它既是一种蛋白质，又是一种极好的天然食用色素，同时还是良好的保健食品，具有很高的营养价值和医疗价值［１］．传统的从蓝藻中提取分离藻蓝蛋白的方法多采用盐析沉淀法［２－３］，包括沉淀、离心和透析３个主要操作环节，这在实际工业化生产中存在操作步骤繁琐、动力能耗高及操作周期长等缺点．Ａｌｂｅｒｔｓｓｏｎ［４］于２０世纪５０年代后期开发了双水相萃取法．７０年代以后，双水相萃取技术在生物分离过程中得到广泛应用［５］，为蛋白质特别是胞内蛋白质的分离与纯化开辟了新的途径，具有良好的发展前景．刘杨等［６］研究了双水相萃取法从螺旋藻中分离提取藻蓝蛋白，萃取效率和分配系数均较高．地木耳（Ｎｏｓｔｏｃ）学名普通念珠藻，是陆生蓝藻中的一种，其蛋白含量高达２０％，且藻蓝蛋白丰富［７］．本文采用聚乙二醇（ＰＥＧ ４０００）／硫酸盐双水相体系，分离提取地木耳中的藻蓝蛋白．１ 材料与方法１．１ 材料与仪器地木耳粉为自制（采自福建泉州华侨大学），聚乙二醇（ＰＥＧ ４０００，上海国药集团化学试剂有限公司），Ｎａ２ＳＯ４（广东广州化学试剂分公司），（ＮＨ４）２ＳＯ４（广东汕头西陇化工厂），其余试剂均为分析纯．超声波细胞粉碎机（浙江宁波新芝生物科技有限公司），高速低温离心机（德国赫姆勒实验室仪器），电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），四联磁力搅拌器（江苏金坛江南仪器厂），紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）．１．２ 实验方法１．２．１ 地木耳细胞破碎 称取２ｇ地木耳粉于１００ｍＬ的磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，ｐＨ＝７）中，在超声波细胞粉碎机中破碎（冰浴条件下，全程时间２０ｍｉｎ，工作间歇时间９ｓ，超声时间６ｓ，温度保护３０℃）．将破碎后的地木耳细胞悬浊液于１０ ０００ｒ·ｍｉｎ－１，４℃的冷冻离心机中离心２０ｍｉｎ后取出抽滤，加入磷酸盐缓冲液定容至４００ｍＬ，所得清液即为含有藻蓝蛋白的粗提液，测定其中的藻蓝蛋白质量浓度．１．２．２ 双水相萃取实验 量取２０ｍＬ粗提液于具塞锥形瓶中，加入定量ＰＥＧ ４０００和硫酸盐，常温下在磁力搅拌器上搅拌一定时间，取出溶液于分液漏斗中静置、分层，将上相溶液移至１０ｍＬ刻度试管 收稿日期： ２０１０－１１－１８ 通信作者： 甘林火（１９７９－），女，讲师，主要从事天然产物和氨基酸的分离提取及制备的研究．Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｈｇａｎ＠ｈｑｕ．ｅｄｕ．ｃｎ． 基金项目： 华侨大学科研基金资助项目（０８Ｘ０２１１＊）中，测上相体积；同时采用可见分光光度法测定上下相溶液中藻蓝蛋白质量浓度．１．２．３ 藻蓝蛋白的测定与计算 藻蓝蛋白最大光吸收在６２０ｎｍ附近，因此藻蓝蛋白质量浓度可根据Ｋａｐｌａｎ等［８］采用的方法进行测定，即ρ（ＰＣ）＝（Ｄ（６２０）－０．４７４Ｄ（６５０））／５．３４．（１）式（１）中：ρ（ＰＣ）为藻蓝蛋白的质量浓度（ｇ·Ｌ－１）；Ｄ（６２０），Ｄ（６５０）分别为波长在６２０，６５０ｎｍ处的光密度值．藻蓝蛋白萃取率（η）和分配系数（Ｋ）的计算公式为η＝（ρｔ（ＰＣ）×Ｖｔ／ρ０（ＰＣ）×Ｖ０）×１００％，（２）Ｋ＝ρｔ（ＰＣ）／ρｂ（ＰＣ）．（３）式（２），（３）中：Ｖ为溶液体积（ｍＬ）；下标０，ｔ，ｂ分别代表藻蓝蛋白破碎，萃取后双水相体系上相和下相．２ 结果与讨论２．１ 萃取时间对萃取ＰＣ的影响量取２０ｍＬ粗提液于具塞锥形瓶中，分别配制１２％的ＰＥＧ ４０００和１５％的Ｎａ２ＳＯ４，与ＰＥＧ ４０００形成双水相体系［９］．常温下在磁力搅拌器上搅拌，考察萃取时间对双水相萃取法富集分离地木耳中藻蓝蛋白的影响．实验结果表明：当萃取时间分别为１０，２０，３０，４０ｍｉｎ时，萃取率分别为２９．５％，４８．３％，７９．１％和７６．９６％．由此可知，随着萃取时间的增长，藻蓝蛋白萃取率先逐渐增大，在３０ｍｉｎ后趋于稳定．表明，３０ｍｉｎ时双水相萃取达到平衡，故萃取时间选为３０ｍｉｎ．２．２ 硫酸盐种类对萃取ＰＣ的影响分别配制１２％的ＰＥＧ ４０００和１５％的Ｎａ２ＳＯ４双水相体系，１２％的ＰＥＧ ４０００和１５％的（ＮＨ４）２ＳＯ４双水相体系．常温下搅拌３０ｍｉｎ，考察双水相体系中不同硫酸盐对双水相萃取法富集分离地木耳中藻蓝蛋白的影响．实验结果表明：当双水相组分为Ｎａ２ＳＯ４时，萃取率为８０．４９％，分配系数为４．５８０ ３％；当双水相组分为（ＮＨ４）２ＳＯ４时，萃取率为７４．５４％，分配系数为２．１８４ ２％．由此可见，无论是藻蓝蛋白的萃取率还是分配系数，含Ｎａ２ＳＯ４的双水相体系都要高于含（ＮＨ４）２ＳＯ４的双水相体系．综上所述，实验采用ＰＥＧ ４０００／Ｎａ２ＳＯ４双水相体系来富集提取地木耳中藻蓝蛋白．表１ ＰＥＧ ４０００质量分数对萃取ＰＣ的影响Ｔａｂ．１ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍａｓｓ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆＰＥＧ ４０００ｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣｗ（ＰＥＧ ４０００）／％Ｖｔ／ｍＬη／％Ｋ６ ４．２ ５３．５６ ８．３７１ ９８ ５．０ ６７．４５ １０．２９７ ８１０ ５．８ ７５．８２ １１．２９２ ７１２ ６．６ ７９．３６ ９．５７０ ４１５ ７．４ ８４．６８ ６．１８２ ５２．３ ＰＥＧ ４０００质量分数对萃取ＰＣ的影响分别配制不同质量分数的ＰＥＧ ４０００和１５％的Ｎａ２ＳＯ４双水相体系，常温下搅拌３０ｍｉｎ，考察ＰＥＧ４０００质量分数（ｗ（ＰＥＧ ４０００））对分离藻蓝蛋白的影响，结果如表１所示．