免疫组化染色过程中存在的问题
免疫组织化学染色过程中出现问题及对策
1941年co ons首先用荧光素标记抗体,检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功,从而创建了免疫组织化学技术。
经过60余年的不断发展,由最初的直接免疫荧光标记法,逐渐发展出现了间接法,免疫酶法,免疫胶体金法,酶标记复合法等等。
该方法的敏感性和特异性不断得到提高,使其成为医学和生命科学领域中研究组织形态、功能和代谢的一项有力工具[1—3]。
随着该技术应用的普及和深入,免疫组织化学(免疫组化)染色技术作为病理诊断的主要辅助手段,各种新技术的引入以及新抗体相继问世,使免疫组织化学技术得到了更广泛的推广和应用,为临床病理诊断、肿瘤性质的判定、预后的估测等提供了重要依据。
但是,由于影响其操作的因素较多,免疫组化质量不稳定常常困扰着免疫组化工作人员。
本文举出了一些染色过程中出现的问题,并分析其中可能原因。
1.阴性反应染色结束后,切片中见不到任何阳性信号。
排除掉组织或细胞中确实不表达与抗体相关的抗原的原因外,还可能是染色过程中的某一或某些环节出了问题,出现了假阴性结果。
可能原因如下:1.1操作失误有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达,却未进行抗原修复[1,2];或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体;或一抗失效,也可见于染色过程中漏掉了某一环节;还可能是所选用的检测系统与一抗不匹配,如选用的一抗是兔源性抗体,二抗错选了抗鼠源性抗体。
解决办法:在三抗孵育结束时,将切片上的三抗滴在一张白纸上,再将配制好的DAB滴在白纸的三抗上,观察是否出现棕色。
如果出现了,证明三抗和DAB的配制过程正确。
如果不出现棕色反应,则三抗或DAB的配制过程有误。
1.2假阴性造成假阴性结果的因素一般来自三方面:1.组织处理不当,抗原损失过多或被遮蔽;2.抗体(包括特异性一抗和标记抗体)失活,效价过低或稀释度不合适;3.染色步骤的差错或其他试剂的问题,如显色剂、缓冲液的离子强度及ph值[3]。
解决阴性染色的问题,需要设立“阳性对照”和“阴性对照”。
免疫染色 失败原因
免疫染色失败原因免疫染色在科学研究中被广泛应用，可以用于检测细胞、组织中特定的蛋白质或其他分子的存在和定位。
然而，尽管免疫染色技术已经发展了多年，但仍然会出现失败的情况。
免疫染色失败的原因有很多，下面将就一些常见的失败原因进行分析和讨论。
首先，样品的处理不当是导致免疫染色失败的一个重要原因。
在进行免疫染色实验之前，样品的处理非常关键，包括固定、包埋、切片等步骤。
如果这些步骤中有一个出了问题，都有可能导致实验失败。
例如，如果固定的时间过长或者过短，都会影响到抗体的结合效果；如果切片的厚度不均匀，也会导致染色不均匀。
因此，在进行免疫染色实验之前，一定要仔细地对样品进行处理，确保每一个步骤都正确无误。
其次，抗体的选择也是影响免疫染色结果的重要因素。
选择合适的抗体对于免疫染色实验的成功至关重要。
如果选择的抗体不具有足够的特异性或敏感性，可能会导致假阳性或假阴性结果。
因此，在选择抗体的时候，一定要根据实验的需要进行充分的筛选和验证，确保抗体的质量和性能。
另外，实验操作的技术水平也会直接影响到免疫染色的结果。
免疫染色实验通常需要较高的技术要求，包括对实验步骤的熟练掌握、对仪器设备的熟悉等。
如果操作过程中出现了技术操作不当、仪器设备故障等问题，都有可能导致免疫染色失败。
因此，在进行免疫染色实验时，一定要确保实验操作人员具有较高的技术水平，并严格按照实验步骤进行操作。
此外，实验环境的干净度和实验条件的稳定性也对免疫染色的结果有直接影响。
实验室环境的干净度对于免疫染色实验非常重要，任何细微的干扰都有可能影响到实验结果。
同时，实验条件的稳定性也是保证实验可重复性的关键因素，包括温度、湿度、光照等条件都需要保持稳定。
因此，在进行免疫染色实验时，一定要确保实验环境的干净度和实验条件的稳定性，以保证实验结果的准确性和可重复性。
总的来说，免疫染色失败的原因是多方面的，可能由于样品的处理不当、抗体选择不当、实验操作的技术水平不高、实验环境的干净度不够或实验条件的不稳定等原因造成。
免疫组化染色结果不清爽的原因
免疫组化染色结果不清爽的原因
免疫组化染色是一种重要的实验技术，用于检测细胞或组织中的蛋白质表达。
但是，有时候免疫组化染色结果会不清晰，这可能是由于以下原因：
1. 样品质量不佳。
如果样品中的蛋白质含量不足或存在严重的脱水、变性或降解等现象，免疫组化染色结果可能会不清晰。
2. 抗体质量问题。
如果使用的抗体质量不佳，可能会导致免疫组化染色结果不清晰。
例如，抗体可能过期了，或者存在批次差异。
3. 操作不当。
在免疫组化染色过程中，如果操作不规范或者不仔细，可能会导致结果不清晰。
例如，过度洗涤、过度染色或者不恰当的显色反应条件等。
4. 数据分析问题。
如果在数据分析过程中没有正确地处理图像，可能会导致结果不清晰。
例如，图像可能过于模糊或者过于亮，这可能会影响结果的解读。
因此，在进行免疫组化染色实验时，需要注意样品质量、抗体选择和操作规范等问题，以确保结果的清晰和可靠性。
- 1 -。
病理诊断中免疫组织化学技术常见问题及改进
高 压高 温修 复效果更 好一些 。应在 达到 预设温 度后维 持 １５— ｉ ． ３ｍｎ为佳 。
２ 脱 片的 常见 原 因及 改进 措施
补体 相互 联接 而 出现非 特异 性 背 景着 色 ， 作 中多见 工
于 冰冻组 织染 色 。
１４ 内源 性生 物 素 一卵 白素 ．
１９ ９４年 Ｃｕｉ ａｌ等 报
定液有不 同渗 透 能力 和 固定作 用 ， 应根 据 需 要进 行 选 择， 常规采用 的是 ｌ Ｏ％ 中性 甲醛 固定 液。浓 度过高 会 阻止 固定 液正 常渗透 ， 度过 低 固定则 不彻底 。固定时 浓
