第四章 代谢工程概述
代谢工程
代谢工程科技名词定义中文名称：代谢工程英文名称：metabolic engineering定义：通过基因工程的方法改变细胞的代谢途径。
所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；新陈代谢（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布代谢工程书籍图代谢工程（Metabolic engineering）是生物工程的一个新的分支。
代谢工程把量化代谢流及其控制的工程分析方法和用以精确制订遗传修饰方案并付之实施的分子生物学综合技术结合起来，以上述“分析——综合”反复交替操作、螺旋式逼近目标的方式，在较广范围内改善细胞性能，以满足人类对生物的特定需求的生物工程。
目录发展前沿展开编辑本段发展为了满足人类对生物的特定需求而对微生物进行代谢途径操作，已有将近半个世纪的历史了。
在氨基酸、抗生素、溶剂和维生素的发酵法生产中，都可以找到一些典型实例。
操作的主要方法是，用化学诱变剂处理微生物，并用创造性的筛选技术来检出已获得优良性状的突变菌株。
尽管这种方法已被广泛地接受并已取得好的效果，但对突变株的遗传和代谢性状的鉴定是很不够的，更何况诱变是随机的，科学不足技巧补！DNA重组的分子生物学技术的开发把代谢操作引进了一个新的层面。
遗传工程使我们有可能对代谢途径的指定酶反应进行精确的修饰，因此，有可能构建精心设计的遗传背景。
DNA重组技术刚进入可行阶段不久，就出现了不少可用来说明这种技术在定向的途径修饰方面的潜在应用的术语。
如分子育种（1981年），体外进化（1988年），微生物工程或代谢途径工程（1988~1991年），细胞工程（1991年）和代谢工程（1991年）。
尽管不同的作者提出不完全相同的定义，这些定义均传达了与代谢工程的总目标和手段相似的含义。
我们曾经把代谢工程定义为，代谢工程就是用DNA重组技术修饰特定的生化反应或引进新的生化反应，直接改善产物的形成和细胞的性能的学科。
这样定义代谢工程强调了代谢工程工作目标的确切性。
代谢工程名词解释
代谢工程名词解释
代谢工程
代谢工程是一门研究利用生物技术手段对生物体代谢进行优化和调控的学科。
它综合运用生物学、生物化学、分子生物学、计算机科学等多学科知识，利用基因工程、蛋白工程、酶工程等技术手段，旨在通过调节代谢途径、改变代谢产物生成、提高生物反应器效率等方法，达到提高生产效率、生产新化合物或降低资源消耗的目的。
代谢途径
代谢途径是生物体内进行物质转化和能量转换的路线。
常见的代谢途径包括糖分解途径、脂肪酸合成途径、氨基酸代谢途径等。
通过对代谢途径的研究，代谢工程可以发现调控点并进行优化，从而实现对特定化合物的高效生产。
基因工程
基因工程是利用DNA重组和修改技术来改变生物体的遗传信息。
在代谢工程中，基因工程常用于改变代谢途径中的限速酶活性、优化底物转化率等。
通过定向改变特定基因的表达水平或引入外源基因，可以实现对代谢产物的调控。
蛋白工程
蛋白工程是通过改变蛋白质的结构和功能来改变生物体的代谢性能。
代谢工程中常利用蛋白工程技术改变代谢途径中的酶的催化性能，提高酶的稳定性和活性。
蛋白工程手段包括点突变、重组蛋白表达等。
酶工程
酶工程是通过改变酶的结构和功能来改变生物体的代谢性能。
代谢工程中常利用酶工程技术改变代谢途径中的催化酶的特性，提高底物转化效率和产物选择性。
酶工程手段包括蛋白工程、酶的固定化等。
代谢工程概念
代谢工程概念一、名词解释：1代谢工程：应用重组DNA技术和分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能或输送体系的功能，甚至产能系统的功能，以改进细胞某些方面的代谢活性的整套操作工作（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作、目的代谢活性的实现）。
代谢工程是生物化学反应代谢网络有目的的修饰。
它属于基因工程的一个重要的分支。
2代谢控制发酵技术：利用遗传学的方法或生物化学方法，人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，使目的产物大量的生成、积累的发酵。
3生物技术：是应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物体作为反应器将物料进行加工以提供产品来为社会服务的技术。
4代谢网络的节点（Node）：微生物代谢网络中的途径的交叉点（代谢流的集散处）称作节点。
在不同条件下，代谢流分布变化较大的节点称为主节点。
根据节点下游分支的可变程度，节点分为柔性、弱刚性、强刚性三种。
5柔性节点（Flexible Node）：是节点的一种类型，是流量分配容易改变并满足代谢需求的一类节点。
（指由节点流向各分支的代谢流量分割率随代谢要求发生相应的变化，去除产物的反馈抑制后，该分支的代谢流量分割率大大增加）。
6强刚性节点：若一个节点的一个或多个分支途径的流量分割率受到严格控制，那么这类节点就称为强刚性节点。
（指由节点流向某一分支或某些分支的代谢流量分割率是难以改变的，这是由产物的反馈抑制及对另一分支酶的反式激活的相互作用所致。
）。
7弱刚性节点：若一个节点的流量分配由它的某一分支途径的分支动力学所控制，则称该节点是弱刚性节点，介于柔性节点和强刚性节点之间。
8代谢流（Flux）：定义为流入代谢物被途径加工成流出代谢物的速率。
9途径工程（Pathway Engineering）：是一门利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络，并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰，进而完成细胞特性改造的应用性学科。
10合成生物学：简单地说，合成生物学是通过设计和构建自然界中不存在的人工生物系统来解决能源、材料、健康和环保等问题的一门新兴学科。
代谢工程
发展前沿
• 采用系统生物学原理和转基因生物技术、 计算机软件辅助设计技术，将细胞内次生 代谢反应链重新设计、人工合成基因与基 因调控网络，从而进入了代谢工程、基因 工程的合成生物学 - 系统生物学基础的遗传 工程时代。
• 最近的发展表明，它在植物、动物代谢工 程及至人体组织细胞的基因治疗及代谢分 析方面有重要应用。该领域的新颖性在于 分子生物技术与数学分析工具的集成，这 有助于阐明基因修饰的代谢通量控制及靶 标的合理选择。通过提供对细胞生物学的 准确严密的描述，代谢工程也可大大促进 功能基因组学研究的深入发展。
研究方向
• 主要是代谢工程的分析方面。 • 1怎样确定定义生理状态的参数？ • 2怎样用这信息解释代谢网络控制的结构体系，进 而提出达到某个目标的合乎道理的修饰位点？ • 3怎样进一步评估这些遗传修饰和酶的修饰的真实 的生化效果，以便进行下一轮的途径修饰，直到 达到目的？ • 4能不能提出一个可用来确定代谢修饰的最有希望 的靶位的合理的步骤？
Thank you!
