分子生物学实验课件复习过程
分子生物学实验技术ppt课件
(2)DNA样品加热时，碱基堆集作 用减少，同时伴随A260的增加。
(3)能够断裂氢键的试剂对于单链 DNA的碱基堆集作用没有影响．但 是将双链DNA碱基堆集作用减少到 变性DNA的程度。
3．带负电荷的磷酸基的静电斥力
正离子(如Na+) 可以中和带负电荷的磷酸基团，有效地 屏蔽了磷酸基之间的静电斥力，促进了双螺旋结构的稳 定。
分子生物学实验技术
核酸和蛋白质的基本性质 及实验操作注意事项
蛋白质
一、核酸的基本性质
核酸：是以核苷酸为基本组成单位的生物信息大分子。核酸可 以分为脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖核 酸（ribonucleic acid，RNA）两大类。
• 核酸（DNA和RNA）是线性多聚核苷酸， 基本结构单元是核苷酸
增色效应或高色效应(hyperchromic effect)。指变性后DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。DNA分子具有吸收250－ 280nm波长的紫外光的特性，其吸收峰值在260nm。DNA分子 中碱基间电子的相互作用是紫外吸收的结构基础,但双螺旋 结构有序堆积的碱基又“束缚”了这种作用。
变性DNA 的双链解开,碱基中电子的相互作用更有利于紫外 吸收,故而产生增色效应。
碱基位于双螺旋的内侧，
磷酸和核糖在外侧，
现代分子生物学课件
04
重组DNA技术与基因工程
Chapter
重组DNA技术基本原理
重组DNA技术定义
重组DNA技术是指在体外将不同来源的DNA分子进行剪 切、连接，形成重组DNA分子，然后将其导入宿主细胞中 进行复制和表达的技术。
DNA分子剪切
利用限制性核酸内切酶等工具，在特定序列处将DNA分子 切断，形成具有互补粘性末端的DNA片段。
分子生物学特点
分子生物学具有高度的交叉性和综合性，涉及物理 学、化学、数学、计算机科学等多个学科的知识和 方法；同时，分子生物学也具有极强的实验性和创 新性，需要借助各种先进的实验技术和手段来揭示 生物大分子的奥秘。
分子生物学发展历程
早期发展阶段
20世纪初至20世纪50年代，分子生物学的奠基人如沃森、克里克等提出了DNA双螺旋结 构模型，奠定了分子生物学的基础。
。因此，研究基因表达调控机制对于理解疾病发生机理和开发新的治疗
方法具有重要意义。
源自文库
03
DNA损伤与修复机制
Chapter
DNA损伤类型及原因
碱基损伤
由于环境因素（如紫外线、化学 物质）或细胞代谢过程中产生的 活性氧物质导致DNA碱基发生改
变。
单链断裂
DNA单链在受到某些化学物质或 辐射影响时，可能发生断裂。
抵御外界环境压力
生物体在面对紫外线、化学物质 等外界环境压力时，DNA损伤修 复机制能够抵御这些压力对基因 组的破坏作用。
分子生物学实验技术ppt课件
荧光共振能量转移技术
荧光共振能量转移是指两个荧光发色 基团在足够靠近时，当供体分子吸收 一定频率的光子后被激发到更高的电 子能态，在该电子回到基态前，通过 偶极子相互作用，实现了能量向邻近 的受体分子转移（即发生能量共振转 移）。
CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有 相当的重叠，当它们足够接近时，用 CFP的吸收波长激发，CFP的发色基 团将会把能量高效率地共振转移至 YFP的发色基团上，所以CFP的发射 荧光将减弱或消失，主要发射将是 YFP的荧光。
TaqMan作用机理
原位PCR技术原理
由于细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进PCR扩增时， 各种成分（如如引物、DNA聚合酶、核苷酸等）均可进入细 胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或 DNA为模板，与原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大、 或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，从而被保留 在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或 RNA序列在原位以呈指数级扩增，扩增的产物就可以被原位 杂交技术检测出来。
表面等离子共振技术（SPR）
SPR是利用单色偏振光与金属膜内表面店子发生的 等离子共振时，SPR角（反射光强度最小时的入射角） 与金属表面结合的生物分子的质量呈正比，如将“诱饵” 蛋白座位配基，固化在几十纳米的金属膜表面，加入 “猎物”蛋白溶液，这样就可以通过SPR角的改变来反映 “诱饵”蛋白与“猎物”蛋白形成的蛋白质复合物从而反映 二者的相互作用。
分子生物学课件ppt
合成生物学与人工生命
合成生物学
合成生物学是近年来发展迅速的一个领域，旨在通过设计和构建人工生物系统来探索生命的基本规律。合成生物学的 研究范围广泛，包括基因组学、代谢工程、细胞工厂等领域。
人工生命
人工生命是指通过计算机模拟或人工构建的方式创造出来的生命形式。人工生命的研究有助于深入理解生命的本质和 演化规律，同时为解决实际问题提供新的思路和方法。
Western blot实验技术
样品制备
在进行Western blot实验前，需要制备待 检测的样品，包括组织、细胞等。样品制备 过程中需注意保持生物活性。
电泳分离
通过电泳分离技术将蛋白质按分子量大小 分离，为后续的转膜和检测做准备。电泳过 程中需注意保持恒压和恒流。
荧光原位杂交技术
荧光标记探针
荧光原位杂交技术使用荧光标记的探针与 目标DNA或RNA结合，通过荧光信号检测 杂交体。荧光标记探针的选择直接影响实验 结果。
信号检测
杂交后的信号通过荧光显微镜进行检测， 获取杂交体的定位和表达情况。信号检测需
注意排除背景噪声。
基因敲除与转基因技术
