基因克隆常用的方法共24页文档
同源序列法克隆目的基因
同源序列法克隆目的基因同源序列法克隆是一种常用的基因克隆方法，用于获取目的基因的DNA序列。
同源序列法克隆的主要步骤如下：1. 设计引物：根据已知目的基因的序列，设计一对引物（即寡核苷酸片段），其中一个引物具有与目的基因的5'端相互匹配，另一个引物具有与目的基因的3'端相互匹配。
2. 提取模板DNA：从包含目的基因的源生物体中提取总DNA 或特定组织/细胞中的DNA作为模板。
3. 聚合酶链反应（PCR）扩增：在PCR反应中使用设计的引物和模板DNA来扩增目的基因的DNA序列。
PCR反应通过多次循环加热和冷却来产生大量DNA复制品。
4. 凝胶电泳分析：将PCR扩增产物与分子量标记物一起加载在琼脂糖凝胶上进行电泳分离。
通过比较扩增产物与标记物在凝胶上的迁移距离，可以确定是否成功扩增了目的基因。
5. 纯化目的基因：从PCR反应中纯化目的基因的扩增产物，一般使用凝胶切片、DNA纯化试剂盒等方法。
6. 连接到载体：将纯化的目的基因DNA与适当的载体（如质粒）进行连接。
这通常涉及酶切目的基因和载体的DNA，然后使用连接酶将它们连接在一起。
7. 转化宿主细胞：将连接的DNA导入宿主细胞中，使其自行复制和表达。
这可以通过转染、电穿孔或热激冲等方法实现。
8. 筛选与鉴定：通过对转化后的细胞进行选择性培养或检测，筛选出带有目的基因的克隆。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选等。
9. 验证目的基因：最终需要验证克隆中是否成功插入了目的基因。
这可以通过DNA测序、限制性酶切、PCR等方法来进行。
同源序列法克隆是一种有效的基因克隆技术，可用于获得感兴趣的基因序列并进一步研究其功能、表达和调控机制等。
基因克隆与表达
基因克隆与表达基因克隆与表达是生物学领域中重要的技术手段和研究方法。
通过基因克隆和表达，科学家能够研究特定基因的功能、调控机制以及其在生物体内的作用，这对于深入了解生物体的生理过程和疾病发生机制具有重要意义。
本文将介绍基因克隆与表达的原理、方法以及应用。
一、基因克隆基因克隆是将特定基因从一个生物体中分离并复制到另一个载体中的过程。
这个过程主要涉及DNA的分离、复制和连接。
常用的基因克隆技术包括PCR、限制性内切酶切割、琼脂糖凝胶电泳和基因插入等。
1. PCR聚合酶链反应（PCR）是一种强大的基因扩增技术。
它通过不断地重复某一特定区域的DNA序列，使其得以大规模复制。
PCR可以在短时间内合成大量目标DNA片段，为基因克隆提供了充足的材料。
2. 限制性内切酶切割限制性内切酶可以识别并切割特定的DNA序列。
通过选择合适的限制性内切酶，可以实现将目标基因从源DNA中切割下来，为下一步的基因克隆做好准备。
3. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分离技术。
通过将DNA样品加入琼脂糖凝胶槽中，并施加电场，DNA片段会根据其大小在凝胶中迁移。
凝胶电泳可以帮助科学家分离和纯化目标基因。
4. 基因插入基因插入是将目标基因连接到载体上的过程。
载体可以是质粒、病毒或者人工染色体等。
通过连接酶的作用，目标基因与载体可以稳定地结合在一起。
二、基因表达基因表达指特定基因通过转录和翻译过程转化为蛋白质的过程。
从基因克隆到基因表达，可以分为以下几个步骤：转染或转化、筛选和检测。
1. 转染或转化转染是指将外源DNA导入到动物细胞中的过程，而转化是将外源DNA导入到细菌细胞中的过程。
转染和转化可以通过多种方法实现，如化学法、电穿孔法和基因枪法等。
2. 筛选筛选是为了确定是否成功将目标基因表达在宿主细胞中而进行的步骤。
常见的筛选方法包括荧光筛选和克隆筛选。
荧光筛选利用荧光蛋白标记目标基因，观察细胞是否出现荧光信号。
克隆筛选则利用选择性培养基，筛选出含有目标基因的克隆。
克隆突变基因的方法
克隆突变基因的方法
克隆突变基因的方法主要分为以下几个步骤：
1. 基因突变体的诱导：通过物理、化学或生物诱变剂处理靶基因，以产生所需的突变。
这些诱变剂可以包括紫外线、X射线、化学诱变剂等。
2. 突变体的筛选：通过表型筛选或DNA测序，从处理过的基因中找出突变的个体。
表型筛选是通过观察表型变化来挑选突变体，而DNA测序则是直接对基因序列进行分析。
3. 突变基因的克隆：使用PCR（聚合酶链式反应）或基因文库技术，将突变基因从基因组中扩增出来。
这一步需要用到特定的引物或探针，以便准确地识别和扩增目标基因。
4. 克隆的验证：通过DNA测序等技术，对克隆的基因进行验证，确保其与原始突变基因一致。
5. 表达载体构建：将克隆的突变基因插入到表达载体中，以便在宿主细胞中进行表达。
这一步通常涉及到载体DNA和目的DNA的酶切、连接和转化等操作。
6. 表达和功能分析：将构建的表达载体转染到适当的宿主细胞中，进行表达和功能分析。
这一步可以包括对表达产物的检测、对细胞表型的影响等方面的研究。
7. 突变基因的应用：根据研究结果，将突变基因应用于相关的生物工程或医学研究中。
例如，可以用于研究基因功能、开发新药物或改良农作物等。
克隆突变基因的方法涉及多个技术领域，如分子生物学、生物化学和遗传学等。