操作方法
• 操作的主要方法是：用化学诱变剂处理微 生物，并用创造性的筛选技术来检出已获 得优良性状的突变菌株。 • 尽管这种方法已被广泛地接受并已取得好 的效果，但对突变株的遗传和代谢性状的 鉴定是很不够的，更何况诱变是随机的， 科学不足技巧补 。
优势
• 尽管在所有的菌种改良方案中都有某种定 向的含义，但与随机诱变育种相比较，在 代谢工程中工作计划的定向性更加集中更 加有针对性。这定向性在酶的目标的选择， 实验的设计，数据的分析上起着支配的作 用。
目标
• 代谢工程的主要目标是识别特定的遗传操 作和环境条件的控制，以增强生物技术过 程的产率及生产能力，或对细胞性质进行 总体改性。
第四章_代谢工程的基本思想
二、生物合成途径的遗传控制
五字策略：进、通、节、堵、出
二、生物合成途径的遗传控制
营养缺陷型 抗反馈调节
遗传改造
产物降解酶缺失 增加前体物的合成 细胞膜组分缺失
二、生物合成途径的遗传控制
营养缺陷型
营养缺陷型（auxotroph）：野生型菌株经诱变剂
处理后，由于发生了丧失某种酶合成能力的突变，因
二、生物合成途径的遗传控制 分支途径
营养缺陷型
菌株失去了F——G的能力，因此限量添加G可以
积累F
二、生物合成途径的遗传控制 分支途径
营养缺陷型
通常I、E协同反馈调节途径第一个酶，但该菌株丧失
了C——F的能力，是I、G的双缺陷型突变株。若在培
养基中亚适量添加I、G ，那么就解除了I、E对第一个 酶的协同反馈调节 ，使终产物E大量积累，所以只要选
是个别酶的特性
微生物代谢的人工控制
微生物在正常情况下，通过细胞内自我调节，维持各 个代谢途径的相互协调，使其代谢产物既不少又不会 过多的积累，而人类利用微生物进行发酵则需要微生
物积累较多的代谢产物，为此对微生物的代谢必须进
行人工控制 人工控制微生物代谢的方法主要有两种 改变微生物的遗传特征 控制发酵条件
黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在以糖质原料
发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱 由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由丙酮酸或磷酸
烯醇式丙酮酸羧化生成的。即由两个CO2固定化反应体系，其中以
丙酮酸羧化酶作用下固定化CO2生成草酰乙酸为主
四、柠檬酸发酵
育F-或G-、I-缺陷型突变株就可以积累E
二、生物合成途径的遗传控制
化学合成生物学中的代谢工程技术
化学合成生物学中的代谢工程技术化学合成生物学是一种将生物学和化学合成相结合的新兴学科。
代谢工程技术是化学合成生物学中的重要分支，它通过改造生物体内的代谢网络，使得生物体能够高效地生产有价值的化合物。
在这篇文章中，我们将探讨代谢工程技术在化学合成生物学中的应用。
1. 代谢工程技术的基本原理代谢工程技术的基本原理是在生物体内调节代谢网络，以增强目标产物的合成效率。
在代谢网络中，代谢产物和代谢途径之间存在着复杂的相互作用。
通过了解代谢网络的结构和功能，可以设计出针对目标代谢途径的基因工程策略，从而优化代谢产物的合成效率。
代谢工程技术主要包括基因编辑、信号传导调节、细胞工程和代谢调节等技术。
其中，基因编辑技术是最为常见的代谢工程技术之一，它通过改变生物体内目标基因的DNA序列，来改变目标产物的合成效率。
信号传导调节技术则是通过调节细胞内的信号传递通路来改变代谢途径的活性。
细胞工程技术则是通过改变细胞内的状态和环境，来优化代谢产物的合成效率。
而代谢调节技术则是通过调节代谢网络内不同代谢路线之间的平衡关系，来优化目标产物的分配比例。
2. 代谢工程技术的应用范围代谢工程技术在化学合成生物学中的应用范围非常广泛，可以涉及到从单细胞生物到高等真核生物，从生物制药到工业化学品的生产等诸多领域。
例如，代谢工程技术可以应用于生物制药领域。
在过去的几十年中，由于研究人员对代谢工程技术的不断发展，已经有许多生物制药品种得到了大规模生产。
比如，在遗传工程疫苗的生产中，代谢工程技术可以调节生物体内的代谢网络，使得生物体能够产生有效的疫苗免疫原，来使人体产生相应的免疫能力。
同时，代谢工程技术还可以优化生长条件和工艺参数等关键因素，以实现对生产过程的精细控制和优化。
除了生物制药领域之外，代谢工程技术还可以应用于其他诸多领域。
比如，在工业生产中，代谢工程技术可以优化微生物的代谢途径，促进生物体内目标产物的合成效率。
例如，在乙酸乙酯的生产过程中，代谢工程技术可以通过改变琼脂糖的种类和浓度来调节微生物体内的代谢平衡，以实现琼脂糖生产的高效和规模化。
代谢工程