从表１可以看出，随着ＰＥＧ ４０００质量分数的增大，藻蓝蛋白的萃取率呈现逐渐增大的趋势，而藻蓝蛋白的分配系数则是先增大后减小．聚合物浓度是影响双水相萃取的重要因素之一．随着ＰＥＧ ４０００浓度的增大，双水相体系离成相临界点的距离增大，系线长度增加，两相性质的差别（疏水性等）增大，界面张力也随之增大，水溶性的藻蓝蛋白越容易分配到一相中去．因此，藻蓝蛋白的萃取率在不断提高．但是，上相体积也在逐渐增大，分配系数就不是单调变化的．结合η和Ｋ值进行综合分析，实验选取ＰＥＧ ４０００质量分数为１２％的双水相体系．２．４ Ｎａ２ＳＯ４质量分数对萃取ＰＣ的影响分别配制不同质量分数的Ｎａ２ＳＯ４和质量分数为１２％的ＰＥＧ ４０００双水相体系，常温下搅拌３０ｍｉｎ．考察Ｎａ２ＳＯ４质量分数（ｗ（Ｎａ２ＳＯ４））对集分离藻蓝蛋白的影响，结果如图１所示．从图１可见，随着Ｎａ２ＳＯ４质量分数的增大，藻蓝蛋白的收率呈先增大后减小的趋势，但总体变化不显著．在ＰＥＧ／Ｎａ２ＳＯ４双水相体系中，Ｎａ２ＳＯ４质量分数选取１５％．２．５ 离子强度对萃取ＰＣ的影响２．５．１ ＮａＣｌ质量分数对萃取ＰＣ的影响 配制质量分数为１２％的ＰＥＧ ４０００和１５％的Ｎａ２ＳＯ４双水３７６第６期 甘林火：双水相萃取法富集分离地木耳中的藻蓝蛋白相体系，分别加入不同质量分数的ＮａＣｌ于溶液中，常温下搅拌３０ｍｉｎ．考察ＮａＣｌ质量分数（ｗ（ＮａＣｌ））对分离藻蓝蛋白的影响，结果如图２所示．从图２可知，当ＮａＣｌ质量分数增大时，在实验选取的范围内，藻蓝蛋白的萃取率有所降低且降幅较小，最大降幅在１０％左右．述，在萃取时间为３０ｍｉｎ，ＰＥＧ ４０００质量分数为１２％，Ｎａ２ＳＯ４质量分数为１５％，加入ＫＣｌ质量分数为１％，ｐＨ值为３．０的最优工艺条件下，利用ＰＥＧ ４０００和Ｎａ２ＳＯ４双水相体系对地木耳中藻蓝蛋白进行富集分离，其萃取率为９５．２％．采用该法测定富集相中藻蓝蛋白的纯度，结果可达４．８，达到了普遍认可的商业化标准．３ 结束语采用ＰＥＧ／Ｎａ２ＳＯ４双水相体系萃取分离地木耳中藻蓝蛋白，具有含水量高，不会引起生物活性物质失活或变性［１１］，易于工艺放大和连续操作，与后续提纯工序可直接相连接而无需进行特殊处理，不存在有机溶剂残留问题，对人体无害等突出的优点，同时具有分离和浓缩的效果．由此可见，工艺具有良好的工业开发前景．参考文献：［１］ 李三相，张海林，杨亚军．地木耳中藻蓝蛋白的分离与纯化［Ｊ］．天水师范学院学报，２００８，２８（２）：３８－３９．［２］ ＰＡＴＥＬ Ａ，ＭＩＳＨＲＡ Ｓ，ＰＡＷＡＲ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃ－ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ ｆｒｏｍ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｍａｒｉｎｅ ａｎｄ ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ ｈａｂｉｔａｔ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ Ｐｕｒｉｆ，２００５，４０（２）：２４８－２５５．［３］ 王勇，钱凯先，董强．高纯蓝蛋白分离纯化及光谱特性研究［Ｊ］．生物化学与生物物理进展，１９９９，２６（５）：４５７－４６０．［４］ ＡＬＢＥＲＴＳＳＯＮ Ｐ Ａ．Ｐａｒｔｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅ－ｃｕｌｅｓ［Ｍ］．２ｎｄ ｅｄ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｓｏｎｓ，１９８６．［５］ 谢海．双水相萃取技术研究现状［Ｊ］．化学工业与工程，２００６，２３（５）：４６３－４６５．［６］ 刘杨，王学青，庞广昌，等．双水相萃取法富集分离螺旋藻藻蓝蛋白的研究［Ｊ］．海洋科学，２００８，３２（７）：３０－３２．［７］ 陈钧辉，陶力，李俊，等．生物化学实验［Ｍ］．北京：科学出版社，２００３．［８］ ＫＡＰＬＡＮ Ｄ，ＣＡＬＶＥＲＴ Ｈ Ｅ，ＰＥＴＥＲＳ Ｇ Ａ．Ｔｈｅ ａｚｏｌｌａ－ａｎａｂａｅｎａ ａｚｏｌｌａｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ（Ⅻ）：Ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄ ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ ａｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅａｆ ａｇｅ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９８６，８０（４）：８８４－８９０．［９］ 冯菁，夏杰，陆兵，等．人溶菌酶的双水相萃取法分离［Ｊ］．华东理工大学学报：自然科学版，２００６，３２（１２）：１４０９－１４１２．［１０］ 殷钢，刘铮，刘飞，等．钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分离纯化及特性研究［Ｊ］．清华大学学报：自然科学版，１９９９，３９（６）：２０－２２．［１１］ 李夏兰，王丽娜．用ＰＥＧ／（ＮＨ４）２ＳＯ４双水相体系萃取糖化酶［Ｊ］．华侨大学学报：自然科学版，１９９６，１７（４）：４０７－４１０．