蛋白质定量检测修改版
蛋白质定量生化实验报告
一、实验背景蛋白质是生物体内的重要功能分子，具有多种生物学功能，如催化、结构、运输、信号传导等。
因此，蛋白质定量分析在生物科学研究中具有重要意义。
本实验旨在通过双缩脲法对蛋白质进行定量测定，并分析实验结果。
二、实验目的1. 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法；2. 学会操作双缩脲试剂，并观察蛋白质定量结果；3. 分析实验数据，探讨蛋白质定量结果的影响因素。
三、实验原理双缩脲法是一种经典的蛋白质定量方法，其原理是：蛋白质分子中的肽键在碱性条件下与铜离子（Cu2+）发生反应，生成紫红色的络合物。
该络合物在540nm处的吸光度与蛋白质含量呈线性关系，通过测定吸光度可以计算出蛋白质的浓度。
四、实验材料1. 实验试剂：- 双缩脲试剂A：0.1g/L硫酸铜溶液；- 双缩脲试剂B：0.01g/L酒石酸钾钠溶液；- 标准蛋白质溶液（如牛血清白蛋白）；- 未知蛋白质样品；- 蒸馏水；- 6mol/L氢氧化钠溶液；- 50mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）。
2. 实验仪器：- 分光光度计；- 移液器；- 试管；- 烧杯；- 玻璃棒。
五、实验步骤1. 准备标准曲线：- 取6个试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准蛋白质溶液； - 加入1.8mL蒸馏水，使总体积为2.0mL；- 加入0.2mL双缩脲试剂A；- 混匀，静置10分钟；- 加入0.4mL双缩脲试剂B；- 混匀，静置10分钟；- 以蒸馏水为空白，在540nm处测定吸光度；- 以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 测定未知蛋白质样品：- 取6个试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL未知蛋白质样品； - 加入1.8mL蒸馏水，使总体积为2.0mL；- 按照步骤1中的方法进行操作；- 以蒸馏水为空白，在540nm处测定吸光度；- 通过标准曲线计算未知蛋白质样品的浓度。
六、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：- 标准曲线呈线性关系，相关系数R2=0.998。
蛋白定量分析实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质定量分析的基本原理和方法。
2. 学习使用紫外分光光度计进行蛋白质定量。
3. 了解不同蛋白质定量方法的优缺点，为后续实验提供参考。
二、实验原理蛋白质定量分析是生物化学实验中常用的技术之一，主要方法有直接紫外吸收法、Bradford法和Lorry法等。
本实验主要采用直接紫外吸收法和Bradford法进行蛋白质定量。
1. 直接紫外吸收法：蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，在280nm波长附近有特征吸收峰。
蛋白质溶液的光密度（OD）与蛋白质浓度呈正比，因此可以通过测定OD值来计算蛋白质浓度。
2. Bradford法：蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250结合，在一定线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与蛋白质量成正比，从而实现蛋白质定量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：蛋白质样品、标准蛋白质溶液、考马斯亮蓝G-250染料、双蒸水等。
2. 仪器：紫外分光光度计、电子天平、移液器、试管等。
四、实验步骤1. 标准曲线绘制（1）取6支试管，分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml标准蛋白质溶液，用双蒸水补至1.0ml。
（2）分别加入5ml考马斯亮蓝G-250染料，混匀。
（3）在595nm波长下测定各管吸光度值。
（4）以标准蛋白质浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 蛋白质定量（1）取6支试管，分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml蛋白质样品，用双蒸水补至1.0ml。
（2）分别加入5ml考马斯亮蓝G-250染料，混匀。
（3）在595nm波长下测定各管吸光度值。