组合生物合成举例
• 聚酮类化合物 • 简单脂肪酸
聚酮合酶(PKS) 聚酮类化合物
聚酮类化合物的组合生物合成
• 聚酮化合物中碳链骨架的构成单位与催化其 形成的PKS 模块之间有着一一对应的关系
聚酮类化合物的组合生物合成
• 聚酮化合物中骨架结构的改进( 如更改链长 度、环体系等)可以通过改变相应的PKS模 块来实现
获得小分子的新途径
• Escherichia coli萘加双氧酶的gene
？
能将Trp转化为合成靛蓝
获得小分子的新途径
• Escherichia coli编码酪氨酸酶的gene
Tyr
多巴醌
黑色素
组合生物合成
合生物合成
• 通过对微生物次级代谢产物合成途径中涉 及到的一些酶的编码基因进行操作(如替换、 阻断、重组等)来改变生物合成途径产生新 的代谢旁路, 利用天然产物生物合成机制获 得大量新的“非天然”天然产物的方法。
植物细胞的代谢工程
• 栽培大量植物 • 将植物有关基因转移到微生物中 • 植物体内实施代谢工程植物细胞大规模培 养
植物细胞的代谢工程
• 次生代谢关键酶基因工程 • 转录因子或调节基因的基因工程
次生代谢关键酶基因工程
• 基因的剔除 对于部分不利于营养品质或加工品质提高的 植物次生代谢物，可通过反义基因的遗传转 化抑制其合成途径中有关基因的表达，减少 植物合成特定次生代谢物，从而提高植物产 品的品质
重组途径的代谢调控工程
• Solution
设计能够传感细胞代谢状态从而调节重组途 径表达的动态调控系统----代谢调控工程
重组途径的代谢调控工程
• 反映细胞代谢状态的信号分子是动态调控 系统的重要组成部分 • 选用乙酰磷酸体为信号分子，因为它可以 调节受营养成分有效性影响的各种操纵子
运动生物化学第04章运动时的物质代谢和能量代谢_OK
10、 磷酸烯醇式丙酮酸将磷酰基转移给ADP形成ATP和丙酮酸 ★
意义：以上10步是糖代谢的共同途径
第四阶段：乳酸生成★ 至此，每分子葡萄糖生成2分子乳酸。
39
（二）糖酵解中ATP的生成
1．ATP生成方式 糖酵解反应中，形成了两个高能磷酸化合物 1，3一二磷酸甘油酸 磷酸烯醇式丙酮酸
ATP则由上述两个高能磷酸化合物 通过底物磷酸化方式生成。
26
第三节 运动时的无氧代谢供能
大强度剧烈运动时，骨骼 肌可利用磷酸肌酸、糖酵解释放 能量合成ATP,并分别构成磷酸原 供能系统和糖酵解供能系统.由于 以上两种代谢过程都不利用氧， 因此统称为无氧代谢。
27
一、磷酸原供能系统
ATP、CP分子内均含有高能磷酸键，在 供能代谢中，均能通过转移磷酸基团过 程释放能量，所以将ATP、CP分解反应 组成的供能系统称作磷酸原供能系统。
O=C O P
C OH
CH2 O P
1,3-二磷酸 甘油酸
ADP
ATP
磷酸甘油酸激 酶
COOH
C OH
CH2 O P
3-磷酸甘油 酸
23
（二）氧化磷酸化
代谢物脱下的氢，经特定的共 轭氧化-还原对组成的递氢、递电子 体系传递，逐级氧化最后与氧结合 生成水，因氧化-还原电位的变化伴 有能量的释放，使ADP磷酸化生成
2、 G-6-P异构化，生成6-磷酸果糖（F-6-P） ★
3、 F-6-P磷酸化，生成1，6-二磷酸果糖（F-1、6-2P）
该步反应再消耗一分子ATP
★
37
第二阶段：磷酸丙糖生成
4、 F-1、6-2P裂解成3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮★ 5、 磷酸三碳糖的异构化★
代谢工程的基本概念
限制性遗传信息之谜
微生物代谢工程
代谢流及其控制的分析
微生物细胞能为其自身提供代谢能 微生物细胞的生存方式与动物、植物等高等生物的细胞不同，微生物细胞能独立存在、自主生活。因此每个微生物细胞都具有能量转换机构，这种机构可把其它形式的能量转换成能被其自身直接使用的能量(如 ATP、GTP 和储存在膜上的质子运动势 ΔP )，暂且把它们称为代谢能。在代谢能的直接支撑下，活细胞才能维持其高度有序的状态。
细胞能量转换机构的组成 微生物细胞的能量转换机构包括：需要代谢能来激活的代谢途径的有关的酶和这些酶的辅酶、原核微生物的细胞质膜和真核微生物线粒体的内膜，以及这些膜上的电子传递链和ATP酶，还有在能量代谢和主动输送中起辅助作用的有关载体系统。
微生物细胞代谢的电子流和电子回路 工业发酵普遍使用的化能异养型微生物靠生物氧化把化学能转化为可被微生物直接利用的代谢能。微生物细胞的生物氧化过程必须借助于辅酶，并且其生物氧化过程和跨膜的主动输送过程伴随着电子(或质子)的流动，形成微生物代谢的跨膜的质子回路。
1
进，促进细胞对碳源营养物质的吸收；
2
通，使来自上游和各个注入分支的碳架物质能畅通地流向目的产物；