基因敲除
基因敲除技术通过特定方法去除或沉默目标基因的表 达，研究基因功能。基因敲除的方法有多种，如 TALEN和CRISPR-Cas9等。
分子生物学前沿研究
表观遗传学研究
01
分子生物学实验讲义_final
实验安排
实验一PCR引物设计
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物的特异性：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
2.避开产物的二级结构区：某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
3.长度：寡核苷酸引物长度为15-30bp，一般为20-27bp。引物的有效长度Ln 值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。
4.G+C含量:G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
5.碱基础随机分布:引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
《分子生物学》实验讲义
实验一叶片Total RNA的提取
RNA操作中的一般要求
在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA 制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。
在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA 酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。
一、防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm 滤膜过滤除菌。
硕士研究生分子生物学实验讲义
硕士研究生分子生物学实验讲义
————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期:
ﻩ
分子生物学实验讲义
(硕士研究生试用)
山西医科大学
基础医学院
生物化学与分子生物学实验室
2010.6
实验一动物组织蛋白质的提取
【目的要求】
1．掌握动物组织蛋白质的提取方法。
2.了解动物组织蛋白质提取的原理。
【实验原理】
由于蛋白质种类很多,性质上的差异很大，即或是同类蛋白质,因选用材料不同,使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中,少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质。蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用,将细胞内蛋白质提取出来,并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些以可溶性的形式存在于体液(如血浆、消化液等)中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。蛋白质经细胞破碎后,用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来,再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。ﻫ【试剂器材】
分子生物学实验讲义
分子生物学基础实验
分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。
实验一质粒DNA的小量制备
一、实验原理
要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。
质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。
分子生物学实验课件讲稿
实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取
一、实验目的
学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。
二、实验材料、设备及试剂
1、实验材料
大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株：R-，M-，Amp-
2、实验设备
恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅
3、试剂
酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素
三、实验步骤
液体LB（Luria-Bertain）培养基配方：
蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml）
酵母提取物(Yeast extraction)0.5% （0.5g/100 ml）
氯化钠 1.0% （1 g/100 ml）
PH 7.0
固体LB培养基：每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉
请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！
(1)每组按上述液体LB培养基配方，以配制100ml的量称取药品放入烧杯。
(2)用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使药品完全溶解后用
100ml量筒定容至100ml。
(3)pH试纸检测pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。