间过长或过 短也是 重要 的影 响 因素。 固定 时 间过 短抗 原没有得到充分保护， 固定时间过长会形成更多的抗原 交联 而影 响抗原 和抗 体的正 常结 合 。所 以建 议小 标本
免 疫组化 的组 织切 片 必须 经 过 高 温 、 高压 或 酶 消
化及 多次洗 涤等步 骤 ， 载玻 片上 因粘 附不 牢而脱 片 。 在
道人 体 唾液腺 导管 上皮 细胞 存 在 生 物素 以来 ， 们逐 人
步认 识 到冷冻 组织 中存在生 物素 一卵 白素 。经 甲醛 固 定、 石蜡包 埋后 的组织 中生物 素 一卵 白素 被封 闭 ， 加热 抗原 修 复可导 致生物 素 一 白素暴 露 。因此一 般采用 卵
脱片受许多因素影响 ， 如载玻片清洁程度与防脱片剂 包被 、 蜡块选择与切片厚薄、 烤片程度与抗原修复等。 ２ １ 载玻 片防脱剂 的包被 干净 的载玻 片是免 疫组化 ．
正 常染色 的前提 和基 础 ， 一般建 议采用新 的载 玻片 。防 脱 剂一般采用 多聚赖 氨酸溶 液 （ Ｅ Ｓ 。由于多 聚赖氨 Ｐｔ ）
免疫组化的关键步骤、常见问题和解决方案
免疫组化的关键步骤、常见问题和解决方案摘要】免疫组织化学技术是广泛应用于临床病理实验室的一项基本技术，操作简单，灵敏度高，特异性强，对辅助临床治疗方案和鉴别诊断都有特别的应用价值。
但是要保证每一批实验结果的准确性、可靠性，就需要注意每次操作的细节，并需要日积月累的经验总结。
下面是本人对免疫组化中一些细节问题的体会。
【关键词】免疫组化；问题；方案材料和方法【中图分类号】R319 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）32-0337-02免疫组化技术已广泛应用于临床病理实验室，几乎各个三甲医院都开展了免疫组化技术，为辅助病理诊断和临床治疗、化疗方案提供了很好的帮助，但是要保证每一批实验结果的真实性、可靠性，确实比较难，因为不同的医院做出来的免疫组化结果偶尔会发现不太一样，这就对我们技术人员有一个很高的要求，那就是要注意每次操作的细节，并要日积月累的经验总结，笔者从事病理技术工作近10年，做了近万项免疫组化片子，对免疫组化染色的关键步骤，常见问题和解决方案都一些深刻体会，本文就这些内容来总结一下。
1.临床资料我院免疫组化制片一年近1500项，包括肠癌标本、胃癌标本、乳腺癌标本、间质瘤标本、神经内分泌癌标本，淋巴瘤标本，都需要进行免疫组化染色，帮助临床辅助化疗和鉴别诊断。
对于每次做完一批免疫组化后，我们都会进行质控。
质控的主要目的是发现假阴性或阳性定位是否准确，是否有非特异性背景染色，下面是笔者在工作过程中发现一些必须注意的问题。
1.1标本取材前固定应注意的问题为了达到保存良好的组织形态结构，防止组织自溶和保存某些特殊抗原的目的，需要对组织进行及时固定。
手术切下来的标本要尽早把他放入固定液中，对于一些大的器官或组织，需要剖开固定，固定液最好采用10%中性缓冲甲醛液。
固定时间对抗原的影响：固定不足，使组织中心部位的一些抗原溶解、弥散、丢失，而固定时间过长，抗原掩盖的程度就过重，也不能获得良好的免疫组化染色结果。
免疫组化染色常见问题及解释
一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。
在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。
因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。
另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。
离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。
标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。
虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。
因此，这了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。
二、组织脱水必须彻底干净组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。
如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。
由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成年人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。
因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。
三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。
如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，不平。
免疫组化问题及解决办法
1、染色过强
原因
解决办法
抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长
降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间：室温1小时或4℃过夜
孵育温度过高，孵育温度超过37℃
一般室温20-28℃
DAB显色时间过长或DAB浓ห้องสมุดไป่ตู้过高
显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准
2、非特异性背景染色
原因
解决办法
操作过程中冲洗不充分
每步冲洗3×5
组织中含过氧化物酶未阻断
可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长