3
节，阻塞与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物；
4
堵，消除或削弱目的产物进一步代谢的途径；
5
出，促进目的产物向胞外空间分泌。
代谢网络的节点及其刚性 微生物代谢网络中的途径的交叉点(代谢流的集散处)叫做节点(node)，微生物自动抵制节点处代谢物流量分配比率的改变的特性叫做节点的刚性。节点的刚性取决于微生物代谢的自动调节机制。因此在应用 “ 五字策略 ” 制订育种方案时必须认真考虑节点刚性问题，尽量采用解除反馈调节的育种手段。
代谢工程
相关的基因如果以基因簇的形式存在，往往能 更便利。
2 修补完善细胞内部分支途径，以合成新的代谢产物
29
四、代谢工程发展趋势
传统的代谢工程是以代谢网络理论为 基础，以代谢分析和代谢改造为主要手段。 代谢途径的复杂性给检测分析带来不少麻 年代末兴起的逆世纪烦，在某种程度上阻 碍了它的应用。 逆代谢工程
18
(2) 分析技术 在获得大量生化反应基本数据的基 础上，采用化学计量学、分子反应动力学 和化学 程学的研究方法并结合先进的计算 机技术，可以进一步阐明细胞代谢网络的 动态特征与控制机理，以确定代谢改造的 思路。这些分析手段包括能准确测定细胞 内代谢网络流的稳态法、展示代谢流控制 过程的扰动法、简化复杂代等提出的的组 合法以及代谢网络优化技术等。
20
3 代谢改造思路
• 代谢工程研究的重点在于改造代谢网络， 以便生产特定目的代谢产物或具有过量生 产能力的工程菌应用于工业生产。根据微 生物的不同代谢特性，常采用改变代谢流、 扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种方 法。
21
(1)改变代谢途径方法 加速限速反应 增加限速酶的表达量，来提高产物 产率。然而限速酶反应的改变可能会给 整个代谢网络带来负面影响。 改变分支代谢途径流向 提高代谢分支点某一分支代谢途径 酶活力，使其在与其它的分支代谢途径 的竞争中占据优势，从而提高目的代中克隆和表达特定外源基因， 从而延伸代谢途径，以生产新的代谢产物 和提高产率。扩展代谢途径还可使宿主菌 能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗 的底物。 (3)转移或构建新的代谢途 通过转移代谢途径、构建新的代谢途 径等方法来实现。
23
4 代谢设计原理
一、在现存代谢途径中改变目的产物代谢流 增加目的产物代谢流从以下方面入手： 1 增加限速酶编码基因的拷贝数 没有改变代谢流，只是增加了酶的量， 提高了中间物的浓度，从而提高限速反应的 反应速率。 2 强化以启动子为主的关键基因的表达系统 可以提高产物的转化率 3 提高目标途径激活因子的合成速率
代谢工程-王勇
代谢工程一、代谢工程的产生及沿革〔了解〕1 代谢控制发酵：依赖于用化学诱变剂处理微生物并进行设计的筛选技术获得定向优良性状的突变株。
传统诱变是随机的，定向与随机诱变没有直接关系。
2 基因工程理论和技术：对代谢途径的指定酶进行精确修饰。
3 代谢流定量分析技术：对已有的代谢网络的信息建立胞内主要反响的化学计量模型和胞内代谢产物的质量平和，以实际测得的分泌到胞外的代谢中间产物的浓度，推算代谢流量。
〔根底是拟稳态假设〕4 生化工程在线检测和建模方法：色谱质谱红外，生物传感技术。
二、理论根底〔一〕概念1 利用基因工程技术定向改造细胞的代谢途径，以改善产物的形成和细胞的性能。
2 应用方向：(1) 提高细胞现存代谢途径中天然产物的产量；(2) 改造细胞现存的代谢途径，使其合成新产物，这种新产物可以是中间代谢产物或修饰型的最终产物；(3)对不同细胞的代谢途径进行拟合，构建全新的代谢通路，从而产生细胞自身不能合成的新产物；(4)优化细胞的生物学特性，如：生长速率、极端环境条件和耐受性等。
3 最为突出的特征：是强调生化反响途径与代谢流及其体内条件的控制相关联。
4 一些概念：〔熟悉〕一系列按序进行的生化反响构成生化反响途径，假设这条途径在活细胞里运行，那么为代谢途径。
生化反响途径按生物化学规律汇成生化反响网络，代谢途径与跨膜输送系统按代谢规律汇成代谢网络。
代谢网络理论：各种代谢互相作用、转化、制约。
〔联网〕代谢物在代谢网络中流动形成代谢流，广义的还包含能量流和信息流。
在代谢分析和代谢工程中，代谢流首先指碳架物质流。
在一定的培养条件下，代谢物在代谢网络中流动，流量相对集中的代谢流胶盖培养条件下代谢主流。
具有变动性和选择性。
有代谢物流通过的代谢途径即载流途径。
碳架物质从原料到目的产物流经的隔断代谢途径，按流经的先后次序首尾衔接，为载流路径。