（4）根据标准曲线，计算蛋白质浓度。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制绘制标准曲线，得到线性方程：y = 0.004x + 0.021，相关系数R² = 0.997。
2. 蛋白质定量根据标准曲线，计算蛋白质样品浓度，结果如下：样品1：0.5mg/ml样品2：1.0mg/ml样品3：1.5mg/ml样品4：2.0mg/ml样品5：2.5mg/ml样品6：3.0mg/ml六、讨论与心得1. 实验过程中，应注意操作规范，避免蛋白质样品污染。
蛋白质的定量测定实验报告
蛋白质的定量测定实验报告实验目的：1.掌握蛋白质的定量测定方法；2.熟悉实验中所使用的试剂和仪器设备的操作；3.学习实验数据的处理与分析。
实验原理：本实验采用布拉德福法测定蛋白质的浓度。
该方法基于蛋白质与底物组成的复合物在碱性条件下，与染料结合从而使溶液颜色发生变化的原理，通过比色法确定蛋白质的浓度。
实验步骤：1.准备样品溶液：将待测蛋白质溶解在透明的蛋白质溶解缓冲液中，并振荡使其充分溶解。
2.制备标准曲线：将一系列蛋白质标准溶液分别取0.1mL放入不同的离心管中，加入相同体积的蛋白质溶解缓冲液，并与待测样品保持相同的操作时间和温度。
然后，加入一定体积的布拉德福试剂，振荡混匀，置于室温反应一定时间。
3.测定吸光度：利用分光光度计设置在布拉德福试剂的最大吸收波长下，测定待测样品及标准品溶液的吸光度。
4.绘制标准曲线：将各标准溶液的吸光度与其对应的蛋白质质量浓度制成曲线，确定直线方程。
5.计算待测样品中蛋白质浓度：根据待测样品的吸光度，利用标准曲线方程计算出蛋白质的浓度。
实验结果与分析：根据实验测得的数据，绘制标准曲线图，并通过线性回归得到直线方程。
利用该方程计算得到待测样品中蛋白质的浓度为X mg/mL。
实验讨论与改进：1.在实验过程中，确保各个试剂、仪器设备的操作准确无误。
2.实验中的温度和时间对于结果的准确性有一定的影响，可以进一步优化温度和反应时间的选择。
结论：本实验通过布拉德福法测定蛋白质的浓度，利用标准曲线确定了待测样品中蛋白质的浓度为X mg/mL。
该方法简单易行，测定结果可靠，适用于蛋白质浓度的定量测定。
蛋白质的定量测定实验报告
蛋白质的定量测定实验报告实验目的：本实验旨在学习如何通过定量分析方法来测定蛋白质的含量，并了解其原理与步骤，掌握实验技能。
实验原理：本实验采用了伯威尔法来测定蛋白质的含量，其原理是使用布莱德福试剂与蛋白质反应，得到紫色化合物，再通过光度计量测光密度，最后根据光密度与标准曲线得出蛋白质含量。
实验步骤：1. 制备标准蛋白质溶液：取不同浓度的酪蛋白标准品称取相应的质量，加入去离子水中定容制成相应浓度的标准蛋白质溶液。
2. 取待测样品加入少许的生理盐水加以均匀悬浮后，以PBS （Phosphate Buffer Saline）定容到一定的浓度。
3. 取10ml的试管，依次加入不同浓度的标准蛋白质溶液分别制成标准曲线，其中最高的浓度为2mg/ml。
4. 在本次实验中样品大部分成分已知，加入生理盐水的原因是为了将待测浓度控制在标准曲线范围内，以保证准确度，同样的超出标准曲线的部分需要稀释。
5. 向标准曲线上各试管加入1ml的布莱德福试剂，摇晃后静置5分钟。
6. 在550nm波长下使用光度计测光密度。
7. 记录测得的各标准点吸光值，并作图得到标准曲线。
8. 根据待测样品的吸光值和标准曲线，计算出样品中的蛋白质浓度。
实验结果：根据标准曲线，以及不同待测样品的吸光值，我们成功计算并得出各样品中蛋白质的浓度如下：样品编号蛋白质浓度(mg/ml)1 0.82 1.23 0.54 0.65 0.9实验结论：通过以上实验步骤，我们成功运用伯威尔法测定出了待测样品中蛋白质的含量。
实验结果表明，实验仪器操作规范，数据准确可靠。
蛋白质是生命体中重要的物质，其定量测定对于生物化学研究至关重要。
此次实验，我们不仅掌握了具体测定方法，而且也深化了我们对蛋白质含量分析的理解和认识。
实验二蛋白质的定量实验
关于比色皿
易碎品，轻拿轻放！ 易碎品，轻拿轻放！ 若有破损需及时告知； 若有破损需及时告知； 不影响使用不追究责任； 不影响使用不追究责任； 如影响使用需照价赔偿。 如影响使用需照价赔偿。
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实验操作
试剂/mL 试剂 标准蛋白质溶液 待测蛋白质溶液 蒸馏水 试剂A 试剂 0 0.5 2.5 1 0.05 0.45 2.5 2 0.1 0.4 2.5 3 0.2 0.3 2.5 4 0.3 0.2 2.5 5 0.4 0.1 2.5 6 0.5 2.5 7，8，9 ， ， 0.5 2.5
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移液枪使用注意事项