组织中含内源性生物素
正常非免疫动物血清再封闭
血清蛋白封闭不充分
延长血清蛋白封闭时间
3、染色弱
原因
解决办法
抗体浓度过低，孵育时间过短
提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟
试剂超过有效使用期
及时更换试剂
一抗与二抗种属连接错误
仔细确定一抗与二抗种属无误
操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释
每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）
室温太低，低于15℃
若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟（或4℃冰箱过夜）
蛋白封闭过度
封闭时间不要超过10分钟
4、染色阴性
原因
解决办法
操作步骤错误
重新试验，设立阳性对照
组织中无抗原
设立阳性对照片，以验证实验结果
5.免疫组化染色中常见问题及处理
病理科常用肿瘤鉴别诊断标记物
免疫组化的临床应用
2、肿瘤的恶性程度与预后判断
近20年来，以P16（宫颈癌）、P504S（前列 腺癌）、Ki-67（肿瘤增殖、预后监测）、 PCNA（肿瘤增殖、预后监测）、P53（癌基 因、预后监测）等为代表的数十种恶性肿瘤 相关抗体相继被广泛应用于肿瘤性质的判断 和预后，从而使恶性肿瘤的辨识更加精确。
2.染色阳性强度和阳性检出率相结合：
阳性细胞数＜25%
－
25%-50%
+
50%-75%
++
＞75%
+++
四、其他常见问题
（三）假阳性、假阴性及背景着色的原因 1、假阳性的原因 ➢抗体与非特异性抗原结合 ➢抗体浓度过高 ➢非特异性吸附 ➢内源性酶的催化作用 ➢人为判断失误 ➢外源性或内源性色素的干扰
（六）孵育方法及时间
环境：特制的湿盒内，避免切片干燥致染 色失败
温度及时间：37℃，1h
延长孵育时间：4℃过夜
（七）显色
两种方法：
（1）3,3’-二氨基联苯胺（DAB） 配制方法及注意事项：
现用现配，配好后30min内使用，作用时间 5min以内；配好后需过滤
DAB TBS（0.05mol/L，pH7.6 ） 30%H2O2（显色前加入）
－
－
抗体稀释度的测定
（2）棋盘法：当一抗、二抗、三抗都未知 稀释度时
二抗稀释度 1:50
一抗稀释度
1:100
1:200
1:100 ++++(++) ++++(+) +++(－)
免疫组化染色过程降低染色背景的步骤
免疫组化染色过程降低染色背景的步骤免疫组化染色是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
在进行免疫组化染色时，染色背景的降低是非常重要的，可以提高染色的准确性和可视化效果。
以下是一些常用的步骤来降低免疫组化染色的背景：1. 组织固定：首先，将待染色的组织固定在载玻片上，常用的固定方法包括冷冻固定和乙醛固定。
固定可以防止组织中的蛋白质在染色过程中的流失和降解。
2. 抗体选择：选择合适的一抗和二抗是降低染色背景的关键。
一抗应该具有高度的特异性，可以选择经过验证的商业抗体或自制的抗体。
二抗应该来自于与待检测物种不同的物种，以避免非特异性结合。
3. 阻断非特异性结合位点：在染色前，使用一些阻断剂来阻断非特异性结合位点，例如牛血清白蛋白（BSA）、鱼胶原蛋白（Gelatin）、小鼠血清等。
阻断剂可以减少非特异性的背景染色。
4. 抗体稀释：对于一抗和二抗，应该根据实验需要进行适当的稀释。
稀释过高可能导致非特异性结合和背景染色的增加，稀释过低可能导致信号弱。
5. 温和的洗涤：在染色过程中，使用温和的洗涤缓冲液来洗涤载玻片，以去除非特异性结合的抗体和其他杂质。
洗涤缓冲液通常包含洗涤剂（如Tween-20）和盐类。
6. 使用负对照：在染色过程中，使用负对照来检测非特异性结合和背景染色。
负对照可以是未加一抗的组织切片或细胞，通过对比负对照和实验样品的染色结果，可以判断染色的特异性。
7. 图像分析：在染色完成后，使用合适的显微镜进行图像采集，并进行图像分析。
可以使用图像处理软件来减少背景噪音和增强信号。
总之，通过合适的固定、抗体选择、阻断非特异性结合位点、稀释、温和的洗涤、负对照和图像分析等步骤，可以有效地降低免疫组化染色的背景，提高染色结果的准确性和可视化效果。
免疫组化步骤和注意事项
免疫组化步骤和注意事项免疫组化是一种重要的实验技术，用于鉴定细胞、组织或生物样本中特定抗原的分布和表达情况。
它可以通过对特定抗原与抗体的特异性结合来检测目标分子的存在和定位。
下面将介绍免疫组化的步骤和注意事项。
免疫组化的主要步骤包括抗原脱蜡、抗体反应、显色和染色。
1. 抗原脱蜡：免疫组化的第一步是将组织样本或细胞脱脂、脱蜡和重水化，以去除蜡质，并使抗体更容易与目标抗原反应。
2. 抗体反应：将脱蜡的组织样本或细胞块通过抗原修复处理，以恢复抗原的免疫反应性。
然后，将免疫抗体与待检测的抗原反应，形成免疫复合物。
免疫抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以与组织或细胞中的特定抗原高度特异性地结合。
3. 显色：免疫复合物形成后，可以使用标记有酶（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）或荧光标记的二抗来检测免疫复合物。
在酶法中，可添加草酰胺基苯酸（DAB）或硫代硝基羟基苯并啶（NBT/BCIP）等底物以产生可见的色素沉积。
在荧光法中，免疫复合物被激光器或荧光灯激发后，会发出特定颜色的荧光信号。
4. 染色：完成显色后，可以通过核染色（如用伊红、伊红和伊蓝）来观察细胞核的形态特征，以配合免疫标记物的定位。
虽然免疫组化是一种有价值的技术，但在实施过程中也需要注意一些问题：1. 选择合适的抗体：在进行免疫组化实验时，选择特异性高、效价好的一抗抗体非常重要。