Ａｑｕｅｏｕｓ Ｔｗｏ－Ｐｈａｓｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎｄＳｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ ｆｒｏｍ ＮｏｓｔｏｃＧＡＮ Ｌｉｎ－ｈｕｏ（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｕａｑｉａｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｑｕａｎｚｈｏｕ ３６２０２１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ ｆｒｏｍ ｎｏｓｔｏｃ ｃｅｌｌ ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｓ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｕｎｄｅｒ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ ４０００）／ｓｕｌｐｈａｔｅ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ－ｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ ｏｎｅ ｓｔｅｐ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｉｍｅ，ｔｙｐｅ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆｓｕｌｐｈａｔｅ，ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＥＧ ４０００，ｉｏｎｉｃ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ａｎｄ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｒｅｓｐｅｃ－ｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ ｆｒｏｍ ｎｏｓｔｏｃ ｗａｓ ９５．２％ａｎｄ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ４．８，ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉ－ｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ ３０ｍｉｎ，Ｎａ２ＳＯ４ｍａｓｓ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ １５％，ＰＥＧ ４０００ｍａｓｓ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ１２％，ＫＣｌ ｍａｓｓ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ １％ｗｉｔｈ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｏｆ ３．０．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ｎｏｓｔｏｃ；ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ；ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ；ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ－ｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（责任编辑：黄晓楠 英文审校：刘源岗）５７６第６期 甘林火：双水相萃取法富集分离地木耳中的藻蓝蛋白。
藻胆蛋白质的提取纯化与生物活性研究进展
上述的各种细胞破碎的方法 都有一定的局限
性 , 实际生产中 , 上述几种方法经常混合使用 , 以最 大的限度破碎藻体细胞 , 使藻胆蛋白溶出 。 1.3 提取方法 1.3.1 盐析法 将大量盐加到蛋白质溶液中 , 蛋白 质胶粒凝结并沉淀析出 , 因此向细胞破碎液中加入 盐溶液使蛋白质沉 淀析出 。 Ｓｉｅｇｅｌｍａ等 [ 22] 研 究表 明用 25%硫酸铵可将藻红蛋白沉淀出 , 用 30%硫酸 铵可将藻蓝蛋白沉淀出 , 再用 50%硫酸铵可将别藻 蓝蛋白沉淀出 ;而也有研究者 [ 7] 认为 30%和 50%硫 酸铵盐析出的沉淀物中 , 藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的 比例几乎一样 , 即无法用硫酸铵盐析将藻蓝蛋白和 别藻蓝蛋白分开 。 陈芳等[ 19] 用 50%的硫酸铵盐析 条斑紫菜中的藻胆蛋白 。 该法使用简单方便 , 但不 利于以后的分离纯化 。 1.3.2 等电点沉淀法 汤朝晖等 [ 18] 用该法沉淀得 到了混有 3种藻胆蛋白的混合物 , 并研究了藻胆蛋 白在不同 ｐＨ值下的稳定性 , 认为藻胆蛋白对 ｐＨ值 较敏感 。 藻胆蛋白对 ｐＨ敏感 , 使 用该法时需注意 ｐＨ引起藻胆蛋白的变性 。 1.3.3 超滤法 运用超滤膜过滤藻胆蛋白提取液 , 获得藻胆蛋白粗制品 。 用 ＮａＮＯ3高渗 -超滤法分离 提纯藻胆蛋白 , 超滤时选用聚砜膜 , 在超滤过程中 , 无机盐和小分子蛋白质 , 包括小分子的藻毒素透过 滤膜而去掉 , 特别适用于易产生水华的微囊藻脱毒 , 提高产品的安全性 。 ＮａＮＯ3高渗 -超滤法是 提取藻 胆蛋白的简单易行的方法 [ 22, 23] 。 用此法提 取的藻 胆蛋白是安全无毒的 , 且易于纯化 , 脱水方便 , 产品 易于干燥 。