这些技术的不断发展和改进，使得我们能够更快速、更准确地鉴定和克隆突变基因，为相关研究提供有力支持。
基因克隆常用的方法
3.2 Differential display PCR(DD-PCR) PCR(DDDD-PCR是在AP-PCR基础上发明的一种RTDD-PCR是在AP-PCR基础上发明的一种RTPCR方法,主要用于2 PCR方法,主要用于2种或多种类似生物个体在基因 表达上的差异分析。其基本原理是: 表达上的差异分析。其基本原理是:所有真核生物 的成熟mRNA都含有不同长度的poly+(A)尾部序列, 的成熟mRNA都含有不同长度的poly+(A)尾部序列, 根据poly+(A)内部的2个核苷酸排列的不同, 根据poly+(A)内部的2个核苷酸排列的不同,可以将 所有的mRNA分子分为12类 见图3)。 所有的mRNA分子分为12类(见图3)。
PCR反应模式图： 反应模式图： 反应模式图
Nested PCR反应模式图 反应模式图
根据蛋白质序列也可或cDNA 序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1 序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引 物(degen做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。
另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究, 另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的 PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶, pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点 proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点 突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。
图３真核生物12种mRNA的序列特点
根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即 根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即 M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成 M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成 12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做 12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做 模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被 模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被 发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于2 发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于2种种源近似生 物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而, PCR的模板必须是 物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而,其PCR的模板必须是 来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快 来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快 速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所 速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所 扩增的mRNA的质量不能有差异, mRNA不应降解。目前这一方法已广 扩增的mRNA的质量不能有差异,即mRNA不应降解。目前这一方法已广 泛应用于生物表型相关基因的克隆及比较研究。
基因克隆的几种常见方法
基因克隆得几种常见方法基因（gｅｎe)就是遗传物质得最基本单位,也就是所有生命活动得基础。
不论要揭示某个基因得功能,还就是要改变某个基因得功能,都必须首先将所要研究得基因克隆出来。
特定基因得克隆就是整个基因工程或分子生物学得起点。
本文就基因克隆得几种常用方法介绍如下。
1 根据已知序列克隆基因对已知序列得基因克隆就是基因克隆方法中最为简便得一种。
获取基因序列多从文献中查取，即将别人报道得基因序列直接作为自己克隆得依据。