一抗抗体的选择应基于抗原的特异性和病变的病理生理特性。
2. 优化抗体浓度：免疫组化实验中，抗体浓度的选择是关键因素。
过高的抗体浓度会导致非特异性的染色，而过低的浓度则无法检测到目标抗原。
3. 优化抗原修复处理：抗原修复处理对于免疫组化的成功非常重要。
选择合适的抗原修复方法可以增强组织或细胞中的抗原的免疫反应性。
4. 阴性对照和阳性对照：为了验证实验的可靠性，每次免疫组化实验都应包括阴性对照和阳性对照。
阴性对照不包含待检测的抗原，而阳性对照则确保抗体和显色试剂的正常工作。
5. 切片质量：免疫组化实验的结果直接受到切片质量的影响。
免疫组化常见问题及其解决办法
免疫组化常见问题及其解决办法1、一抗从4度拿出后，为什么要进行37度复温？（1）一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；（2）另一方面，使抗原抗体结合更稳定。
一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4度和37度时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。
（3）其实，我更赞同后一种说法，由于我尝试把肝脏或睾丸片子从4度过夜拿出后，直接用PBS洗没发生过脱片现象。
2、切片染色后背景太深，如何区分特异性与非特异性着色？全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。
消失这种现象的缘由有：（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的缘由之一。
解决方法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己试验室的抱负工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简洁的按说明书进行染色。
（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决方法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，准时提示，避开因遗忘而造成时间延长。
现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要依据染色结果进行调整。
（3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。
配制好的DAB不应存放时间太长，由于在没有酶的状况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种好像节省的方法是不行取的。
DAB的显色最好在显微镜下监控，达到抱负的染色程度时马上终止反应。
不过当染色片太多时或用染色机时，这样做好像不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避开显色时间过长。
（4）组织变干：修复液溢出后未准时补充液体、染色切片太多、动作太慢、遗忘滴液、滴液流失等都是造成组织变干的缘由。
解决的方法是操作要仔细认真，采纳DAKO笔或PAP Pen在组织四周画圈，可以有效的避开液体流失，也能提高操作速度。
免疫组化实验注意事项
免疫组化实验注意事项
免疫组化实验注意事项如下：
1. 样本处理：确保样本的新鲜度，避免长时间的暴露在空气中，以防样本的退化。
同时，样本的切割要尽可能的薄，以便于抗体的渗透。
2. 抗体选择：选择特异性强、质量好的抗体，以保证实验结果的准确性。
同时，要注意抗体的稀释比例，过高或过低的稀释比例都可能影响实验结果。
3. 染色过程：染色过程中要保持湿润，避免干燥。
同时，要避免过度染色，以免背景过深，影响结果的观察。
4. 洗涤过程：洗涤过程要充分，以去除未结合的抗体，减少非特异性染色。
5. 对照设置：实验中应设置阳性对照和阴性对照，以验证抗体的特异性和实验操作的正确性。
6. 结果解读：结果的解读要结合实验设计、样本特点和染色结果，不能仅凭单一指标进行判断。
7. 实验记录：详细记录实验过程和结果，以便于后期的数据分析和问题追溯。
8. 实验室安全：遵守实验室安全规定，正确使用和处理化学试剂，避免可能的安全风险。
免疫组化没染上的原因
免疫组化没染上的原因一、基本概述免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种利用抗原 - 抗体特异性结合原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量研究的技术。
没染上可能是由于多方面原因造成的。
二、原因类型介绍1. 样本相关原因样本固定问题固定剂的选择和使用不当。
例如，使用福尔马林固定时，如果浓度不合适或者固定时间过长或过短，可能会破坏抗原结构，导致后续抗体不能与之结合，从而染不上色。
样本处理过程中的损伤在组织切片制备过程中，如切片过厚或过薄都会影响染色效果。
过厚的切片可能会使抗体难以穿透到组织内部与抗原结合；过薄的切片则可能会丢失部分抗原。
2. 抗体相关原因抗体特异性和质量问题选择的抗体特异性不强，可能会与非目标抗原发生交叉反应，或者根本不能识别目标抗原。
此外，抗体的质量不佳，如保存不当导致抗体失活，也会使染色失败。
抗体浓度不合适抗体浓度过高时，可能会产生非特异性结合，导致背景染色过深而目标抗原染色不清晰；抗体浓度过低则可能无法与抗原充分结合，导致染不上色。
3. 检测系统相关原因显色底物问题显色底物的选择、保存和使用条件不当。
例如，底物过期或者与检测系统不匹配，可能无法产生有效的显色反应。
检测方法和设备问题检测方法的灵敏度不够，如采用的放大系统不合适。
同时，检测设备如显微镜的性能不佳，不能准确观察到染色结果，也可能被误认为是没染上。
三、原因构建方法1. 样本方面通过对固定剂种类、浓度和固定时间的逐一排查来确定固定是否存在问题。
