第四篇.典型发酵工程(过程篇)

推动抗生素发展：牛津大学病理学教授弗洛里、钱
恩等优秀的化学家。

1952年的诺贝尔生理学或医学奖颁发给塞尔曼· 亚伯
拉罕· 瓦克斯曼（Selman Abraham Waksman ） ，他发
现了链霉素， 第一有效抗生素用于治疗肺结核。
27.1.3 抗生素的分类
抗生素的分类
27.2 抗生素工业发酵生产过程
Agar diffusion assay
微生物发酵生产抗生素的基本过程

菌种→孢子制备→种子准备→发酵→发酵 液过滤与预处理→提取及精制→成品包装
27.3 青霉素生产工艺

Fleming分离的点青霉，只能产生2U/ml青霉素。

目前全世界用于生产青霉素的高产菌株，大都由 一种产黄青霉菌株经不同改良途经得到; 20世纪70年代前育种：诱变和随机筛选方法；
根据某种抗生素的化学组成和结构，通过化
学合成的方法，可生产部分抗生素。如氯霉素、
磷霉素等。
经过化学合成方法和控制条件的不断深入研
究，越来越多的抗生素可用化学合成法生产。
27.2.3 生物合成加化学合成法
许多细菌逐渐出现了抗药性，证实某些抗药性 因子位于细菌内的质粒上，质粒在细菌之间转移 使抗性菌日益增多，抗生素疗效就越来越低。
为对付细菌的抗药性，科学家对抗生素进行 了“整容手术”，细菌因再无法识别改头换面的 抗生素而被抑制或杀死。 现在已能使用克隆了酰化酶基因的“工程菌” （大肠杆菌）高效率的生产半合成抗生素。临床 现在使用的特效药物先锋霉素（头孢菌素类）、 氨苄青霉素就是这类半合成抗生素类药物。
生产前期研究

27.3.1 菌种：产黄青霉（(Penicillium
chrysogenum) 产绿色、黄色孢子）
生长发育分7个阶段： Ⅰ期：分生孢子萌发；Ⅱ期：菌丝繁殖； Ⅲ期：脂肪粒形成；Ⅳ期：脂肪粒减少，中、小空孢 Ⅴ期：形成大空孢，脂肪粒消失； Ⅵ~Ⅶ期：细胞内没有颗粒，菌丝体自溶。 Ⅰ—Ⅳ期：菌丝生长期， Ⅲ期适宜做发酵种子； Ⅳ—Ⅴ期：青霉素分泌期； Ⅵ期到来之前结束发酵

温度控制：前期，25~26℃；后期， 23℃；

通风比：1:0.8vvm(单位培养液体积在单位 时间内通入的空气量) 溶氧：发酵液中的溶氧≥氧饱和溶解度的30 ％； 消沫剂：添加玉米油、豆油或化学消沫剂” 泡敌”，少量多次。


27.3.5 青霉素的分离纯化
（1）预处理：浓缩目的产物，去除大部分
R
ຫໍສະໝຸດ Baidu
H N H
O
S
B A
CH3
N
H
CH3 COO-
β-内酰胺环
青霉素的分类

青霉素G类:如青霉素G钾、青霉素G钠、长效西林等.

青霉素V 类: (别名苯氧甲基青霉素、６Ｇ苯氧乙酰胺基青 霉烷酸)如青霉素V钾等.
耐酶青霉素:如苯唑青霉素(新青Ⅱ号)、氯唑青霉素等. 广谱青霉素:如氨苄西林、阿莫西林等. 抗绿脓杆菌的广谱青霉素:如羧苄西林、哌拉西林钠、呋
前胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸仍用抽提法生产。

化学合成法：用化学合成的方法制造氨基酸。目 前用化学合成法制造的氨基酸有DL-蛋氨酸、DL丙氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸。

微生物发酵法：是目前氨基酸生产最常用的方法。 根据微生物本身具有合成氨基酸的能力的特点， 通过菌株的筛选、诱变处理及代谢调节来达到合 成某种氨基酸的目的。 发酵法分为直接发酵法和添加前体发酵法。 酶法：利用微生物细胞或微生物产生的酶进行生 物催化反应制造氨基酸的方法。赖氨酸、色氨酸、 天门冬氨酸、酪氨酸、丙氨酸等均可用酶法生产。 采用固定化酶或细胞连续生产，其优点更突出。

抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗原虫、抗寄生虫、抗血纤维蛋
白溶酶作用。

目前人们在生物体内发现的 6000多种抗生素，约60％来自 放线菌。
27.1.2 抗生素发展史

抗生素是现代生物学史上最伟大的成就之一。

是人们使用最多的药物，也是制药工业中利润最 高的产品。世界各国由发酵法生产的抗生素约 400种，广泛应用的仅120种。
造，可以制造出许多高效低毒的新型抗生素，通
过改革工艺，使抗生素产量成倍地增长。
② “工程菌”制造法
第一次由“工程菌”制造的全新抗生素—麦
迪紫红素A是美国报道的。将产放线紫红素的部
分基因插入产麦迪霉素的放线菌中，构建的“工 程菌”产生了全新的抗生素。 我国新构建的生产丁胺卡那霉素的“工程 菌”，就是把酰化酶基因克隆到卡那霉素产生菌 中获得的。 新的“工程菌” 生产的新抗生素毒副作用小，
产生菌的筛选 抗菌性试验 提取、精制、鉴定 毒性试验 药理和临床试验
lawn of test bacteria 测试菌苔
filter papers soaked with test compounds 含药物滤纸
agar plate 琼脂培养基
zones of inhibition (no growth) 抑菌圈

（2）种子罐和发酵罐培养工艺
青霉素生产采用三级发酵。 一级种子培养：接种小米孢子→萌发形成菌丝。 培养基成分为葡萄糖、蔗糖、乳糖、玉米浆、碳 酸钙、玉米油、消沫剂等。通无菌空气，空气流 量1:3 (V/V)，300~350r/min;培养时间40~50h;pH 自然，温度,27℃±1℃。 二级种子培养：菌丝体大量繁殖。培养基成分为 玉米浆、葡萄糖等。通无菌空气，空气流量1: (1~1.5)(V/V)，250~280r/min、pH 自然， 25℃±1℃，培养时间10~14h。

现在原生质体融合技术、基因克隆技术青霉素工 业发酵已达80000U/ml。
生产菌株一般在真空冷冻干燥状态下保存其分生 孢子，也可用甘油或乳糖溶剂作悬浮剂，在-70℃ 冰箱或液氮中保存孢子悬浮液和营养菌丝体。

青霉素类的基本结构： 由母核6-氨基青霉烷酸 (6-amino-penicillanic acid,6-APA)及侧链组 成，侧链不同形成不同 青霉素，抗菌能力不同 6-APA是由一个噻唑环 (A)连结β-内酰胺环(B) 组成
27.3.2 培养基：
碳源：乳糖、蔗糖、葡萄糖等；淀粉水解糖。

通常采用葡萄糖和乳糖。发酵初期，利用葡萄糖 使菌丝快速生长；当葡萄糖耗竭后，利用乳糖， 分泌青霉素。
氮源：玉米浆、花生饼、棉籽饼、麸皮粉，氯 化铵、硫酸铵、硝酸铵。 前体：苯乙酸或苯乙酰胺；多次流加，每次﹤0.1％ 无机盐：S、P、Ga、Mg、K等。

种子制备阶段以生产丰富的孢子（斜面和米孢子 培养）或大量健壮的菌丝体(种子罐培养)为目的 所以，要在培养基中加入丰富的、容易代谢的碳 源（如葡萄糖或蔗糖）、氮源（如玉米浆）、缓 冲pH的碳酸钙以及生长所必需的无机盐，并保持 最适生长温度（25~26℃）和充分通气、搅拌。


种子制备的培养条件及原材料质量均应严格控制 以保持种子质量的稳定性。

苄青霉素等.

氮咪青霉素:如美西林及其酯匹美西林等,其特点为较耐酶, 对某些阴性杆菌(如大肠杆菌、克雷伯菌和沙门菌)有效,但
对绿脓杆菌效果差.
青霉素生产流程

冷冻干燥孢子→琼脂斜面→米孢子→种子 罐（一、二级)→发酵罐→预处理→过滤→ 乙酸丁酯萃取→蒸发（脱水脱色）→结晶 →工业盐→综合利用
抗生素生产为近代微生物技术中最大产业之一， 世界产量超过35000吨，不但在经济上占有重要 位置，且为人类健康作了出巨大贡献。


青霉素：弗莱明发现
青霉素是最早发现并用于临床的一种抗生素。
1928年英国人FIeming发现，20世纪40年代投入 工业生产，它能有效地控制伤口的细菌感染，在二 战期间挽救了数百万战争中受伤者的性命。
（5）精制：乙酸丁酯萃取液用0.5mol/L氢氧化钠
萃取→调pH6.4~6.8 →得青霉素钠盐浓缩液（5万
单位/ml） →加3~4倍体积的丁醇，16~26℃,
5~110mmHg下真空蒸馏，将水、丁醇共沸物蒸 发出去→浓缩到青霉素钠盐浓缩液的体积、蒸出 馏分中含水量为2~4%时，停止蒸馏→青霉素钠 盐结晶析出→过滤→洗涤得到成品