现在国际上公开发行得杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及得基因序列在基因库中注册，拟发表得文章中仅提供该基因在基因库中得注册号(acｃｅssion numｂer）,以便别人参考与查询。
目前，世界上主要得基因库有１）EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室得基因库，其网上地址为;（2)Genbank，为设在美国国家卫生研究院(ＮIＨ）得基因库，其网上地址为;（3)Swｉssport与TＲEMBＬ,Swissport就是一蛋白质序列库,其所含序列得准确度比较高,而TREMBＬ只含有从EＭBＬ库中翻译过来得序列。
目前,以Geｎbａnk得应用最频繁。
这些基因库就是相互联系得,在Genbank注册得基因序列,也可能在Swisspoｒt注册。
要克隆某个基因可首先通过Inｔeｒnet查询一下该基因或相关基因就是否已经在基因库中注存。
查询所有基因文库都就是免费得,因而极易将所感兴趣得基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异得引物，通过PＣＲ从基因组中克隆该基因,也可以通过RＴ-PCＲ克隆cＤNA。
值得注意得就是,由于物种与分离株之间得差异,为了保证PＣR扩增得准确性,有必要采用两步扩增法,即neｓted PCR。
根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质得基因扩增出来。
在基因文库中注册得蛋白质序列都可以找到相应得ＤNA或cDNＡ序列。
如蛋白质序列就是自己测定得，那么需要设计至少１对简并引物(dｅgｅneｒated ｐrimeｒ),从cDNA文库中克隆该基因。
植物基因克隆的方法
阳性克些候选基因，再进行别离，时空表达
特点，同源性比较等分析确定目的基因。
1. 序列克隆 利用目标基因的近等基因系或别离群体分组分析法〔BSA〕进行连锁分析，筛选目标基因所在局部区域的分子标记。
4、目的区域的精细作图 的标记和通过转座子在染色体上
植物基因克隆的方法
基因：为RNA或蛋白质编码的核苷酸序 列。
基因克隆：利用体外重组技术，将特定 基因
体中。
和其它DNA顺序插入到载
克隆目标：识别、别离特异基因并获得 基因
的完整全序列，确定染色
植物基因克隆的方法
能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文
抑制性扣除杂交〔suppression subtractive
人工合成并克隆基因
方法：根据的氨基酸或核苷酸序列，采 用植物偏爱的密码子，人工合成并
克 隆该基因。〔可对基因进行改造〕
例子：根据蜘蛛毒素的氨基酸序列，人பைடு நூலகம் 合
成并克隆了此肽的基因。
表 型 克 隆〔phonetypical cloning〕
方法：利用植物的表型差异或组织器官特 异 表达产生的差异来克隆植物基因。此方法 试图把表型与基因结构或基因表达联系起 来，从而别离特定表型相关基因。不必事 先知道基因的生化功能或图谱定位，根据 基因的表达效应就直接别离该基因。
3、构建目的基因区域跨叠克隆〔contig〕
测所测序列或氨基酸序列与序列是否同 定位克隆的优点和局限性
通过转座子上的标记基因〔如抗药性等〕就可以检测出突变基因的位置和克隆出突变基因来。
源→发 不必事先知道基因的生化功能或图谱定位，根据基因的表达效应就直接别离
方法二: 利用Velculescu等建立的基因 表达
基因克隆方法
基因克隆方法一、P CR二、胶回收（Omega E.Z.N.A. Gel Extraction Kit）1、PCR电泳产物，打开水浴锅，待电泳跑好切胶；2、将切好的胶放入1.5ml离心管中，称重，按照1g/ml加入Binding Buffer（XP2）（1.5ml离心管约重0.8g），于55～60℃水浴融化，轻微摇动待完全溶解；spin down；3、将溶液移至吸附柱中，于10000rpm离心1min；4、重复3，提高回收率；5、弃去收集管中液体，在吸附柱中加入300μl的Binding Buffer（XP2），10,000rpm离心1min；6、弃去收集管中液体，在吸附柱中加入700μl的SPW wash Buffer （注意加过酒精的）10，000rpm离心1min；7、重复6；8、12，000rpm空离2min，（此时将Elution Buffer或者去离子水放置于水浴锅中温热），弃去收集管中液体；9、将吸附柱放入新的离心管中，室温放置1～2min，然后加入30～50μl的Elution Bufferor去离子水于吸收管中，静至1～2min，12，000rpm离心1min，可以用洗脱液再洗一次柱子；10、电泳检测回收质量，测浓度。
三、连接（pMD18-T Vector）1）在PCR管中加入如下试剂1)16℃ overnight (around 16h in PCR machine) 16℃一夜之间(约16 h在PCR机器)2)Next day quick spin tubes and put on ice and store at -4℃ refrigerator第二天快速旋转管和搁置在4℃冰箱和存储四、转化转化前将水浴锅水温调至42℃。