〔代谢工程没必要研究所有载流途径，但必须研究代谢主流〕5 此工程的难题：解决理想载流途径的设计问题；对代谢主流的合理导向问题。
代谢工程概述
代谢工程的一些基本定义
代谢流和碳骨架物质流：代谢物在代谢途径中 流动形成代谢流。在代谢工程领域代谢流往往 是指骨架物质流。
代谢主流：在一定的培养条件下，代谢物再代 谢网络中流动，流量相对集中的代谢流叫做该 条件下的代谢主流。代谢途径的延伸和改变都 会改变代谢主流，从而实现新基质的利用和新 产品的开发。代谢主流的测定是代谢工程的重 要组成部分。
代谢工程的一些基本定义
载流途经：代谢主流流经的代谢途径为主要载流途经， 简称载流途经。在代谢工程研究中载流途经是指碳流 在代谢网络中通过的主要途径。
代谢主流的变动性和选择性：生物细胞的代谢主流处 于不断的变化之中，其方向、流量甚至代谢主流的载 流途经都可能发生变化。这就是代谢主流的变动性和 代谢主流对代谢网络途径的选择性。这种变动和选择 的根据在于生物细胞的遗传物质，选择的原因在于细 胞所处的环境条件的变化。
（2）共合成法在生物合成中的应用
（3）酶的诱导合成和分解代谢产物阻遏
（4）无机磷对生物合成的调节
3.研究生物合成机制的常用方法
（1）刺激实验法
（2）同位素示踪法
（3）洗涤菌丝悬浮法
（4）无细胞抽提法
（5）遗传特性诱变法
代谢工程的研究方法
1分子生物学方法：构建特殊的基因转移系统，尤其对于具有较 高生产价值的微生物，具有重要意义。例如Backman等利用切 割载体获得Tyr营养突变型，为构建苯丙氨酸的生产菌株奠定基 础。
途径工程，张惠展，2003 基因工程原理，吴乃虎，2004 代谢工程，张蓓等，天津大学出版社，2003
01绪论 代谢工程概述 授课教师：李强
本章内容
§1.1代谢工程的产生和概念的演变 §1.2代谢工程的研究内容 §1.3 代谢工程的应用领域和前景
代谢工程概述课件
学习交流PPT
18
3、研究生物合成机制的常用方法 （1）刺激实验法 （2）同位素示踪法 （3）洗涤菌丝悬浮法 （4）无细胞抽提法 （5）遗传特性诱变法
学习交流PPT
19
• 刺激实验法：在发酵培养基中，加入某些可能是 前体的物质，观察该物质在发酵过程中的被利用 情况与促进目的产物生成的效果。
• 洗涤菌丝法（或称静息细胞法）：取不同生长阶 段的菌丝，先洗去沾染的原培养基成分及代谢产 物，然后将菌丝悬浮于人工培养系统内，在一定 条件下继续观察被试验的化合物对菌体代谢和对 产物合成的影响。
学习交流PPT
23
• 3、数学及计算机工具：研究代谢工程不仅需要遗 传学知识，而且需要对寄主菌的生化代谢途径和 生理学有深入的理解，所以将DNA数据库的信息 应用于代谢工程并开发出适合的软件系统是十分 必要的，Karp等构建了981个生命体化合物数据库， 为未来的发展奠定了基础。人们已在实验的基础
代谢工程
( Metabolic Engineering )
学习交流PPT
1
第一节 代谢工程概述
现代生物技术手段主要包括：
• 基因工程 (Gene Engineering) • 细胞工程 (Cell Engineering) • 发酵工程 (Fermentation Engineering) • 酶工程 (Enzyme Engineering)
• （1）1988年MacQuitty指出，微生物途径工程 (Microbial Pathway engineering)是利用DNA重 组技术修饰各种代谢途径（包括生物体非固有 的代谢途径），提高特定代谢物的产量。
• （ 2 ） 1991 年 Bailey 将 代 谢 工 程 (Metabolic engineering)定义为：利用DNA重组技术优化细 胞的酶活、转运和调控功能，提高细胞活力。
代谢工程概述及应用
代谢工程的应用
菌种改良书生物技术发展的一个重要组成部分，而代 谢工程可以指导我们更好的进行改良。 目标：（1）优化细胞的生物学特性，提高细胞现存代谢 目标 途径中目的代谢物的产量及产率。 （2）拓宽对基质的利用范围，降低成本。 方法：基因工程技术和常规诱变技术 方法
应用实例： 乳酸高产菌的研究 应用实例：D-乳酸高产菌的研究
代谢工程概述及其应用
组员：徐俊 费文斌 薛刚 何剑
代谢工程基本概念
代谢工程：是一门利用分子生物学原理系统分析细胞 代谢工程 代谢网络，并通过DNA重组技术对细胞的酶、转运及 调控功能进行修饰，进而完成细胞特性改造的应用性 学科。（Bailey） 代谢途径：催化总的代谢物的转化、信息传递和其他 代谢途径 细胞功能的酶促反应的集合 代谢网络：分解代谢途径、合成代谢途径和膜输送体 代谢网络 系的有序组合构成代谢网络。