例如，设置不同浓度的福尔马林固定组和不同固定时间组，然后进行免疫组化染色，观察染色结果。
在样本处理过程中，使用不同厚度的切片进行染色实验，对比染色效果，从而确定切片厚度是否合适。
2. 抗体方面进行抗体特异性验证实验，如采用多种抗体针对同一抗原或者采用已知阳性和阴性对照样本进行测试。
对抗体进行梯度稀释，设置不同浓度的抗体染色组，观察染色效果，以确定合适的抗体浓度。
免疫组化(IHC)常见问题解析
免疫组化（IHC）常见问题解析2162 人阅读发布时间：2020-10-22 15:54免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究。
然而理想是丰满的，实际操作起来却是骨感的，作为一种分析方法，常常会存在非特异着色的背景问题。
下图中靶点均为胞膜定位，左边背景着色严重，右边染色效果优良。
01 抗体质量问题抗体本身在靶点设计上如果特异性不够，会导致非特异着色。
一般来说，单抗在特异性上相比多抗是具有优势的，但多抗由于识别任一抗原上的多个表位，多抗可放大低表达水平靶蛋白的信号，对微小抗原变化（例如多态性、糖基化异质性或者轻微变性）的包容性更强，可用于非免疫原物种的靶蛋白的检测实验。
具体实验时，还应根据实际需要选择合适的抗体。
另外，抗体保存也应注意防腐及防止反复冻融。
02 内源性酶和生物素当选用肝、肾，脾组织作为样本时，由于这些组织本身含有较高含量的过氧化酶和生物素，对于使用Hrp或生物素-亲和素显色系统的实验都会造成非特异性染色。
对于内源性过氧化物酶，可以用0.9% 的双yang水来灭活。
对于内源性生物素，染色前将切片浸于25 μg/mL 亲和素溶液中15 分钟，PBS 清洗15 分钟后即可染色。
也可以24 mg/mL 的卵白素封片15 分钟。
03 抗体浓度过高获得良好的染色结果，一般应优化一抗的使用浓度，可参考供应商提供的说明书，但预实验也是必不可少的，摸索出最理想的工作浓度。
04 DAB 染色时间太长/变质DAB 的作用时间过长，同样会造成背景。
DAB 的显色时间不是一成不变的，实验时应及时镜检，出现浅棕色时，马上冲洗。
出现棕色的时间过短，表明抗体浓度过高；出现棕色的时间过长，表明抗体有效浓度过低。
DAB 要保存于避光干燥的地方，现用现配，临用前才加入H2O2。
免疫组化染色过程降低染色背景的步骤
免疫组化染色过程降低染色背景的步骤1.引言免疫组化染色是一种常用的实验方法，用于检测组织标本中目标蛋白的表达情况。
然而，在进行免疫组化染色时，常常会遇到染色背景过高的问题，这会影响结果的准确性和可靠性。
因此，降低染色背景是很重要的。
本文将介绍一些操作步骤，帮助您降低免疫组化染色的背景。
2.材料和方法2.1样本制备首先，收集您所需的组织标本，并进行固定和包埋等常规处理，以保持标本的完整性和结构。
确保样本处理过程中的所有试剂和材料都是高质量的，以减少可能的背景干扰。
2.2抗体选择选择高特异性和高亲和力的一抗和二抗，以确保染色结果的准确性和强度。
在选择抗体时，可以参考之前的文献报道或与专家进行咨询。
此外，购买商业化的优质抗体也是一个不错的选择。
2.3样本预处理在进行免疫组化染色前，可以对样本进行预处理，以减少非特异性背景信号。
预处理的方法包括热处理、酶解等。
具体的预处理方法应根据样本的特性和需要进行优化。
2.4去除内源过氧化物酶活性内源过氧化物酶（en d og en ou sp er ox ida s e）是造成染色背景的一个常见原因。
为了减少内源过氧化物酶的活性，可以使用过氧化氢和二甲基亚砜（D MS O）的混合液对样本进行预处理。
该预处理步骤通常在抗原修复之后进行。
2.5阻断非特异性结合位点在进行染色前，应对样本进行阻断处理，以减少非特异性结合位点的背景信号。
常用的阻断方法包括使用蛋白质阻断剂（如牛血清蛋白）、小鼠免疫球蛋白等。
根据具体实验需求，选择适当的阻断剂，并在充分搅拌的条件下进行阻断。
2.6优化孵育时间和温度在进行一抗和二抗的孵育过程中，合理地优化孵育时间和温度可以减少染色背景并提高检测信号。
孵育时间一般在1至2小时之间，而温度则可以根据抗体的推荐条件进行设置。
2.7染色反应时间控制染色反应的时间控制也是降低染色背景的重要步骤之一。
根据染色试剂的说明书，控制染色反应的时间，避免染色剂过多或反应时间过长导致背景增加。
免疫组化背景不统一的原因
免疫组化背景不统一的原因1.引言1.1 概述免疫组化作为一种常用的实验技术，广泛应用于生物医学研究中。
然而，我们也经常会遇到免疫组化背景不统一的问题，即不同实验结果之间的差异。
这种差异可能会导致研究结果的可靠性和可重复性受到影响，从而对进一步的免疫组化研究造成困扰。
背景不统一的现象主要表现为样本中存在非特异性染色或假阳性结果。
而这些不一致的原因可能是多方面的，包括实验操作的不确定性、试剂和抗体质量的差异、实验设备的质量和使用状态等。
首先，不准确或不稳定的实验操作可能导致背景不统一现象。
在制备组织切片和固定样本的过程中，如果操作不当或条件不一致，可能导致细胞膜破裂、细胞核染色异常或蛋白质损失，这些都有可能引起背景的变异。
其次，试剂和抗体的质量也是影响背景统一性的重要因素。
不同厂家生产的试剂和抗体可能存在批次差异，甚至同一批次也会存在一定的变异。
此外，抗体的非特异结合或与其他蛋白质发生交叉反应也是导致背景不统一的原因之一。
此外，实验设备的质量和使用状态也会对背景产生影响。
比如显微镜的调节不准确、光源的亮度不适宜以及显微镜干净度的问题，都可能对背景的统一性产生重要影响。
综上所述，免疫组化背景不统一是一个复杂的问题，可能受到多个因素的共同影响。
为了解决这一问题，我们需要加强实验操作的标准化、选择优质的试剂和抗体，并确保实验设备的正常使用和维护。
只有这样，我们才能提高免疫组化结果的准确性和可重复性，为免疫组化研究的进一步发展提供更可靠的基础。
1.2文章结构文章结构部分的内容可以描述本文的整体结构和各个部分的主题内容，为读者提供一个清晰的导读。