1、取大肠杆菌感受态DH5α于冰浴中，分装每管50μl，置于冰上，加入5μl连接产物（连接液的体积不超过感受态的1/10），充分混匀；2、冰浴30min，将离心管置于42℃水浴中温育90sec，快速放入冰浴中，冷却2～3min（别摇动离心管！）3、每管加500～600μl LB液体培养基（不含抗生素），混匀后于37℃摇床震荡培养60min（转速在150～220rpm均可）4、准备LB+Amp（50 mg/ml，100 ml培养基加100 μl）的平板，烧好涂布棒；5、取100～300μl的转化菌液涂布在LB+Amp的平板的平板上，于37℃培养12～16h。
(完整版)基因克隆步骤完整版
1总RNA提取(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将1ml Trizol加到离心管中待用(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；打开离心机预冷(3) 加200 µL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层；(4) 4o C，12,000g，离心15 min；(5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min；(6) 4o C，12,000g，离心10 min；(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗(8) 4o C，7,500g，离心5 min；(9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC 水，－80o C保存。
此操作中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。
提取的总RNA 需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。
OD260值为核酸的吸收值，OD280值为蛋白的吸收值，OD260/280值在1.8-2.0间一般说明该核酸蛋白含量在允许的范围内，可正常使用；此外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。
RNA浓度计算公式：总RNA 浓度（µg/mL）=A260×稀释倍数×40。
2反转录/cDNA第一链的合成纯化RNA以去除基因组DNA，操作按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。
其体系为：Total RNA1μg5× gDNA Eraser Buffer2μLgDNA Eraser1μLRNase Free dH2O补齐至10μL 条件为：42o C，2min；RNA纯化后，即可进行反转录。
其体系为：5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4μLPrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μLRT Primer Mix 1μL上一步的反应液10μLRNase Free dH2O补齐至20μL 操作条件为：(1) 37o C放置15 min；(2) 85o C，5 sec；(3) 4o C保存。
基因克隆操作方法有哪些
基因克隆操作方法有哪些
基因克隆是指通过人工手段将一个个体的基因复制到另一个个体中。
下面是常见的基因克隆操作方法：
1. DNA提取：从源个体的细胞中提取DNA，如血液样本或培养细胞。
2. 制备载体：将目标基因插入位于载体DNA中的特定区域，通常使用质粒或病毒作为载体。
3. DNA剪切：使用限制性内切酶切割源DNA和载体DNA，以便在适当的位置形成可互相配对的黏末端。
4. DNA连接：将目标基因与载体DNA连接起来，使用DNA连接酶催化这一反应。
5. 转化：将连接好的重组DNA导入到宿主细胞中，使其重组DNA在宿主细胞内复制和表达。
6. 选择和筛选：使用筛选方法来确定哪些宿主细胞成功地转化了重组DNA，例如通过特定基因的表达产物或对特定抗性标记的抗性。
7. 扩增：将转化成功的细胞进行培养和扩增，以获取足够数量的克隆。
8. 验证：通过PCR、测序等方法验证克隆的正确认。
9. 表达和纯化：对成功克隆的基因进行表达，并纯化所需的表达蛋白。
这些步骤可以根据具体实验目的进行调整和优化，通常需要借助一些特定的实验室设备和试剂来完成。
基因克隆步骤完整版
基因克隆步骤完整版基因克隆是一项复杂的生物技术，可以用于生物研究、药物开发和农业改良等领域。
下面是基因克隆的完整步骤：1.设计克隆实验方案：首先，确定要克隆的基因序列。
这可以是来自同一物种的已知基因，或者是从其他物种中提取的基因。
然后，设计适当的引物（引物是专门设计用来扩增特定DNA序列的短片段）用于PCR扩增。
2.DNA提取：提取目标组织或细胞中的DNA。