将高产菌株Y2-4和Y2-8传代，从上表可知其产酸能力较筛选初期有 和 传代， 将高产菌株 传代 所下降，但基本稳定，产酸变化在± 所下降，但基本稳定，产酸变化在±10%以内 以内
参考文献
Baliey J . E. Science ,1991 ,252 :1668 –1675
胡永红, 管珺, 杨文革等. 发酵法生产D-乳酸的研究进展[J]．食品与发酵工业, 2007, 33(12): 99-103. Ishida N, Suzuki T, Tokuhiro K, et al. D-lactic acid production by metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae [J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2006, 101: 172-177. Okino S, Suda M, Fujikura K, et al. Production of D-lactic acid by Corynebacterium glutamicum under oxygen deprivation [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 78: 449-454. 其他主要参考许婷婷博士论文《 离子束诱变选rtp诱变育种产d乳酸大肠杆菌w3110中的丙酮酸代谢途径的改造该菌株在只含葡萄糖及无机盐的培养基中对糖的总转化率接近理论最大值达到98d乳酸产量达到485ishida等人利用酿酒酵母成功构建了一株产d乳酸的代谢工程菌在这个重组体里原先的丙酮酸脱羧酶编码区被完全去除取而代之的是d乳酸脱氢酶的两个拷贝
代谢工程---精品管理资料
代谢工程:(部分）把量化代谢流及其控制的工程分析方法和用以精确制订遗传修饰方案并付之实施的分子生物学综合技术结合起来,以上述“分析—-综合”反复交替操作、螺旋式逼近目标的方式，在较广范围内改善细胞性能,以满足人类对生物的特定需求的生物工程。
代谢工程与随机诱变育种的优势：在代谢工程中工作计划的定向性更加集中,更加有针对性。
这定向性在酶的目标的选择，实验的设计，数据的分析上起着支配的作用.代谢工程可在细胞与分子水平上认识和改造细胞过程,其不仅在解释细胞生理特性上具有重要的科学意义，而且其潜在的应用跨越了生物技术的全部领域,主要包括：(1）异源蛋白的生产；(2)扩大底物利用范围；（3）生产原来不存在的新物质；（4）对环境有害物质的降解；（5)提高菌体对环境的适应能力;（6）阻断或降低副产物的生成；(7)代谢产品生产速率和生产能力的提高;(8）植物代谢工程;（9)动物代谢工程；(10）人体和组织代谢工程一人类疾病诊断和基因治疗。
代谢途径是将一组特定的流入和流出代谢物质联系在一起的一个生化反应序列。
代谢流(物流/通量)（flux）：流入代谢物经该途径转变为流出物的速率。
代谢网络可视为由若干个串联或并联的简单子途径组成，它们通过节点相连.节点分为柔性、强刚性及弱刚性节点三类。
柔性节点：是指由节点流向各分支的代谢流量分割率随代谢要求发生相应的变化，去除产物的反馈抑制后，该分支的代谢流量分割率大大增加。
强刚性节点:是指由节点流向某一分支或某些分支的代谢流量分割率是难以改变的，这是由产物的反馈抑制及对另一分支酶的反式激活的相互作用所致。
弱刚性节点：介于前两者之间,由该节点流向各分支的代谢流中有一个是占主导地位的，其酶活较高或对节点代谢的亲和力较大，且无反馈抑制，通过削弱主导分支的酶量或酶活可增加产物的产率。
代谢物流分析：一种计算流经各种途径的通量的技术,用于描述不同途径的相互作用和围绕支点的物流分布。
代谢控制分析：物流控制被分布在途径的所有步骤中，只是若干步骤的物流比其他的更大些,可用数学方程来描述反应网络内的控制机制，即用一途径的物流和以物流控制系数来定量表示酶活之间的关系。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
生物技术制药
代谢工程发展的目标
(1) 提高细胞现存代谢途径中天然产物的产量； (2) 改造细胞现存代谢途径，使其合成新产物， 这种新产物可以是中间代谢产物或修饰性的 最终产物； (3) 对不同细胞的代谢途径进行拟合，构建全 新的代谢通路，从而产生细胞自身不能合成 的新产物； (4) 优化细胞的生物学特性，如生长速率，对 某些极端环境条件的耐受性等。
生物技术制药
推理性代谢工程
推理性代谢工程（简称代谢工程）是采用重 组DNA技术通过改变细胞内有关酶量、酶活 和调节功能而改变细胞的遗传特性以改进微 生物某方面代谢活性，最大限度地提高目的 产物产率的一门技术。其实质是对代谢流量 及控制进行定量分析和在此基础上的代谢改 造。与传统的菌株改造技术不同，是一种有 目的、有理性的改造。