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度谭一心一、实验目的学习并掌握提取、纯化藻蓝蛋白及紫外可见光谱仪检测纯度的方法。
二、实验原理1冻融法：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。
如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀破碎。
2盐析法：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）。
盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集，并从溶液中析出。
3DEAE—纤维素：二乙基胺乙基纤维素，总交换量0.9meq/g功能基：二乙基胺乙基，弱碱性阴离子交换剂。
原理：含有某些功能基团，可以进行离子交换，性能比一般离子交换树脂温和，适用于分离具有生物活性的大分子，可以将性质相近的大分子物质分开。
1.装柱：装柱前先将层析柱垂直固定在支架上。
装柱的方法分干装和湿装两种。
干装是直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂，此法不易将气泡排尽。
湿装法是先加适量溶剂到柱中，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中，打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液缓缓下降到需要的高度，吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，以防气泡产生。
2.加样：经过平衡的层析柱当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。
加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2（体积越小越有利于提高分辨率）。
3.洗脱：待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂（5cm），并在柱上端与装有洗脱剂的储液瓶连接开始洗脱。
同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集（按体积或时间分管收集）。
4.测定：随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白纯度-2
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白纯度-23.结果分析:实验测得的藻蓝蛋白纯度只有0.509，比较我们班其他组的结果相差不算太大，但其他班有的组测得藻蓝蛋白得纯度可达到 1.7左右，相对于这个纯度，我们所提取得藻蓝蛋白纯度时偏低的，影响藻蓝蛋白纯度的原因主要有以下几个：1)冻融次数:本实验时采用冻融法破碎细胞，冻融法破碎细胞主要是因为藻体在冻结过程中，细胞内外的液态水形成冰晶体，造成体积膨大，对藻体细胞壁和细胞膜产生破坏作用，使其通透性加大，内容物流出。
藻体冻结过程中首先是从最容易生成细小冰晶体的地方开始，然后冰晶体逐渐变大，向四周扩展，将距这些地方比较近的细胞壁和细胞膜胀破，压破。
每次冻融最容易生成细小冰晶体的地方是不一样的，即在细胞内外形成冰晶的部位是不同的，这样就能对细胞不同部位的细胞壁和细胞膜产生破坏，因而多次冻融能使破碎效果提高。
冻融时间增加随能使冰晶体变大，但由于受细胞内外水分含量的限制，冰晶的长大使有限度的，因而对细胞壁和细胞膜破坏只是在原有基础上的破坏，破坏区域较少，效果较差，所以冻融时间对冻融效果影响不大。
可见，在冻融法中次数对藻蓝蛋白得率得影响比时间对它得影响大，多次反复冻融的细胞破碎效果比较好。
我们自己只冻融了一次，其余是老师整体冻融的，所以我们冻融方面应与其他组没有多大区别。
2)不同饱和度硫酸铵的盐析效果：实验过程中，饱和度在20％时，没有明显的沉淀，查资料得知，当饱和度在25％以下时，没有明显的沉淀，在25％以上后，随着硫酸铵饱和度的增加，提取率逐步升高。
从纯度看，随着饱和度的升高，纯度先降后升。
实验测得的结果偏低，可能是加入硫酸铵过程中，随着饱和度的增大，杂蛋白，藻红蛋白和别藻蓝蛋白沉淀出的量都在增大，藻蓝蛋白所占的比例减小，所以纯度减小。
由于我们过柱时取的样不是我们组的，所以无法考证是这两种原因引起我们结果偏低，只能说这两种原因对我们所得的藻蓝蛋白纯度会有影响。
藻蓝蛋白的分离纯化及其在食品中的应用
藻蓝蛋白的分离纯化及其在食品中的应用蓝绿藻是一种广泛存在于水体中的微生物，具有丰富的蛋白质，其中具有生物活性的藻蓝蛋白是其重要成分之一。
藻蓝蛋白具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生理功能，在食品领域中的应用也越来越受到人们的关注。
首先，提取藻蛋白是藻蓝蛋白分离纯化的第一步。
一种常用的方法是溶解蓝藻细胞膜，并通过离心等操作将藻蛋白从细胞中分离出来。
然后，可以使用尺寸排除色谱、离子交换色谱和亲和色谱等技术进一步纯化。
这些分离纯化的方法能够去除其他蛋白质和杂质，提高藻蓝蛋白的纯度。
藻蓝蛋白在食品中的应用有许多潜力。
首先，在抗氧化方面，藻蓝蛋白具有很高的自由基清除能力，可以减少食品在贮存和加工过程中的氧化反应，延长食品的保鲜期。
另外，藻蓝蛋白还能够稳定食品中的颜色，使颜色更加鲜艳。
这一特性使得藻蓝蛋白可以广泛应用于饮料、糕点等食品中，提高产品的市场竞争力。
其次，藻蓝蛋白还具有抗炎和抗肿瘤的作用。