常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、盐法和商业DNA提取试剂盒等。
3.PCR扩增：使用引物和DNA模板进行多轮PCR扩增，从而产生大量目标基因的复制。
4.凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳分析，以确认扩增是否成功，并确定目标基因的大小。
5.DNA纯化：将目标基因的PCR产物从凝胶中切割并纯化。
这通常通过使用商业DNA凝胶提取试剂盒来完成。
6.多重限制性内切酶切割和连接：根据克隆方案中的设计，使用适当的限制性内切酶切割DNA。
然后，将目标基因连接到一个载体DNA中，这个载体DNA称为克隆载体。
克隆载体通常是一个圆形的质粒DNA。
7.转化：将克隆载体插入到宿主细胞中。
这可以通过热激冷转化、电转化或化学转化等方法实现。
8.筛选转化子：使用适当的筛选方法筛选转化子。
这可以通过选择性培养基，例如含有抗生素的培养基，或者通过对转化子进行荧光筛选等方法。
9.扩增：从筛选出的阳性克隆中提取DNA，并使用PCR或其他方法进行扩增。
10.序列分析：对扩增的DNA进行序列分析，以确认克隆是否成功。
这可以通过将DNA提交给商业实验室进行测序，或者使用自动测序设备进行测序。
11.功能分析：对克隆所得基因进行功能分析。
可以通过转基因生物的研究，观察基因对生物表型的影响。
12.存储和应用：将克隆所得的基因保存在冷冻库中，以备后续研究或应用。
总结：基因克隆是一项复杂的过程，包括基因序列设计、DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳、DNA纯化、限制性内切酶切割和连接、转化和筛选转化子、扩增、序列分析、功能分析和存储等步骤。
目的基因的克隆方法
目的基因的克隆方法
1. 直接克隆法呀，这就好比你直接去商店挑了一个你最喜欢的玩具，简单又直接！比如说，我们想克隆某个特定基因，就像你一眼看中那个可爱的小熊玩偶，直接把它拿过来就行啦。
2. 还有反转录克隆法哦，哎呀，就好像把一段声音录下来再倒放出来一样神奇！比如从细胞中的 mRNA 反转录得到 cDNA，不就是很有趣的过程嘛？
3. 载体介导克隆法呢，就好像给基因找了一辆专门的车来运输它！像把基因放到特定的载体里，让它顺利到达目的地。
4. 基因文库筛选法呀，哇，这就像是在一个超级大的宝库中找宝贝！比如说在庞大的基因文库中去努力找到我们想要的那个目的基因。
5. PCR 扩增克隆法哟，这就跟变魔术一样厉害呢！比如通过 PCR 技术把特定基因大量扩增出来，好神奇呀！
6. 杂交捕获克隆法，哈哈，就好像用一个小陷阱去抓住我们想要的基因！像是专门设计来抓住目标基因一样。
7. cDNA 末端快速扩增法，这不就像是跑步冲刺一样快速到达终点嘛！像快速扩增 cDNA 的末端，得到我们要的基因片段。
8. 人工合成克隆法，哇塞，这可真牛，就像自己动手做一个超级厉害的东西出来！比如人工合成一些小的基因片段呢。
9. 染色体步移克隆法，嘿嘿，就好像一步一步探索一个神秘的地方一样！像是沿着染色体逐步找到我们的目的基因。
我觉得这些目的基因的克隆方法都超级有趣，各有各的神奇之处呀！真的是让我们对基因世界的探索更加丰富多彩了呢！。
基因克隆的步骤
基因克隆的步骤嘿，咱今儿就来讲讲基因克隆那些事儿哈！你知道吗，基因克隆就像是一场神奇的魔法之旅。
首先呢，咱得找到那个我们想要克隆的基因，这就好比是在茫茫人海中找到那个特别的人。
怎么找呢？这可得有点技术和耐心啦！科学家们会用各种巧妙的方法，就像侦探在寻找线索一样，去把那个关键的基因给揪出来。
找到了基因，接下来就得给它找个“家”啦。
这“家”就是载体，就像是给这个基因找了个舒适的小房子，让它能安稳地待着。
然后呢，把基因和载体连接起来，让它们紧紧地结合在一起，就像好朋友手牵手一样。
再之后，就是把这个带着基因的载体送进细胞里啦。
这可不是随便找个细胞就行的哦，得找个合适的，就好像给这个基因找个最合适的“幼儿园”。
细胞就会把这个基因当成自己的一部分，开始按照基因的指令工作啦。
你想想，这多神奇啊！就这么一步步地，一个新的基因就被克隆出来啦。
这就好像我们自己动手搭积木，一块一块地搭起来，最后就变成了一个漂亮的城堡。
那为什么要做基因克隆呢？这用处可大了去啦！可以用来研究疾病的发生机制呀，说不定就能找到治疗那些疑难杂症的方法呢。
还可以用来生产药物，让那些救命的药变得更容易得到。
这就像给我们的健康上了一道保险一样，多让人安心啊！基因克隆可不是一件简单的事儿哦，得有专业的知识和技术，还得有耐心和细心。
就像厨师做菜一样，每一步都要恰到好处，不然味道可就不对啦。
所以说啊，基因克隆真的是一门高深又有趣的学问。
它让我们对生命的奥秘有了更深入的了解，也为我们的生活带来了很多的可能。
你说，这是不是很神奇呢？咱可不能小看了这基因克隆的步骤，每一步都有着它的重要意义呢！。
基因克隆常用的方法共24页PPT