生物技术制药
扩展代谢途径
代谢途径的后延： 草生欧文氏菌产2-酮基古龙酸(2-KLG) 7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的合成 代谢途径的前伸： 利用乳清生产黄原胶
生物技术制药
草生欧文氏菌产2 草生欧文氏菌产2-酮基古龙酸
维生素C前体2 酮基古龙酸(2-KLG)的合成 维生素C前体2-酮基古龙酸(2-KLG)的合成 (2 草生欧文氏菌可转化葡萄糖生成2，5-二酮基葡萄糖酸(2,5DKG)。 棒杆菌2，5-二酮基葡萄糖酸还原酶可转化2，5-二酮基葡萄 糖酸生成2-酮基古龙酸。 将棒杆菌2，5-DKG还原酶转入草生欧文氏菌，这种重组的草 生欧文氏菌可直接转化葡萄糖生成2-酮基古龙酸。但目前产 量还不高。 产量不高的原因：在草生欧文氏菌中发现有2-酮基醛酸还原 酶(KR)，它能把2-酮基古龙酸转化成艾杜糖酸。 如将草生欧文氏菌总的2-酮基醛酸还原酶缺失掉，有可能提 高2-酮基古龙酸。
生物技术制药
抑制副产物的分支途径
通过抑制生成副产物的分支途径的酶活， 削弱这些分支途径的竞争能力，加大目的 产物合成途径的代谢流量，从而提高目的 产物的产量。
生物技术制药
构建代谢旁路
乙酸是糖代谢的末端产物，在发酵过程中，乙酸浓度过高会 抑制菌体的生长和目的产物的合成。 控制和去除乙酸的方法很多，一是从工艺上考虑，二是对生 产菌种进行改造。 改造菌种的方法之一是建立代谢旁路： 1. 将枯草杆菌的乙酰乳酸合成酶基因重组入大肠杆菌，可明 显改变细胞糖代谢的流向，使乙酸浓度保持在低于允许浓度 之下。 2. 把运动发酵单孢菌的丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因 重组入大肠杆菌，可使工程菌不积累乙酸而是产生乙醇。
生物技术制药
第四章 代谢工程概述
生物技术制药
代谢
代谢是生命活动的基础。机体，或者说细胞，一方 面通过代谢获得各种需要的物质和能量，另一方面 又通过代谢降解不需要的和有害的物质。 代谢过程中，几乎所有的生化反应都是由酶催化完 成的。可通过调节酶的活性来调控代谢途径，包括 代谢流向和流量大小的调节。 次级代谢产物的合成途径远比初级代谢产物复杂得 多，一般都涉及好多种酶，而且反应过程相当复杂， 对它们的调控也困难得多。 传统发酵过程中通常通过控制培养条件以及应用突 变菌株实现代谢调控
生物技术制药
在一个简单的双节点网络中，对于独立型网络，节点1或2处的 流量分配向有利于形成产物P的方向改变，能提高目的产物P的转化 率，但在依赖型网络中，若要提高转化率，这两个节点的流量分配 都必须改变。
生物技术制药
生物技术制药
推理性代谢工程设计
改变代谢流向 扩展代谢途径 构建新的代谢途径
生物技术制药
改变代谢流向
通过改变分支途径的流量大小，增强目的 产物的合成，阻断代谢副产物的生成。 改变代谢流向的几种情况: 解除“限速瓶颈” 抑制副产物的分支途径 构建代谢旁路 改变能量代谢途径
生物技术制药
解除“限速瓶颈” 解除“限速瓶颈”
研究分析产物合成代谢网络的各相关分支 途径，找出影响目的产物合成的限速步骤、 所参与的关键酶及其基因，通过增加关键 酶基因的拷贝数，提高该步骤的酶活，以 解除瓶颈效应，达到增加目的产物产量的 目的。
生物技术制药
刚性节点
若一个节点的一个或多个分支的分配率被 严密控制，则称该节点是强刚性的。这种 控制通常是通过反馈控制和一个代谢物对 另一个分支的酶的交叉激活这两种作用的 结合来实现的。 一般地, 在强刚性节点的流量分配不易改变， 因为与分支点相关联的各种酶的动力学需 要特定的修饰。
生物技术制药
生物技术制药
代谢工程
代谢工程（Metabolic Engineering），亦称途径 工程（Pathway Engineering）和代谢设计 （Metabolic Design），是一门利用分子生物学原 理系统分析细胞代谢网络、并通过DNA重组技术合 理设计细胞代谢途径及遗传修饰，进而完成细胞特 性改造的应用性学科。 鉴于它涉及到多基因的联合协同表达控制机制，因 此也被称作第三代基因工程。 按照其研究策略的不同又分为推理性代谢工程 （Constructive Metabolic Engineering）及逆代 谢工程（Inverse Metabolic Engineering）。
生物技术制药
构建新的代谢途径