请勿将调节旋钮拧过移液器的最大量程和最小量程量取液体； 请勿将调节旋钮拧过移液器的最大量程和最小量程量取液体； 避免让液体进入活塞腔体，任何时候不要将移液枪倒置； 避免让液体进入活塞腔体，任何时候不要将移液枪倒置； 吸液和排液时尽量缓慢以确保液体被充分吸取和排空， 吸液和排液时尽量缓慢以确保液体被充分吸取和排空，以减少 液体残留枪头而造成误差； 液体残留枪头而造成误差； 避免调节旋钮长时间处于过度挤压或拉伸的状态， 避免调节旋钮长时间处于过度挤压或拉伸的状态，从而影响其 精确度； 精确度； 使用后将调节旋钮调至最大量程处， 使用后将调节旋钮调至最大量程处，以确保活塞弹簧处于最佳 状态 ；
实验二
蛋白质的定量实验
生物化学与分子生物学教研室
实验目的
能够说出Lowry法蛋白质定量的方法及基本原理 法 能够说出 能够正确使用分光光度计进行蛋白质吸光度的测定 能够正确使用分光光度计进行蛋白质吸光度的测定 正确使用分光光度计 能够正确绘制标准曲线并根据其计算未知蛋白浓度 能够正确绘制标准曲线并根据其计算未知蛋白浓度 正确绘制标准曲线并根据其
蛋白质的定量测定实验报告
加Folin-酚试剂、水浴10min附表操作技巧：①在这一次的实验中，关键的要点在丁滴加Folin-酚试剂的摇匀，必须快速摇匀，保证反应优先进行。
振荡试管时，振荡的正确方法是用手腕的力左右摆动，使试管中液体混合均匀且不漏出。
最后放入到水浴中加热。
②在分光比色的时候，测量一次后重新凋零，不能继续测量等。
操作失误：全部实验过程中，就出现了一次失误，即在试管4加入Folin-酚试剂，充分摇匀，在放入水浴加热之间，部分液体由丁磕碰而溅出。
其余操作严格按照要求一步步完成，理论不存在着失误。
4：Folin-酚与液体已经混合均匀并反应，在后面的水浴加热后，只是影响到了整体的试管4的反应后得到的溶液量，而不影响颜色的变化及最后的比色测定，故该失误不会对实验产生测定的偏差。
2.2实验现象①在滴加硫酸铜溶液后，摇匀，产生较多的黏性气泡且附着在液体表面。
液体颜色变化不深。
②在滴加Folin-酚试剂水浴加热后，除试管1为淡黄色外，其余试管均成不同的蓝色。
具体看下图：分析：标准液的试管中（2-5）蓝色不断加深，同实际的标准液的含量多少正相关，而试管6的颜色不深，在1-2试管之间，根据实验原理初步可以判定的是：该样品液的蛋白质含量将不会在60-80g/L之间，而是在0-40g/L。
即实验存在一定的问题，详见结果的分析与讨论。
2.3实验原始数据本次实验原始数据是在500nm的波长下，各试管混合液的吸光度值，结果见下表1表1 500nm波长吸光度值记录各管吸光度值A500测定次数2 3 4 5 6三、结果与讨论3.1数据处理3.1.1利用原始数据，可得到各管的平均值：2 管：A 500= (0.353+0.350+0.351 ) /3=0.3513 ;3 管：A 500= (0.561+0.562+0.562 ) /3=0.5617 ;依次得到4-6管的吸光度值如下所示：3.1.2 Excel绘制蛋白质的标准曲线根据用Excel绘制标准曲线PPt所示步骤，最终得到如下结果:图2标准曲线图从图中我们可以看到线性方程：y 0.0062 ?x , R2 0.9659将样品溶液的吸光度（即y值）代入方程，可得出样品浓度（即x值）；由相关指数值R2可看出误差大小。
实验一 蛋白质的定量测定
实验一蛋白质的定量测定——Folin—酚法一、目的要求（1）学习Folin—酚法测定蛋白质含量的原理和方法；（2）制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质含量。
二、实验原理目前蛋白质含量测定有两类方法，一类是利用蛋白质的物理化学性质，如折射率，比重，紫外吸收等测定得知；另一类是利用化学方法测定蛋白质含量，如微量克氏定氮，双缩脲反应，Folin—酚试剂法（Lowry法）。
这两类方法各有优缺点，选用何种方法测定蛋白质含量，可根据实验要求和实验条件进行选择。
目前实验室多用Folin—酚法测定蛋白质含量。
此法的优点是：操作简单，迅速，不需特殊仪器设备，灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍，反应约在15min内有最大显色，并至少可以稳定几个小时。
其不足之处就是此反应受多种因素干扰。
在测定时应排除干扰因素或做空白试验消除。
此法是在Folin—酚法的基础上引入双缩脲试剂，因此凡干扰双缩脲反应的基团，如-CO-NH2,-CH2-NH2,-CS-NH2以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如Tris缓冲剂以及蔗糖，硫酸铵，巯基化合物均可干扰Folin—酚反应。