研究发现，藻蓝蛋白能够抑制炎症反应中的炎症介质释放，从而减轻炎症反应对人体的伤害。
在食品加工过程中，添加藻蓝蛋白可以减少食品中的致炎物质的生成，提高食品的健康性。
此外，藻蓝蛋白还具有一定的抗肿瘤活性，可以用于开发新型的抗肿瘤功能性食品。
除此之外，藻蓝蛋白在食品领域中的应用还包括改善食品的营养价值和口感。
藻蓝蛋白中富含的氨基酸和多种微量元素可以提高食品的营养价值。
同时，藻蓝蛋白还具有一定的凝胶特性，在食品中可以改善质地和口感，提高食品的口感感受。
然而，尽管藻蓝蛋白在食品中的应用潜力巨大，但也面临一些挑战。
首先，藻蓝蛋白的生产成本较高，加上其稳定性和保存性能较差，限制了其在食品中的广泛应用。
其次，藻蓝蛋白作为一种新型成分，还需要进一步研究其对人体健康的影响，以确保其在食品中的安全性。
综上所述，藻蓝蛋白具有广泛的蛋白质来源、多种生理功能及一定的应用潜力，在食品领域中的研究和开发也取得了一些进展。
随着科学技术的不断发展，相信藻蓝蛋白在食品中的应用将会得到更大的推广和应用。
藻蓝蛋白生产工艺
藻蓝蛋白生产工艺藻蓝蛋白是一种天然的蓝色色素，广泛用于食品、药品和化妆品等领域。
藻蓝蛋白的生产工艺一般包括培养和提取两个步骤。
首先是藻类培养。
选择一种高产藻类作为目标菌株，常用的有蓝细菌和蓝藻等。
蓝藻是一种常见的藻类，具有高产蓝色素的特点。
蓝藻可以在光合作用下自主合成藻蓝蛋白，因此只需提供充足的光照和适宜的培养基即可。
蓝藻的培养一般采用液体培养法或固体培养法。
液体培养法是将蓝藻菌种接种到含有适宜营养物的培养液中，利用搅拌或充气等方法提供充足的氧气和养分，以促进菌株的生长和藻蓝蛋白的合成。
固体培养法是将蓝藻菌种接种到含有固体基质的培养皿或柱中，通过调节温度和湿度等因素，为蓝藻的生长提供适宜的环境条件。
在培养过程中，需要控制培养液的温度、光照强度和光周期等参数，以及添加适当的营养物，如碳源、氮源和矿物盐等。
此外，还要注意防止外源污染和细胞自身的寄生菌感染等问题。
培养达到一定程度后，即可进行藻蓝蛋白的提取。
提取工艺一般包括细胞破碎、离心和过滤等步骤。
首先将培养液中的藻藻菌株离心下沉，然后通过破碎细胞壁的方法将细胞内的藻蓝蛋白释放出来。
常用的破碎方法包括超声波破碎和高压破碎等。
接下来，通过离心和过滤等步骤将藻蓝蛋白与细胞碎片、杂质等分离，得到相对纯净的藻蓝蛋白溶液。
最后，对提取得到的藻蓝蛋白溶液进行精制和纯化。
常用的精制方法包括吸附、离子交换和凝胶过滤等。
通过这些方法，可以去除藻蓝蛋白中的杂质和不纯物质，提高藻蓝蛋白的纯度和质量。
总之，藻蓝蛋白的生产工艺包括培养和提取两个步骤。
培养过程中需要控制好培养液的环境参数和添加适宜的营养物，提取过程中需要采用破碎、离心和过滤等方法将藻蓝蛋白与细胞碎片等分离，最后通过精制和纯化等步骤提高藻蓝蛋白的纯度和质量。
藻蓝蛋白 实验报告
藻蓝蛋白的分离与纯化姓名：郭均学院：食品与生物工程班级：食安 09-2学号：200906041069藻蓝蛋白的分离与纯化一、实验目的和要求1、了解藻蓝蛋白的生理意义及功能，藻蓝蛋白的一般提取和纯化的方法；2、掌握蛋白含量测定方法；3、掌握盐析和离子交换层析纯化蛋白的分析技术。
二、实验原理藻蓝蛋白（PC）是一类普遍存在于藻蓝蛋白中的光合辅助色素，也是一种天天然色素蛋白，具有水溶性，可用作视频着色剂。
此外，它具有强烈的荧光，在分子生物学上被制成荧光探针，是一种无毒、无副作用的理想光敏剂。
藻蓝蛋白还具有重要的医疗价值，不但能提高机体的非特异性免疫功能，而且对特异性免疫功能有促进作用。
另外它还有清除自由基的能力，可以抗疲劳，延缓衰老，对人体的生理功能有重要的生物学意义。
利用盐析沉淀蛋白质的基本原理：盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸收水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可以中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。
由于各种蛋白颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低盐浓度各不相同。
研究表明可用25%硫酸铵饱和度沉淀除去杂质，55%硫酸铵沉淀藻蓝蛋白。
盐析出来的蛋白质，需通过脱盐以除去硫酸铵等盐类物质。
最常用脱盐的方法是透析。
蛋白质是大分子物质，它不能透过半透膜，故不断更换蒸馏水或缓冲液可将盐类等小分子杂志透析掉。
蛋白质含量测定有紫外分光光度计法和显色法（Folin-酚法、考马斯亮蓝法等），本实验采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的含量，考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用后变为蓝色，最大光吸收由465nm变为595nm，在一定范围内，蛋白质含量与595nm处吸光值成正比。
离子交换层析法纯化蛋白质，常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素（CM纤维素），阴离子交换剂有弱碱性的二乙胺基乙基纤维素（DEAE-纤维素）。
藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)
藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)藻蓝蛋白(phycocyanin , PC)是一种存在于蓝藻细胞内的光合色素 ,能高效捕获光能。
其分子质量在 40 ku 左右 ,由α、β两个亚基组成 ,亚基分子质量都在 20 ku 左右。
肽链上共价结合 1 个开链的四吡咯环辅基 ,类似动物红细胞的血红素结构。