(4)将100ml溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50ml。
(5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中，以配制成两瓶
50ml固体LB培养基。
(6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。
(7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对称方式拧紧锅盖，打开
排气阀通电加热，至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。当高压锅温度（气压）指示器指示锅内温度升高至121℃（0.1Mpa）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高压锅稳定在该温度（压力）下20 min，然后断开电源。待指示器指示压力降为0时，方可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅内物品。
分子生物学实验 ppt课件
酶液 20
20
20
20
20
20
0
底物 6
6
6
6
6
6
6
底物留待即将酶ppt课标件 测定时加
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实验1次序安排
1 超声－离心－保留上清
沉淀－洗涤－离心 - 保留沉淀
2 包涵体溶解－复性----放置冰箱，每次实验测活
3 洗柱、装柱 ：水 1：1介质 平衡50-100 ml
4 洗试管，自然倒扣晾干（纸巾垫）
做时间t—A405曲线，得到斜率， 用公式：酶活=（ΔOD405-Δ自分解）*18231.26*稀释倍数 （此处为1000）（u/ml） （注：ΔOD405为曲线斜率、Δ自分解为如果底物未分解（无黄色），视为0， 否则需要将底物以KPB为对照进行标定） 定量测活与定性测活 （2分钟测一个点）
对每个收集管进行A280与酶活力定性测定
ppt课件
9
酶标定性测活
每组一条酶标版（8孔 单位 uL）
孔号 1
2
3
4
5
6
7
8
破碎 原液 原液 原液 原液 包涵 空白 无
上清 稀释 稀释 稀释 稀释 体复 对照
原液 10倍 100倍 1000 10000 兴液
倍
倍
KPB （磷 174 174 174 174 174 174 194 酸缓 冲液）
分子生物学实验基本技术ppt课件
凝胶电泳
以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺 凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。 其中聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）普遍用于分离蛋白质及 较小分子的核酸。
琼脂糖凝胶孔径较大，对一般蛋白质不起分 子筛作用，但适用于分离同工酶及其亚型，大分 子核酸等。应用较广，介绍如下：
2. 关键: DNA、RNA、Protein
3. 方案: Protein变性
苯酚：强变性
25
氯仿：弱变性
24
异戊醇：消泡分层 1
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方法
样品＋等体积饱和苯酚
10kb以上轻柔混匀；10kb以下振荡
离心（12000×g）
取上清
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核酸相 Protein变性相 有机相
可编辑ppt
用要登记，使用要记录。严格按照说明规范操作各种仪器和使用各种材 料和试剂。对于仪器、重要或危险物品的操作， 必须经他人指导、操作 熟练后才允许独自操作。对氢气等易燃气体和药品应远离火源。
5．实验室物品为实验专用，不得挪作它用或占为私有。任何人未经批准，
不得擅自将实验室的器材、药品等拿回宿舍使用或存放。
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二、 离心技术
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原理
分子生物学复习资料
分⼦⽣物学复习资料
第⼀章绪论
1.经典的⽣物化学和遗传学(现代⽣物学的两⼤⽀柱）
进化论和细胞学说相结合，产⽣了作为主要实验科学之⼀的现代⽣物学，⽽以研究动、植物遗传变异规律为⽬标的遗传学和以分离纯化、鉴定细胞内含物质为⽬标的⽣物化学则是这⼀学科的两⼤⽀柱。
2.孟德尔的遗传学规律最先使⼈们对性状遗传产⽣了理性认识，⽽Morgan的基因学说则进⼀步将“性状”与“基因”相耦联，成为分⼦遗传学的奠基⽯。
3.证明DNA是遗传物质的两个著名实验：
1、Avery的肺炎链球菌转化实验——DNA是遗传信息的载体；
2、Hershey和Chase的噬菌体侵染细菌实验—DNA是可以进⼊寄主细胞的转染因⼦。
4.分⼦⽣物学定义
从分⼦⽔平研究⽣物⼤分⼦的结构与功能从⽽阐明⽣命现象本质的科学，主要指遗传信息的传递（复制）、保持（损伤和修复）、基因的表达（转录和翻译）与调控。
5.⼈类基因组计划
牵头单位：美国能源部、美国国家卫⽣研究所
参加国：美国、英国、德国、法国、⽇本、中国
启动时间：1990年
⼈类基因组计划最初的⽬标：价值达30亿美元的⼈类基因组计划。要测定30亿个碱基对的排列顺序，确定基因在染⾊体上的位置，破译⼈类全部遗传信息。⼈类基因组计划与曼哈顿原⼦弹计划和阿波罗计划并称为三⼤科学计划。
2001年中、美、⽇、德、法、英6国科学家联合公布了⼈类基因组图谱及初步分析结果。
2003年4⽉14⽇，美国联邦国家⼈类基因组研究项⽬负责⼈弗朗西斯·柯林斯博⼠在华盛顿宣布，美、英、⽇、法、德和中国科学家经过13年努⼒共同绘制完成了⼈类基因组序列图，⼈类基因组计划所有⽬标全部实现。