此外，所测的蛋白质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。
而浓度较低的尿素（约0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸钠（1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。
若所测的样品中含硫酸铵，则需增加碳酸钠—氢氧化钠浓度即可显色测定。
若样品酸度较高，也需提高碳酸钠—氢氧化钠浓度1—2倍，这样即可纠正显色后色浅的弊病。
Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。
甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。
蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。
乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸，硫酸，溴等组成。
此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。
蛋白定量分析实验报告
蛋白定量分析实验报告简介蛋白质是生物体中最重要的分子之一，它们扮演着许多生物功能的关键角色。
蛋白质定量分析是研究蛋白质含量和表达水平的重要手段。
本实验报告旨在介绍一种常用的蛋白定量分析方法。
实验目的本实验旨在使用Bradford法对给定的蛋白溶液进行定量分析，通过构建标准曲线计算未知蛋白样品中蛋白质的浓度。
实验步骤1. 制备标准曲线1.准备一系列已知浓度的蛋白溶液，浓度范围从0到1.0 mg/mL。
2.分别取0.2 mL标准蛋白溶液并加入1.8 mL Bradford试剂。
将混合液在室温下孵育5分钟。
3.使用分光光度计在595 nm波长下测量吸光度，并记录吸光度值。
2. 测定未知样品的蛋白质浓度1.取待测蛋白样品0.2 mL，并加入1.8 mL Bradford试剂。
将混合液在室温下孵育5分钟。
2.使用分光光度计在595 nm波长下测量吸光度，并记录吸光度值。
3.使用标准曲线计算未知样品的蛋白质浓度。
3. 数据处理1.绘制标准曲线，横轴表示已知蛋白质浓度，纵轴表示对应的吸光度值。
2.使用线性回归等方法拟合标准曲线，得到拟合方程。
3.根据未知样品的吸光度值和拟合方程，计算未知样品的蛋白质浓度。
结果与讨论我们使用Bradford法对一系列已知浓度的蛋白溶液进行了吸光度测量，并绘制了标准曲线。
通过拟合标准曲线，我们得到了一个线性方程：浓度（mg/mL）= 0.73 × 吸光度 - 0.02。
然后，我们对一个未知蛋白样品进行了吸光度测量，并使用拟合方程计算出样品中蛋白质的浓度为0.62 mg/mL。
通过本实验，我们成功地确定了未知样品中蛋白质的浓度。
这种蛋白定量分析方法简单、快速且可靠，可广泛应用于生物化学和生命科学领域。
结论本实验使用Bradford法对蛋白样品进行定量分析。
通过制备标准曲线和测定未知样品的吸光度值，我们成功地确定了未知样品中蛋白质的浓度为0.62 mg/mL。
这种方法简单易行且结果可靠，是一种常用的蛋白定量分析方法。
gb5009.52010蛋白质的测定
中华人民共和国国家标准GB 5009.5—2010食品安全国家标准食品中蛋白质的测定National food safety standardDetermination of protein in foods中华人民共和国卫生部发布2010-03-26 发布2010-06-01 实施GB 5009.5—2010I前言本标准代替GB/T 5009.5-2003《食品中蛋白质的测定》、GB/T 14771-1993《食品中蛋白质的测定方法》和GB/T 5413.1-1997《婴幼儿配方食品和乳粉蛋白质的测定》。
本标准与GB/T 5009.5-2003相比主要修改如下：——在第一法中增加了自动蛋白质测定仪的方法；——增加了燃烧法，作为第三法；——修改了换算系数；——对计算结果的有效数字规定进行了修改；——增加pH计对滴定终点的判定。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：——GB/T 5009.5-1985、GB/T 5009.5-2003；——GB/T 14771-1993。
GB 5009.5—20101食品安全国家标准食品中蛋白质的测定1 范围本标准规定了食品中蛋白质的测定方法。
本标准第一法和第二法适用于各种食品中蛋白质的测定，第三法适用于蛋白质含量在10 g/100 g 以上的粮食、豆类、奶粉、米粉、蛋白质粉等固体试样的筛选测定。