天然存在的藻蓝蛋白通常以六聚体(αβ) 6的形式存在。
与之相近的别藻蓝蛋白(Anthocyanin ,APC)为三聚体( αβ) 3 ,在 650 nm 处有最大吸收峰。
分离纯化的水溶藻蓝蛋白在溶液中呈蓝色 ,并发出紫色荧光 ,在波长620 nm 具有特异吸收峰 ,可用吸光度 A 620 / A 280表示其纯度。
因其水溶性、无毒、清亮且着色力强等优点 ,藻蓝蛋白被广泛用于食品着色剂和化妆品的添加剂。
藻蓝蛋白带有荧光 ,可用作荧光标记物。
一、教学目的通过藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子制备方案设计与实践研究，体验从复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、过程和方法。
整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64-80学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的动手机会。
有利于培养学生的学习兴趣。
二、实验方案1材料与方法1. 1 实验材料钝顶螺旋藻粉产自中国科学院武汉植物所 ,其他无机盐和酸碱试剂均为国产分析纯试剂。
1. 2 分析方法1.2.1藻蓝蛋白浓度的测定方法一：【曲文娟等，钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的脉冲超声辅助提取技术，食品科学，2007年5期，135-138】用紫外分光光度计对粗提的藻蓝蛋白溶液进行全波段扫描, 可见藻蓝蛋白的特征吸收在620nm, 异藻蓝蛋白的特征吸收在:方法二：【刘杨等，水提分离钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其稳定性研究，天津师范大学学报(自然科学版)，Vol.28 No.3.11-14（2008）】 螺旋藻中以藻胆蛋白吸收光谱的差异作为其测定标准。
藻蓝蛋白的提取与纯化
螺旋藻粉提取藻蓝蛋白摘要：藻蓝蛋白是一种可用于配制化妆品及各种天然食品或荧光探针标记的多用途蛋白。
本实验旨在找出最适螺旋藻粉中提取藻蓝蛋白的工业提取工艺。
对藻蓝蛋白的提取，本课题组采用了反复冻融法、水提法、缓冲液法，以找出提取效率高，成本低的方法。
实验结果显示，反复冻融三次的藻蓝蛋白浓度A620/A280分别为：0.819/1.871、0.597/1.676、0.245/0.629;水提法三次的A620/280分别为：0.842/1.768、0.650/1.136、0.177/0.737;缓冲液提取三次的A620/A280分别为：1.040/2.102、0.260/0.630、0.052/0.247。
在蛋白质的分离时，采用两步盐析法，盐析前A620=1.143，A280=1.983；两步盐析后，A620=2.203，A280=1.492。
最后在纯化方法上选择了羟基磷灰石柱分离，得到蛋白样品A620=1.379，A280=0.528。
关键词：螺旋藻；藻蓝蛋白；二次盐析；柱分离介绍：藻蓝蛋白既是一种蛋白质，又是一种很好的天然食用色素，同时又是极好的保健食品。
藻蓝蛋白是自然界中少见的色素蛋白之一，不仅颜色鲜艳，而且本身是一种营养丰富的蛋白质，其氨基酸组成齐全，必需氨基酸含量高。
藻蓝蛋白具有抗癌、促进血细胞再生、养护卵巢、促使人体内合成弹力蛋白等功效。
21世纪初，在欧美、日本等国，藻蓝蛋白广泛用作食品和化妆品的高级天然色素，并被制成生化药品。
因为藻蓝蛋白为胞内蛋白，所以细胞破碎技术是直接影响蛋白提取得率的关键因素之一。
藻蓝蛋白的提取一般有超声波、高压均质、反复冻融、水提法、缓冲液提法等【1】。
本实验通过反复冻融、水提法和缓冲液法对螺旋藻细胞进行破碎提取藻蓝蛋白，对各条件下得到的蛋白溶出率进行了比较分析，确定了各条件下蛋白提取的最佳条件。
在藻蓝蛋白的分离时，主要是把蛋白质与提取液中其他物质分离。
可利用蛋白质的盐析【2】，和调节PH使蛋白变性等，使蛋白质从提取液中分离出来；最后，再把藻蓝蛋白从杂蛋白中分离出来，常用的方法有柱分离法等【3】。
地木耳多糖的提取与纯化研究
地木耳多糖的提取与纯化研究张唐伟;柳青海;李天才【摘要】对地木耳采用水提醇沉法获得的地木耳多糖粗提取物,采用Sevage法脱蛋白质、醇沉,干燥得粗多糖,进一步用DEAE-52纤维素柱层析分离纯化,用纸色谱和琼脂糖凝胶电泳对洗脱组分进行纯度鉴定.结果表明:Sevage法脱蛋白7次可脱除94%的蛋白质,多糖得率为13.75%.DEAE-52纤维素柱层析后得到10种组分,浓缩干燥后得到白色粉末状多糖组分,每个组分经过纯度鉴定后均为单一的多糖.选择水和NaCl溶液为洗脱剂的温和条件分离纯化多糖效果较好.【期刊名称】《中国野生植物资源》【年(卷),期】2011(030)003【总页数】4页(P34-37)【关键词】地木耳;地木耳多糖;柱层析;分离;纯化【作者】张唐伟;柳青海;李天才【作者单位】中国科学院西北高原生物研究所,青海西宁810008;中国科学院研究生院,北京100049;中国科学院西北高原生物研究所,青海西宁810008;中国科学院研究生院,北京100049;中国科学院西北高原生物研究所,青海西宁810008【正文语种】中文【中图分类】R284.2地木耳 (Nostoc comm uneVauch)俗称地皮菜、地耳、鼻涕肉、地踏菜、地软、地衣、地捡皮等,为藻类蓝藻纲念珠藻科 (Nostocaceae)念珠藻属植物念珠藻(Nostoc comm uneVauch)的藻体。
它与发菜 (N.flagellifor m e)、葛仙米(Nostoc sphaeroidesKutzing)为同属植物[1]。
自然生长的地木耳为草绿色,粘球状,植物体常集合形成肉眼可以看见有胶状球形或不规则的扩展群。