11、获得的成功越大，就越令人高兴 。野心 是使人 勤奋的 原因， 节制使 人枯萎 。 12、不问收获，只问耕耘。如同种树 ，先有 根茎， 再有枝 叶，尔 后花实 ，好好 劳动， 不要想 太多， 那样只 会使人 胆孝懒 惰，因 为不实 践，甚 至不接 触社会 ，难道 你是野 人。(名 言网) 13、不怕，不悔(虽然只有四个字，但 常看常 新。 14、我在心里默默地为每一个人祝福 。我爱 自己， 我用清 洁与节 制来珍 惜我的 身体， 我用智 慧和知 识充实 我的头 脑。 15、这世上的一切都借希望而完成。 农夫不 会播下 一粒玉 米，如 果他不 曾希望 它长成 种籽； 单身汉 不会娶 妻，如 果他不 曾希望 有小孩 ；商人 或手艺 人不会 工作， 如果他 不曾希 望因此 而有收 益。-- 马钉路 德。
41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
45、自己的饭量自己知道。——苏联
基因克隆基本实验方法
重组质粒的连接、转化及筛选第一节概述质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。
如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。
在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。
但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。
通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。
外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。
也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。
2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。
由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。
所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。
还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。
带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。
基因克隆步骤完整版
1总RNA提取(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将1ml Trizol加到离心管中待用(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；打开离心机预冷(3) 加200 µL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层；(4) 4o C，12,000g，离心15 min；(5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min；(6) 4o C，12,000g，离心10 min；(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗(8) 4o C，7,500g，离心5 min；(9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC 水，－80o C保存。
此操作中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。
提取的总RNA需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。
OD260值为核酸的吸收值，OD280值为蛋白的吸收值，OD260/280值在间一般说明该核酸蛋白含量在允许的范围内，可正常使用；此外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到左右。
RNA浓度计算公式：总RNA 浓度（µg/mL）=A260×稀释倍数×40。
2反转录/cDNA第一链的合成纯化RNA以去除基因组DNA，操作按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagentwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。
其体系为：Total RNA1μg5× gDNA Eraser Buffer2μLgDNA Eraser1μLRNase Free dHO补齐至10μL2条件为：42o C，2min；RNA纯化后，即可进行反转录。
其体系为：5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time） 4μLPrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μLRT Primer Mix 1μL上一步的反应液10μLO补齐至20μLRNase Free dH2操作条件为：(1) 37o C放置15 min； (2) 85o C，5 sec； (3) 4o C保存。