三级发酵培养:培养基为花生饼粉(高温)、麸皮、 玉米浆、葡萄糖、尿素、硫酸铵、硫酸钠、硫代 硫酸钠、磷酸二氢钠、苯乙酰胺、碳酸钙及消泡 剂等。接种量为12%~15%。 青霉素的发酵对溶氧要求极高，通气量偏大，通 气比控制1: (0.7~1.8)(V/V)，150~200r/min; 100m3 的发酵罐搅拌功率为200~300kW, 罐压控制 0.04~0.05MPa, 25~26℃下培养。 前60h,pH5.7~6.3，温度26℃，以后pH6.3~6.6;温 度24℃，发酵周期为200h左右。

28.2 氨基酸发酵工艺控制
28.2.1 菌种：

氨基酸发酵的菌种主要有谷氨酸棒状杆菌、黄色 短杆菌、乳糖发酵短杆菌、短芽孢杆菌、黏质赛 氏杆菌等。下页为一些氨基酸生产菌种及用途。
28.2.2 培养基

培养基一般都包括碳源、氮源、无机盐、生长因 子、水等成分。发酵培养基的成分与配比是决定 氨基酸产生菌生长、代谢的主要因素，与氨基酸 的产率、转化率及收率的关系密切。
第四篇
典型发酵工程
（过程篇）
第27章 抗生素生产工艺（青霉素）
第28章 氨基酸生产工艺（赖氨酸）
第27章 抗生素生产工艺
27.1 概 述（视频抗生素滥用之祸）
27.1.1 抗生素：

微生物（细菌、真菌、放线菌）或动植物在生命活动中产 生的，低浓度下选择性地抑制或杀灭其他微生物或肿
瘤细胞的具有生物活性的物质。
氨基酸 谷氨酸
铁离子有害， 控制在﹤30µ g/ml。
27.3.3 发酵工艺过程
（1）生产孢子的制备

保藏的孢子→活化（25~26℃，6~8d）→ 获得单菌落（ 25~26℃ ，7d） →获得斜面 孢子→制得小米或大米孢子（优质小米或 大米固体培养基25℃，7d） 每批孢子必须进行严格摇瓶试验，测定效 价及杂菌情况.
1.生物合成法： 生 产 方 法
①传统方法
② “工程菌”制造法
③细胞融合技术法
2.化学合成法；
3.生物合成+化学合成法
27.2.1 生物合成法：
①传统方法：多数抗生素是由放线菌和霉菌产生
菌种从土壤中分离、筛选获得，采用深层通
风搅拌发酵罐生产。
由于传统方法存在很多不足，人们采用基因
工程和细胞融合技术，对抗生素产生菌进行了改
杂质，改变发酵液的流变学特征，利于后
续的分离纯化过程。
（2）过滤：加入絮凝剂→转鼓式真空：吸
滤、洗涤、吸洗液、刮除滤饼。除掉菌丝
体及部分蛋白质。
（3）萃取：溶媒萃取法，二级逆流工艺或二 级顺流工艺； 青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素 盐易溶于水。工业上通常用乙酸丁酯和戊 酯，萃取2~3次，浓缩10倍，浓度几乎达到 结晶要求。 （4）脱色：加活性碳150-200g/10亿单位；


氨基酸的生产方法主要有抽提法、化学合成法、 微生物发酵法和酶法四种。

到目前为止，60％以上的氨基酸采用微生物发酵 法进行生产，其中产量最大的是谷氨酸，其次是 赖氨酸。
氨基酸的生产方法

抽提法：将蛋白质原料进行水解，然后从水解液
中抽提氨基酸，是生产氨基酸最早采用的方法。
水解方法有酸法水解、碱法水解和酶法水解。目
（6）溶媒回收：各种有机溶剂回收，以降低成本、
减少环境污染
第28章 氨基酸生产工艺
28.1 概述

氨基酸是蛋白质的基本结构单位，在自然界已发 现组成各种蛋白质的氨基酸有二十多种，其中苏 氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋 氨酸、苯丙氨酸及色氨酸八种氨基酸是人类本身 不能合成的必需氨基酸，只能从食物中摄取。 氨基酸在食品、医药、饲料、化工、农业、化妆 品等领域广泛应用。
对耐卡那霉素、庆大霉素致病菌临床疗效显著。
③细胞融合技术法
对抗生素产生菌采用细胞融合技术的成果更 为突出。橄榄色无孢小单孢菌细胞融合株抗生素 产率比原菌株提高100倍。
目前DNA重组技术已广泛用于红霉素、链霉
素等20多种抗生素的育种工作，不久将来会有更
多的由“工程菌”生产的新型抗生素问世。
27.2.2 化学合成法



27.3.4 发酵条件控制


补糖：残糖降至0.6％、pH上升时开始加糖；
补氮：发酵液氨态氮0.01~0.05％，补硫铵、 氨水或尿素 补前体：发酵液中残存乙酰胺0.05~0.08%；


pH控制：前期pH 5.7~6.3，中后期6.3~6.6, 通过进行调节通过加糖、加酸、加碱补加氨 水调节；