本标准不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质的食品测定。
第一法凯氏定氮法2 规范性引用性文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。
3 原理食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。
4 试剂和材料除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682 规定的三级水。
最新原创蛋白质的定量测定实验报告
蛋白质的定量测定（BCA试剂盒法）实验报告一、实验目的：掌握BCA法测定蛋白质浓度的方法及原理。
二、实验原理：在碱性的环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。
BCA法与Cu1+结合形成稳定的蓝紫色复合物，在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。
三、实验材料：实验药品和试剂：BCA Reagent 100 ml （普利莱基因技术有限公司）Cu Reagent 2.5ml （普利莱基因技术有限公司）BSA standard 4mg/ml 1 ml 待测溶液。
仪器：96孔板酶标分析仪（DNM-9602 北京普朗新技术有限公司）移液枪试管EP管恒温水浴箱。
四、实验方法与步骤：（1）工作溶液配置：将5ml的BCA Reagent与100μl的Cu Reagent混合为WR工作试剂。
（2）标准蛋白溶液的配置：用上节课已配置好的0.1M的PBS缓冲液进行配比稀释：40μl 4000μg/ml BSA+60μl 0.1M的PBS=100μl（BSA=1600μg/ml）。
（3）倍比稀释：为减小误差，将标准蛋白和待测样本分为三个相同组，每个孔加25μl，浓度从上到下依次增加，H行为待测溶液。
从配置好的100μl标准蛋白溶液中取出75μl（浓度为1600μg/ml），再将75μl标准蛋白溶液取出一半到EP管中，将37.5μl的PBS缓冲液加入取出的蛋白溶液中（浓度为800μg/ml），在EP管上做好浓度标记，依次倍比稀释，得到BSA标准溶液1600，800，400，200，100，50，25μg/ml，各75μl。
省略1600μg/ml标准管直接从800μg/ml开始。
（4）标准测定：在每孔25μl标准品或待测样品中，各加入200μl WR 工作液轻摇混合。
表1 微板测定方案的加样量和比例（5）反应：将配好溶液的96孔板37℃恒温水浴箱放置30min。
（6）测定：30min后将96孔板放进酶标分析仪中进行结果的检测，以A1做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值。
蛋白质的定量测定实验报告
蛋白质的定量测定实验报告一、实验目的掌握几种常见的蛋白质定量测定方法，如凯氏定氮法、双缩脲法、Folin酚试剂法（Lowry 法）和考马斯亮蓝法，并比较它们的优缺点和适用范围。
通过实验操作，提高实验技能和数据处理能力，培养严谨的科学态度。
二、实验原理1、凯氏定氮法蛋白质是含氮的有机化合物。
食品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。
2、双缩脲法双缩脲（NH₂CONHCONH₂）在碱性溶液中能与 Cu²⁺作用形成紫红色的络合物。
蛋白质分子中含有多个肽键，其结构与双缩脲相似，也能与 Cu²⁺发生双缩脲反应。
在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可用比色法进行测定。
3、 Folin酚试剂法（Lowry 法）蛋白质中的肽键在碱性条件下与铜离子反应生成复合物，然后该复合物还原 Folin酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，产生蓝色化合物。
蓝色的深浅与蛋白质含量成正比，可用比色法进行测定。
4、考马斯亮蓝法考马斯亮蓝 G-250 在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色。
在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可用比色法进行测定。
三、实验材料与仪器1、实验材料标准蛋白质溶液（如牛血清白蛋白）、待测蛋白质溶液、各种试剂（如硫酸铜、氢氧化钠、硫酸、硼酸等）。
2、实验仪器凯氏定氮蒸馏装置、分光光度计、离心机、移液器、容量瓶、试管等。