地木耳不耐干旱,在干旱脱水后,藻体呈叶状薄片,易碎裂,潮湿吸水后又呈不规则形的隆起,裂叶状扩展,深绿色。
地木耳的藻丝在胶鞘内无规则地排列,在藻体的繁殖发育期有异形胞存在[2]。
地木耳是世界广生种,主要分布在石灰石区和喀斯特岩溶地带。
藻蓝蛋白提取工艺
藻蓝蛋白提取工艺嘿，朋友们！今天咱就来唠唠藻蓝蛋白提取工艺这档子事儿。
你说这藻蓝蛋白啊，就像是大海里藏着的宝贝。
要把它给弄出来，那可得有点门道呢！咱先得找到合适的藻类来源，这就好比要去果园里找最甜的果子，得精挑细选才行。
然后呢，就是一系列的操作啦。
把藻类弄回来，就开始清洗啦，得把那些杂质啥的都洗掉，就像给它洗个舒舒服服的澡。
接下来就是破碎这一步，把藻类给弄碎，让藻蓝蛋白能跑出来。
这就好像是打开一个宝库的大门。
然后呢，就是提取啦！这可是关键的一步。
就好像是从一堆沙子里淘出金子一样，得有耐心，还得有技巧。
要用合适的溶剂，慢慢把藻蓝蛋白给弄出来。
提取完了可还不算完事儿，还得进行纯化呢！把那些不要的东西都去掉，只留下纯净的藻蓝蛋白。
这就好比是把宝石从一堆乱石里挑出来，还得给它打磨得亮晶晶的。
你想想，经过这么多步骤，最后得到那纯净美丽的藻蓝蛋白，是不是很有成就感？这过程可不比寻找宝藏容易啊！在这个过程中，每一步都很重要，就像链条上的一环扣一环，哪个环节出了问题都不行。
要是清洗不干净，那后面提取出来的藻蓝蛋白能纯吗？要是破碎不到位，藻蓝蛋白能顺利跑出来吗？而且啊，不同的藻类，提取的方法可能还不太一样呢！这就更得考验我们的本事啦。
咱得根据实际情况，灵活调整方法，就像打仗一样，得随机应变。
说真的，藻蓝蛋白的提取工艺真的很神奇，也很有趣。
当你看到那一点点被提取出来的藻蓝蛋白，你会觉得之前的所有努力都值了！这就是科学的魅力啊，能让我们从平凡的事物中发现不平凡的东西。
所以啊，朋友们，别小看了这藻蓝蛋白提取工艺，这里面的学问大着呢！咱们可得好好研究，好好探索，说不定还能发现更多有趣的东西呢！这藻蓝蛋白可是个宝，就看我们怎么去挖掘啦！。
藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)
藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)藻蓝蛋白(phycocyanin , PC)是一种存在于蓝藻细胞内的光合色素 ,能高效捕获光能。
其分子质量在 40 ku 左右 ,由α、β两个亚基组成 ,亚基分子质量都在 20 ku 左右。
肽链上共价结合 1 个开链的四吡咯环辅基 ,类似动物红细胞的血红素结构。
天然存在的藻蓝蛋白通常以六聚体(αβ) 6的形式存在。
与之相近的别藻蓝蛋白(Anthocyanin ,APC)为三聚体( αβ) 3 ,在 650 nm 处有最大吸收峰。
分离纯化的水溶藻蓝蛋白在溶液中呈蓝色 ,并发出紫色荧光 ,在波长620 nm 具有特异吸收峰 ,可用吸光度 A 620 / A 280表示其纯度。
因其水溶性、无毒、清亮且着色力强等优点 ,藻蓝蛋白被广泛用于食品着色剂和化妆品的添加剂。
藻蓝蛋白带有荧光 ,可用作荧光标记物。
一、教学目的通过藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子制备方案设计与实践研究，体验从复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、过程和方法。
整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64-80学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的动手机会。
有利于培养学生的学习兴趣。
二、实验方案1材料与方法1. 1 实验材料钝顶螺旋藻粉产自中国科学院武汉植物所 ,其他无机盐和酸碱试剂均为国产分析纯试剂。
1. 2 分析方法1.2.1藻蓝蛋白浓度的测定方法一：【曲文娟等，钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的脉冲超声辅助提取技术，食品科学，2007年5期，135-138】用紫外分光光度计对粗提的藻蓝蛋白溶液进行全波段扫描, 可见藻蓝蛋白的特征吸收在620nm, 异藻蓝蛋白的特征吸收在:方法二：【刘杨等，水提分离钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其稳定性研究，天津师范大学学报(自然科学版)，Vol.28 No.3.11-14（2008）】 螺旋藻中以藻胆蛋白吸收光谱的差异作为其测定标准。
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将上 加人固体 ( 助 多 清液 N 0准之达 %饱和， 搅 5 2 充分 拌， 静置30而n，1侧 9下冷冻离心30 i ，弃去离心管底 x幻 mn 部沉淀。 上清液中 继续加人 (N 多 使之达到 %饱和， ) 4 H o ’ 5 充分 搅拌， Z ， 静置 然后在1以 9下离心3腼i ， b xx〕 n 弃去上清 液， 沉淀即 蓝蛋白 ( 一 y o ya i ， ) 和 蓝蛋白 为藻 C Pcc nn P h C 别藻
1.2 3 盐析 .
层析 (HA层析) ， 用磷酸盐缓冲液洗脱 (PBS 后， ) 得到了 藻蓝蛋白 (P ) 和别藻蓝蛋白 (A c ) 的洗脱峰。洗脱的 c P 顺序为藻蓝蛋白 在前， 别藻蓝蛋白 在后。
1.3 纯度鉴定
收稿日期: 20 8刁3一 0 0 2 作者简介: 李三相 ( 1 7卜) ， 9 男， 甘肃静宁人，天水师范学院生命科学与化学学院讲师， 硕士。
A0 ycn A ( 1 户 o y in， ) 的 合 。 淀 00 m讥的 酸 c c P 混 物 沉 用1 o 磷 .