杂合抗生素的合成：将携带有天蓝色链霉菌完 整放线紫红素（act）基因簇的质粒pIJ2303， 转入二氢榴菌素（dihydro-granaticin）的产 生菌S. violaceoruber TU22中，结果产生了 新的杂合聚酮体-双氢榴紫菌素。 这一杂合抗生素在C-15位上具有二氢榴菌素的 立体结构，在C-3位上具有放线紫红素的立体 结构。它的产生反映了act和gra两个基因簇编 码的C-还原酶/脱氢酶之间相互作用，出现了 新的代谢途径 。
网络结构的基本类型
如果一个网络（或亚网络）中的每个节点向终端产 物贡献一个按化学计量消耗的组成部分，则这样的 网络（或亚网络）被认为是依赖型 依赖型的。在这种网络 依赖型 中，所有分支中的流量必须达到化学计量平衡，以 防止胞内成份的累积和分泌。在此限制下，组成此 网络的全部主要节点处的流量分配必须协调，并且 所有主要节点必须视为同样重要。 相反，若从主要节点形成的代谢产物不缩合，则认 为该网络是独立型 独立型的， 只要改变在单一节点上的 独立型 流量分配就有可能提高产物转化率。
生物技术制药
改变能量代谢的途径
代谢工程技术可以直接应用于与合成目的 产物相关的分支途径的修饰和改变； 也可通过改变能量代谢途径或电子传递系 统间接地影响或改变细胞的代谢流向。
生物技术制药
透明颤菌血红蛋白的应用
透明颤菌血红蛋白(VHb)是透明颤菌在微氧条件下 诱导产生。VHb有两个亚基，有146aa组成，分子 量约1.56kD。 将VHb基因(vgb)重组入酿酒酵母，表达产生的VHb 可活跃电子传达链，间接影响到线粒体的乙醛歧 化途径，使乙醇的产量明显提高。 将vgb基因克隆入大肠杆菌或链霉菌，不仅可在限 氧条件下提高宿主菌的生长速率，还可促进蛋白 质和抗生素的合成。 在此，vgb基因的引入不是直接作用于生物合成途 径，而是提高了ATP的产生效率。
生物技术制药
半柔性节点
若在一个节点的流量分配由它的一个分支的 动力学占优势, 则称该节点是半柔性节点。 分支动力学指的是用于构成分支的所有酶归 并在一起的响应。这可能是由于节点代谢物 的酶的高活性和高亲和性, 及在优势分支中缺 少反馈抑制。即使从属的分支(流向产物的分 支) 解除调节, 还是有相当大一流量依然进入 优势分支,从而限制产物的转化率。 弱刚性节点对“诱变—筛选”技术还是典型 顺从的。
生物技术制药
代谢网络结构
代谢网络分流处的代谢产物称为节点。 对终产物起决定作用的节点称为主节点。在 一网络中主节点可有少数几个。 节点是可变的，主节点也不例外。 根据节点下游分支的可变程度，节点可分为 三类：柔性节点、半柔性节点和刚性节点。
生物技术制药
柔性节点
在柔性节点, 导向每一分支的酶对节点代谢 物的亲和性相近似, 每个分支的反应速度也 相近, 每一分支的流量受相应的终端产物反 馈抑制控制。 对于分支流量分布的改变,柔性节点是最“顺 从”的。
生物技术制药
头孢菌素C 头孢菌素C生产菌株的改进
头孢菌素C高产菌株C.acremonium394-4的改 进：原发酵液中有青霉素N积累，说明其后 的DACS/DAOCS催化的反应可能是限速步骤。 利用基因工程技术将带有cefEF基因的整合 型重组质粒转入该菌株后，在其染色体Ⅲ整 合上了一拷贝附加的cefEF基因(内源cefEF 基因在染色体Ⅱ上)。从而使DACS/DAOCS的 酶活提高了一倍，在中试发酵液中无青霉素 N积累，头孢菌素C的产量增加了15%。
生物技术制药
7-氨基头孢烷酸的合成
7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是半合成头孢菌素的重要母核之一。 目前以头孢菌素C为原料，用头孢菌素C酰化酶生产7-氨基头 孢烷酸的工艺因酶来源的困难而难以进行。 生产7-氨基头孢烷酸的另一途径是将D-氨基氧化酶基因和GL酰化酶基因置于顶头孢霉的碱性蛋白酶基因调控序列的下游， 转入生产头孢菌素的顶头孢霉中，该菌的发酵液中积累有7氨基头孢烷酸。 目前该途径的产量还很低，原因是D-氨基氧化酶催化的反应， 能同时产生过氧化氢，使原料(底物)、产物和酶发生氧化降 解。
生物技术制药
利用乳清生产黄原胶
野油菜单孢菌不能利用乳清发酵生产黄原胶。 将大肠杆菌的LacYZ基因和Lpp核糖体结合位点一 起克隆入野油菜单孢菌，所得的工程菌可以利用 乳清来生产黄原胶。 说明其代谢途径已向前延伸。
生物技术制药
转移代谢途径
在真养产碱菌等细菌中，在限制生长和碳源 过量的条件下，细胞内可大量积累聚羟基丁 酸(PHB)或聚羟基烷酸(PHA)。这些聚合物可 生物降解，成为生物可降解塑料。 将真养产碱菌的PHB操纵子包括PGB多聚酶、 硫解酶和还原酶的基因克隆入大肠杆菌，该 工程菌即能与真养产碱菌一样，在氮源耗尽 时可积累PHB，产量达细胞重量的50%。
生物技术制药