分子生物学实验复习题附答案
分子生物学复习题
实验一DNA的制备
（1）为什么分子生物学实施时要担心EB？
溴化乙锭（Ethidium bromide）是DNA诱变剂，溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。具有高致癌性(接触致癌)
（2）DNA加样缓冲液的用途是什么？
由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
（3）DNA电泳时所用的琼脂糖凝胶其浓度是如何决定的？
1．核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系
（2）琼脂脂糖的浓度不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
琼脂糖浓度与DNA分离范围
琼脂糖浓度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1
（4）琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么
DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子可片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。
分子生物学复习全套课件105P课件 共106页
1910年Morgan利用果蝇 进行遗传学实验，发现了基 因的连锁规律，也证实了遗 传的染色体学说。Morgan因 为“发现了染色体在遗传中 所起的作用，证明了基因位 于染色体上”而获得1933年 的诺贝尔生理学或医学奖。
9
证明DNA是遗传物质的经典实验
直到1944年Avery通过肺炎球菌转化实验证明， DNA可以使生物体的遗传性状发生改变，从而揭 示了转化因子的化学本质。
上一节
本章 目录
31
第4章 DNA的生物合成
32
本章主要内容
• 4.1 DNA复制的概况 • 4.2 原核生物DNA的复制 • 4.3 真核生物DNA的复制 • 4.4 DNA复制的其它方式 • 4.5 DNA复制的高度忠实性 • 4.6 逆转录作用 • 4.7 原核生物DNA复制的调控 • 4.8 真核生物DNA复制的调控
分子生物学是随着遗传学、细 胞生物学和生物化学等学科的发展 兴起的。
在遗传学方面，Mendel 经过7 年的豌豆杂交实验，于1865年发表 了题为Experiments in plant Hybridization(植物杂交实验)的论文 ，总结了基因的分离定律和自由组 合定律两条基本规律。
8
摩尔根及其同事、学生用果 蝇做实验材料。到1925年已经在 这个小生物的四对染色体上鉴定 了约100个不同的基因。并且由 交配试验而确定链锁的程度，可 以用来测量染色体上基因间的距 离。1911年他提出了“染色体遗 传理论”。1933年，摩尔根获得 诺贝尔生理医学奖。
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实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取一、实验目的
学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。
二、实验材料、设备及试剂
1、实验材料
---
AmpMDH5α菌株：R，，大肠杆菌（E. coli）
2、实验设备
恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅
3、试剂
酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素
三、实验步骤
液体LB（Luria-Bertain）培养基配方：
蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml）
酵母提取物(Yeast extraction)0.5% （0.5g/100 ml）
氯化钠 1.0% （1 g/100 ml）
PH 7.0
固体LB培养基：每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉
请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！
(1)每组按上述液体LB培养基配方，以配制100ml的量称取药品放入烧杯。
(2)用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使药品完全溶解后用
100ml量筒定容至100ml。
(3)pH试纸检测pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。
(4)将100ml溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50ml。
(5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中，以配制成两瓶
50ml固体LB培养基。
(6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。
(7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对称方式拧紧锅盖，打开排气阀通电加热，至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。当高压锅温度（气压）指示器）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高0.1Mpa℃（121指示锅内温度升高至．