具体内容如下：文章结构：本文将分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分包括概述、文章结构和目的。
正文部分将探讨背景不统一的影响因素，其中包括影响因素1和影响因素2。
结论部分将总结影响背景不统一的原因，并提供对免疫组化研究的启示。
引言部分的概述将对背景不统一问题进行简要介绍，引出文章的主题。
免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及对策 2
免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及对策 23）、DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。
配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。
DAB 的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。
不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。
（4）、组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。
解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAPPen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。
（5）、切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。
有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4ºC冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。
（6）、一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。
用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。
2、切片边缘着色切片边缘着色也是一种常见的现象，这种现象称为边缘效应。
产生的原因：（1）、组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致。
解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。
（2）、切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。
解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2 mm。
DAB染色中的两个问题及对策
doi：10．3969/j．issn．1007-8096．2011．05．033·邁新·技术交流·DAB染色中的两个问题及对策涂倩（第四军医大学第二附属医院（唐都医院）病理科，西安710038）［关键词］免疫组化；DAB；抗体浓度［中图分类号］R446.8［文献标识码］B［文章编号］1007－8096（2011）05－0400－01免疫组化技术在组织学研究和病理诊断尤其是肿瘤鉴别诊断中起着重要作用，在蛋白抗原的细胞准确定位上是其他蛋白检测方法无法相比的。
然而，要做好一张漂亮的染色切片，也不是十分容易的事。
下面我将工作中发现的问题以及解决方法列出，以供参考。
1DAB染色后切片呈阴性结果1.1原因①抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。
另外，不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前带和后带效应，必须摸索最佳浓度。
②抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须进行充分的抗原修复才能打开抗原表位，与抗体结合；建议高压修复6min，柠檬酸。
③组织切片本身抗原含量低。
④血清封闭时间过长。
⑤DAB 孵育时间过短。
⑥细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。
⑦开始做免疫组化，一定要首先做阳性对照片，以排除抗体外的问题。
1.2对策1．2．1排除组织切片内的抗原丢失及其含量多少免疫组化中两个最重要的因素是抗原和抗体。
①抗原有无丢失主要看组织切片的新鲜程度，一般切片室温保存超过3 6个月，可能切片内的抗原丢失很严重，此时可以通过重新用石蜡块切片来进一步验证（蜡块需要低温保存）。
②石蜡切片在制作过程中可能因醛基对抗原决定族的封闭，这需要通过抗原修复来充分暴露，从而增加抗原抗体结合反应，提高阳性率，一般采用酶消化法和加热抗原修复法，其中加热方法中的高压法效果优于水浴法，水浴法优于微波法。
1.2.2检查抗体有无选择错误和抗体孵育条件合适①一抗选择单克隆抗体易出现阴性结果，因为灵敏度低但特异性好。
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良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。
由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。
需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。
虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和“杂音”染色片（有阳性信号）。