clone_id 基因
clone_id 基因基因克隆（Clone ID）是一项重要的基因技术，它在生物科学研究、医学治疗和农业育种等领域发挥着重要作用。
本文将从基因克隆的原理、方法和应用三个方面对克隆ID进行详细介绍。
一、基因克隆的原理基因克隆是指将感兴趣的基因从一个生物体中分离出来，通过复制和插入等技术手段，将其放入目标生物体中，使其在目标生物体中表达和功能。
基因克隆的主要原理是DNA的分子结构和遗传信息的特点。
DNA是由核苷酸序列组成的双链螺旋结构，通过特定的酶可以在特定的位点进行切割。
二、基因克隆的方法基因克隆的方法主要包括DNA片段的制备、载体的选择、连接反应、转化和筛选等步骤。
1. DNA片段的制备：通过PCR扩增、限制性内切酶切割、酶切修饰等技术手段，制备所需的DNA片段。
2. 载体的选择：选择合适的载体，将目标基因插入其中。
常用的载体有质粒、噬菌体、人工染色体等。
3. 连接反应：将目标基因与载体进行连接，形成重组DNA。
4. 转化：将重组DNA导入到宿主细胞中，使其在宿主细胞中表达。
5. 筛选：通过抗性标记、荧光标记等方式，筛选出含有目标基因的克隆。
三、基因克隆的应用基因克隆在生物科学研究、医学治疗和农业育种等领域有着广泛的应用。
1. 生物科学研究：基因克隆可以帮助科学家深入了解基因的功能和调控机制。
通过克隆基因，科学家可以进一步研究基因在发育、代谢和免疫等方面的作用。
2. 医学治疗：基因克隆为基因治疗提供了重要的手段。
通过克隆和修饰人类基因，可以研究和治疗与遗传相关的疾病，如癌症、遗传性疾病等。
3. 农业育种：基因克隆在农业领域也发挥着重要作用。
通过克隆和转基因技术，科学家可以改良作物的抗病性、耐旱性和产量等性状，提高作物品质和产量。
基因克隆是一项重要的基因技术，具有广泛的应用前景。
通过克隆ID的介绍，我们可以了解到基因克隆的原理、方法和应用。
未来，随着基因技术的不断发展和创新，基因克隆将在更多的领域发挥重要作用，为人类的生活和健康带来更多的福祉。
真核生物克隆的方法
真核生物克隆的方法
真核生物克隆的方法主要包括以下几种：
1.基因文库法：该方法主要涉及通过基因文库筛选和捕获所需的基因。
2.序列特异性引物法：这种方法基于已知的基因序列，设计特异性引物，通
过PCR技术进行基因克隆。
3.重组法：这是一种相对简单且直接的方法，基于DNA的碱基互补原则进行
操作。
4.人工染色体克隆法：这种方法是通过构建人工染色体来克隆基因。
5.转座子标签法：利用转座子标记的DNA片段进行基因克隆。
6.随机引物扩增法：通过随机引物进行PCR扩增，然后对产物进行测序和基
因文库筛选。
7.转录间隔区（TSD）克隆法：利用TSD的特异性扩增来克隆基因。
8.外显子跳跃法：利用特定的引物组合，跳过内含子进行外显子克隆。
9.锚定克隆法：利用已知的锚定序列进行基因克隆。
10.单链DNA构象捕获法（RNase protection）：利用单链DNA的构象捕获技
术进行基因克隆。
以上是一些真核生物克隆的常用方法，根据具体的实验需求和条件选择合适的方法。
基因工程克隆方案怎么做
基因工程克隆方案怎么做一、DNA片段的扩增1.1 DNA片段的选择首先需要根据实验需要，选择具有特定序列的DNA片段进行克隆。
可以通过PCR技术从已有的DNA模板中扩增出目标DNA片段，也可以利用限制性内切酶切割目标DNA片段。
1.2 PCR扩增如果选择利用PCR技术进行DNA片段的扩增，需要设计一对特异性引物，引物的序列应该与目标DNA片段的两端相互配对。
此外，还需要确定PCR反应的条件，如温度、引物浓度、酶浓度等。
1.3 酶切如果选择利用限制性内切酶切割目标DNA片段，需要选用能够识别目标DNA片段特定序列的内切酶，并在合适的条件下进行酶切反应。
1.4 凝胶电泳无论是PCR扩增还是酶切，都需要进行凝胶电泳来确认扩增或酶切反应的效果。
通过观察凝胶电泳图，确定目标DNA片段是否得到了扩增或酶切，并测定扩增或酶切产物的浓度。
二、DNA片段的连接2.1 连接酶反应在获得目标DNA片段的前提下，需要选择合适的连接酶来将DNA片段与载体连接。
连接酶反应条件需满足连接酶的最适工作温度和最适pH值。
2.2 载体的选择DNA片段连接的目标通常是质粒或噬菌体DNA。
质粒和噬菌体DNA都有其独特的特性，需要根据实验需求选择适合的载体。
2.3 连接产物的转化连接产物需要通过转化方法导入细菌或酵母等宿主细胞内，形成转化子。
可选择热激、电穿孔、钙离子法等转化方法。
2.4 融合细菌融合细菌转化后需要分别接种到含有适当抗生素的寒露培养基上，使得只有含有目标DNA 片段的转化子能够生长。
三、筛选和鉴定3.1 抗生素筛选在融合细菌待发酵培养基上接种后，通过抗生素的筛选，只有含有目标DNA片段的细菌才能在含有抗生素的培养基上生长。
3.2 PCR验证针对含有目标DNA片段的细菌进行PCR验证，确保连接的DNA片段没有错位缺失等问题。
3.3 测序验证对PCR验证合格的细菌进行测序验证，确保目标DNA片段的序列正确无误。
四、扩大培养4.1 微量预培养对经过筛选和鉴定的细菌进行微量预培养，获得含有目标DNA片段的细菌培养液。