压锅稳定在该温度（压力）下20 min，然后断开电源。待指示器指示压力降为0时，方可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅内物品。
(8)取出三角瓶后，在酒精灯火焰旁进行下述操作。
(9)取其中的一瓶直接倒培养皿，每皿倒入的量以刚好能在培养皿底铺展成薄薄
的一层即可。每组倒1块培养皿，在皿盖上用记号笔写上“LB”及各组的标记。
(10)另外一瓶培养基待温度降低至60℃左右时（刚能感觉不烫手），向培养基中加入0.1ml
50mg/ml的氨苄青霉素（Amp）溶液，使培养基中Amp的终浓度为50mg/L。快速充分混+”及各组的标记。LB块培养皿，在皿盖上标注“匀后每组倒1(11)接种环蘸取菌液，密密划线。
(12)倒置于37℃恒温培养箱中进行培养。
(13)一天后观察菌落。
四、思考题
---R在说明本实验所用的菌种时用到这样的符号：“(1)”，这告诉我们关于该菌M，Amp，种的什么信息？
(2)在步骤7中，为何须待连续的白色水蒸气从排气阀排出时才能关闭排气阀？当灭菌完毕，为何又须待高压锅指示器指示压力降为0时才能打开高压锅，而且操作次序必须是先打开排气阀然后才能打开高压锅盖？
(3)在步骤12中，为何需将涂有菌的培养皿倒置于37℃恒温培养箱中进行菌的培养？为什么不是正放呢？
(4)你预计该实验结果是什么，即两种培养基上菌的生长情况如何？
实验二碱裂解法小量提取质粒DNA
一实验目的
了解少量质粒制备方法与原理，掌握碱法小量提取质粒DNA的操作步骤。
二实验原理
本实验利用NaOH破坏菌体细胞使核酸物质从细胞中释放出来，因此称为碱裂解法抽提十二烷基磺酸。钠(SDS)能裂解细菌细胞膜，但更重要的作用在于其与钾离子反应后所引起的溶液中绝大部分蛋白质以及基因组DNA共沉淀。由于还有很多蛋白质不能被共沉淀掉，因此要进一步用酚、氯仿对溶液进行抽提。最后加入2倍体积的无水乙醇或0.7倍体积的异丙醇沉淀就能得到质量稳定的质粒DNA。从细菌中分离质粒DNA的方法主要包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
三实验材料
转化质粒pUC19后经氨苄抗性筛选获得的E. coli DH5α系列菌株
四实验设备
台式高速离心机 0μl,1000μl)，(10微量取液器．
五试剂
溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。
溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH 、1％ SDS (临用前用0.4mol/L NaOH和2％ SDS母液稀释)。
溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L
饱和酚、氯仿、TE缓冲液
六实验步骤
1. 用移液枪取1.5ml培养液放入1.5ml eppendorf管中，5000 rpm 5 min收集菌体；
2. 弃上清,将管倒置于吸水纸上尽量使液体流尽；
3. 菌体沉淀重悬浮于200μl溶液Ⅰ中；
4. 按试剂配方配制溶液Ⅱ，加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和上下颠倒eppendorf管数次以混匀溶液(千万不要振荡，动作轻柔)；
5. 立即加入200μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口并温和颠倒离心管数次，混匀溶液，置冰浴中10分钟；
6. 12000 rpm离心10分钟；
7. 加入等体积的酚/氯仿(1:1)，颠倒混匀， 12000 rpm 10分钟；
8. 小心吸取上清夜移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟；
9. 12000 rpm离心10分钟；
10. 弃上清, 将管倒置于吸水纸上使所有液体流出，加入200μl预冷的70％乙醇洗涤沉淀。
11. 同步骤10，重复洗涤沉淀一次；
12. 弃去乙醇溶液，将管倒置于吸水纸上使液体流尽，室温或37℃下干燥；
13、将沉淀溶于5μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。
[注意]
1. 提取过程应尽量保持低温。
2. 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好。最好在用酚/氯仿抽提一次后再用氯仿抽提一次，以去除残留的酚对质粒的后继实验，如酶切反应等的不良影响。
3. 沉淀DNA通常使用冰冷的无水乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA 也可用异丙醇，但由于常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。
4. 质粒DNA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性。
5．用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为：C
A.染色体DNA断成了碎片
B.染色体DNA分子量大，而不能释放
C.染色体变性后来不及复性
D.染色体未同蛋白质分开而沉淀
七思考题
1.溶液I中葡萄糖和EDTA各有什么作用？
答：葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
为何必需即用即配？II溶液2.
答：NaOH溶液长时间配制存放会与空气中的CO反应，降低PH值，影响对细胞的裂解作用。23. 加入溶液II后作用时间不能长，需要快速加入溶液III中和碱性溶液。如果溶液II的作用时间过长或者反应过于激烈会导致什么后果？
答：作用时间过长会使细菌的基因组DNA被打断，从而不能被彻底沉淀除去，影响质粒DNA的纯