一、无色片染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。
这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。
2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。
假阴性结果又可分为两种情况：（1）、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。
出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。
获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。
由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不可缺少的作用。
（2）、染色过程中的某一或某些环节出了问题。
比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。
也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。
为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。
如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。
如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。
如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗DAB或DAB的配制过程。
这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。
解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。
如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。
如果此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。
反之，如果阳性对照没有着色，表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。
应一一寻找原因。
阳性对照包括两种，一种称为“自身对照”或“内部对照”，这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原，CD20或CD3都应该有表达。
自身对照是一种比较理想的对照，对照和测试组织或细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。
在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。
另一种称为“外部对照”，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1来检测，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。
因此，应另外设立一个已知的阳性对照。
这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。
在实际工作中需要设立外部对照的情况很多，如果每一种抗体都要选不同的阳性对照，工作量会很大。
为了解决这个问题，目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起，制成多组织切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等，其连续切片储备待用，需要时取出一张便可作为阳性对照。
另外，比较简单的方法，是采用阑尾作为阳性对照，因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多，如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。
一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。
设立阳性对照是病理医生的任务或责任，而不是技术员的责任。
病理医生观察了HE切片，了解切片中是否有自身对照，如果没有，就应告诉技术员采用阳性对照。
因此，病理医生在免疫组化中的作用是不可忽视的。
抗体未覆盖上测试组织：当多块散开的小组织染色时，可能漏掉某块组织染色。
二、“杂音”染色片免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色称为“杂音”染色。
“杂音”染色种类繁多，产生的原因也多种多样，为了便于说明，笔者将其归纳为下面几种1、全片着色全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。
出现这种现象的原因有：（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。
解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。
（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。
现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。
（3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。
配制好的DAB 不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。
DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。
不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。
（4）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。
解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。
（5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。
有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4ºC冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。
（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。
用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。
2、切片边缘着色切片边缘着色也是一种常见的现象，这种现象称为边缘效应。
产生的原因：（1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致。
解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。
（2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。
解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。
用DAKO笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。
3、“阴阳脸”着色指组织一半着色一半无着色，形成交界清晰或不甚清晰的两种染色结果。
其成因是试剂仅覆盖了部分组织而不是全部。
如加试剂后未让试剂流散开而集中在部分组织上。
通常应该在加完试剂后，仔细看一遍，是否有的组织未被试剂完全覆盖，如有这种情况，建议用牙签而不是用吸头或试剂瓶口将试剂引流开使之将组织全部覆盖。
另外，染片盒不平，切片倾斜，虽然开始试剂已全部覆盖了组织，但后来试剂流向一边，部分组织未被试剂覆盖。
对于这种问题，只要留心或想到了很容易发现，也很容易解决。
有时，用DAKO （或PAP）笔在组织周围画圈时，划线太靠近或画到了组织上，由于笔油的力学原理，试剂不能达到靠近划线附近的组织。
还有气泡也可引起阴阳分明的着色，只是不着色区域是圆形，由于气泡中含气，试剂被推到周围，因此，气泡中心的组织不着色。
解决办法是滴加试剂时手法要轻，有气泡时用牙签捅破。
4、灶片状着色切片中着色区东一块西一块，呈灶片状分布，出现这种问题的原因有：（1）裱片时水未排尽，在局部形成气泡使组织突起，染色时试剂渗入后不易洗尽，显色过深所致。
解决办法是，漂片盒里的气泡应去尽，晾片热台不能平放，应有45度左右的斜度，利于水流走和蒸发。
（2）坏死组织灶，组织坏死后细胞破坏、酶的释放、蛋白游离、分解，复杂的肽链残段（如Fc段）可能与一抗或/和二抗结合导致最终着色。
解决办法是在选择染色切片时应避免选择坏死组织较多的切片。
（3）制作APES胶片时，胶的浓度太高，干燥后在玻片上留下白色小点，显色时白色小点着色。
解决办法是按照标准的制备方法进行，即5%盐酸酒精（5ml盐酸+95%酒精95ml）浸泡玻片4小时、热水冲洗玻片1小时、蒸馏水洗玻片1分钟、丙酮浸泡玻片5秒钟后空气干燥（室温）、2%APES（2ml APES+98ml丙酮）浸泡玻片5分钟、玻片过一下丙酮（1-2秒钟）、玻片过一下蒸馏水（1-2秒钟）、37°C过夜干燥、室温储存备用。
如果制片过程中，因丙酮逐渐挥发而胶变浓时可适当加入一些丙酮。
5、间质着色着色部位主要在间质，间质着色的原因很多，如抗体与组织中的蛋白质因蛋白疏水基团相互作用形成非特异性的连接而着色，加一抗前的血清封闭这一步就是为了避免非特异型的结合。
又如血清中的免疫球蛋白常常渗出到组织间质，很容易与抗体结合，造成间质着色，特别是lambda和kappa染色时。
当甲状腺胶质外溢到组织间质时，做甲状腺球蛋白染色也会出现间质着色。
抗体不纯或抗体被污染也可出现间质着色，我们曾遇到CD20抗体不纯，除了染上B细胞外还染上了间质。
6、细胞浆着色胞浆着色是所有“杂音”染色中最具有欺骗性的着色，着色区局限在细胞内，间质无着色，看上去与真实的免疫反应着色几乎一样，很难区别。
胞浆里含有较多的蛋白质，因此，很多非特异性的染色除了见于间质也可以出现在胞浆中。
这种原因造成的着色，可以通过血清封闭解决。
还有因内源酶造成的着色，如血红蛋白（红细胞）、肌红蛋白（肌细胞）、细胞色素（粒细胞、单核细胞）、过氧化氢酶（肝、肾），这些可用过氧化氢进行封闭。
巨噬细胞吞噬各种抗原物质或Fc片断而出现胞浆着色，这种着色不易避免，但可以通过形态学辨认出巨噬细胞而引起重视。
内源性生物素的着色最具有欺骗性，因为它广泛的存在于组织细胞中，我们研究结果显示：冰冻组织中存在内源性生物素，经福马林固定石蜡包埋后生物素被封闭，加热抗原修复后造成内源性生物素暴露，内源性生物素暴露的强度在不同的组织有所不同，从弱阳性（+）到强阳性（+++），内源性生物素在组织中的分布形式，既有散在分布也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中，内源性生物素广泛存在于上皮源性组织，特别是腺上皮组织，亦存在部分非上皮组织，内源性生物素不仅存在人体组织也存在大鼠组织，内源性生物素暴露的强弱与修复液有关，其强度增加依次为：柠檬酸、EDTA、EGTA，热抗原修复暴露的内源性生物素可被鸡蛋清封闭，非生物素检测系统Polymer两步法（EliVision、EnVision）可避免生物素干扰。