缓冲液(P S) 溶解( 含0.02mol NaCI及0.( lmol EDTA) ， B L l ) X L l
定溶至一定体积， 加人固体 (NH4 多 使其浓度达2 %， ) o ’ 6 充 分搅拌， 印 in， 卫 静置 m 10以〕 9离心10m 弃去沉淀。 in， 继 续加人 (N坳 多 达3 %饱和，静置Z 仪 〕 . 0 5 h，1 众9下离心 0 n 1 mi ，沉淀即为藻蓝蛋白 (P ) 。用同样的方法，再以 C
液 (分 10、 50、 0 、 o lllm 别为 20: 1 Z o泥， 人 o 比并加 0.lm
N l 梯度洗 洗脱速度为 sm ， c a ) 脱， . / 4 l 分步收集洗 h 脱液， 每
管4祖，立即测定2 0 m下的 A值，当A、 鉴 0 时，更换 8 n . 02 离子浓度较高的缓冲液洗脱。 场 卜 1.2 6 经基磷灰石层析 (HA层析) .
将上面盐析处理后的藻蓝蛋白粗提液做经基磷灰石柱
1.2.1 细胞破碎
取地木耳干粉3 ， 9 加人0 o lm 比的磷酸盐缓冲液 . o
(pBS， ) 45n ，在一 pH7.0 l i 20℃冷冻25而n，然后在30℃下解 冻1 而n. 重复上述操作5次。 5
1.2 2 水溶性蛋白的提取 .
将破碎的细胞悬液在冷冻离心机上离心4 m n (代 ， 5i 2侧 9)， 沉淀， x旧 弃去 上清液在 以 9下离心 n， 沉 5 2 力 印而 弃去 淀。上清液即为水溶性蛋白溶液。
26%~3 %的硫酸按饱和度沉淀PC 所得沉淀用少量0 o l m心 5 .
L (pH7 0 的 S缓冲 溶 以 离心 度 保持 斗 .) P B 液 解。 上 温 均 在 ℃
以内。 1.2 4 透析 .
将上述蛋白质溶液加人透析袋中，在0 o lm 巩印 . o H .) 7 0 的磷酸盐缓冲液中透析 (0.0 m 巩 N I 及0 o l m0U 2o aC . L EDT ) ， A 每隔sh更换一次缓冲液。
摘 要: 运用经墓磷灰石的柱层析方法，对陆生蓝藻地木耳中的藻蓝蛋白 进行了 分离，用透析方法进行了 纯化， 利用紫外可见分光光度计测得藻蓝蛋白的 提取率为 3 %. . 05 关键词: 地木耳; 分离纯化; 藻蓝蛋白 文章编号: 16 1一 5 (2( 8 0 一 s 02 7 11 3 ) X ) 2 加38e 中图分类号: Q949.22+ 5 文献标识码
20 8 年 3 月 0 第2 卷 第2 期 8
夭水师范学院学报 Jour l o Tianshui Nor a Univ r ity na f ml e s
Ma . ， r 2008
Vo .2 8 No .2 l
地木耳 中藻蓝蛋 白的分离与纯化
李三相， 张海林， 杨亚军
(天 水师范 学院 生命科 化学学院， 学与 甘肃 天 7 10 1 水4 0 )
基金项目: 甘 肃省自 然基金、 青年基金 “ 校内 蓝藻中 生 分 鉴 此生 内 菌的 离 定和 代谢物 分析”( 2，51一 3 〕 A25刁26 阶 成果 ) 段性
38
取粗的藻蓝蛋白和纯化的藻蓝蛋白，稀释处理后放人
石英比色皿中在240nm一X n 波长范围内测其吸收光谱。阴 7( m )
1.2 5 藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的分离 .
， 研究材料和方法
L l 材料
在甘肃省天水市南山上采集新鲜地木耳，洗干净后用 纱布轻压去掉水分， 0 ℃ h 烘干， 烘箱3 48 后制成干粉待用。
1.2 方法
先将经基磷灰 石粉末用pH6 8 的lmm。 磷酸缓冲液浸 . 比 泡， 装 装 ( s mx 4 m ， 用3 倍 积的 . 8磷 用湿 法 柱 2 c . c) 再 体 pH6 酸缓冲 洗固 液冲 定相， 使其达到平衡。 门 上样量 2耐， 梯度 浓 PH6 8 的 缓冲 为 用 离子 度的 . 磷酸
地木耳学名普通念珠藻， 是陆生蓝藻中的一种，
叶 素 其 光 线 合 是 胆 (P y o i s )， 绿 b， 捕 天 复 体 藻 体 h c b l o e m 主
要由水溶性的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白等色素蛋白组成。藻
蓝蛋白(P )是一类普遍存在于蓝藻细胞中的光合辅助色素， C 也是一种天然色素蛋白， 具有水溶性， 可用作食品着色剂。 此外， 它具有强烈的荧光，在分子生物学上被制成荧光探 针， 是一种无毒、 无副作用的理想光敏剂。藻蓝蛋白还具 有重要的医 疗价值， 不但能提高机体细胞的非特异性免疫 功能， 而且对特异性免疫功能有促进作用。另外， 它还具 有清除自由基的能力， 可以抗疲劳，延缓衰老， 对人体的 生理功能有重要的生物学意义。 阁 1 近年来， 从蓝藻中提取藻蓝蛋白已成为生物学、食品 工程学、生命保健学等学科研究和开发的一个热点。网 但先 期研究材料均为水生藻类，对于陆生藻类尚未涉及。本文 通过对地木耳中藻蓝蛋白的分离、纯化及鉴定，以期能为 藻蓝蛋白的获取提供了新的方法， 并为地木耳的进一步开