四、实验步骤1、凯氏定氮法（1）消化：准确称取一定量的样品（如 05g）放入干燥的凯氏烧瓶中，加入硫酸铜、硫酸钾和浓硫酸，摇匀后在通风橱中加热消化，直至溶液呈透明的蓝绿色。
（2）蒸馏：消化液冷却后，加入适量水，转移至蒸馏装置中，加入氢氧化钠溶液进行蒸馏，使氨逸出。
（3）吸收与滴定：用硼酸溶液吸收蒸馏出的氨，然后用盐酸标准溶液滴定，直至溶液由蓝色变为微红色，记录盐酸的用量。
改良LORRY法测蛋白质含量
实 验基本操作
一、玻璃仪器的常规清洗（P2-3）
➢ 清洗剂刷洗 ➢ 自来水冲洗（至少5遍） ➢ 蒸馏水冲洗（2-3次） ➢ 干燥与放置
二、吸量管的使用（P3-4）
选、吸、平、减、吹
三、试剂瓶、吸量管、试管的放置
➢ 试剂瓶用后放回原处、标签面向同一方向 ➢ 吸量管箭头朝下放置，以免倒流 ➢ 空置干净试管倒扣放在试管架上
1档，空白对照，A=0，T=100% 1.5档，隔板，A=+∞，T=0% 2档，样品1，A=？ 3档，样品3，A=？ 4档，样品4，A=？
六、比色皿的使用
1、分清光面、毛面 手只可接触毛面，光线须从光面通过
2、用溶液润洗2-3次，装至2/3至4/5体积 3、粗纸吸水、柔纸擦亮光面 4、从低到高依次测量，不需清洗比色杯 5、蒸馏水冲洗3-5次，擦干，倒扣放置
不应出现混浊； 3、精确控制操作时间。
四、分光光度计的原理（P11）
Lambert-Beer 定律
I0
I
检测系统
光源 单色器 狭缝 样品池
T = I/I0， A = - lg T A= KcL
1、A1/A2= c1/c2 2、标准曲线法
五、分光光度计的使用
样品池
波长 读数
拉杆，1-4档
1. 打开电源，调节旋钮至需要的波长，预热20~30min 2. 1档（空白管），T模式调100%，显示“Blank”、“100” 3. 拉杆拉至1.5档，T模式调0%，显示“0.00” 4. 切换到A模式，拉至2、3、4档，读取各个样品的吸光度 5. 使用完毕后，置于休息档（1.5档）
Y3
Y2
样品吸光度
Y1 0
蛋白定量测定实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质定量测定方法的基本原理和操作步骤；2. 熟悉不同蛋白质定量方法的特点和适用范围；3. 学习利用双缩脲试剂法、凯氏定氮法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法进行蛋白质定量测定；4. 分析实验数据，得出实验结果。
二、实验原理1. 双缩脲试剂法：蛋白质分子中含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。
紫红色络合物的吸光度与蛋白质含量在一定范围内呈线性关系。
2. 凯氏定氮法：将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列分解、碳化和氧化还原反应，将有机氮转变为无机氮硫酸铵。
通过测定硫酸铵的含量，计算出蛋白质含量。
3. SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法：SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳是一种快速测定蛋白质分子量的方法。
通过建立蛋白质相对迁移率与其分子量对数值的标准曲线，可快速测定样品蛋白质分子量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：蛋白质样品、双缩脲试剂、硫酸铵标准溶液、凯氏定氮试剂、SDS-聚丙烯酰胺凝胶、电泳仪等。
2. 实验仪器：分析天平、移液器、恒温水浴锅、分光光度计、电泳槽、凝胶成像系统等。
四、实验步骤1. 双缩脲试剂法（1）取一定量的蛋白质样品，加入双缩脲试剂，混匀；（2）在540nm波长下测定吸光度；（3）根据标准曲线计算蛋白质含量。
2. 凯氏定氮法（1）取一定量的蛋白质样品，加入凯氏定氮试剂，进行消化；（2）将消化液转移至凯氏定氮仪中，测定硫酸铵含量；（3）根据硫酸铵含量计算出蛋白质含量。
3. SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法（1）配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶；（2）将蛋白质样品加样至凝胶中；（3）进行电泳，观察蛋白质条带；（4）根据标准曲线计算蛋白质分子量。
五、实验数据记录与处理1. 记录实验数据，包括蛋白质样品的吸光度、硫酸铵含量、蛋白质分子量等。
2. 利用Excel等软件进行数据处理，绘制标准曲线，计算蛋白质含量和分子量。
蛋白质的定量测定实验
蛋白质的定量测定实验（Lowry法、考马氏亮蓝G－250染色法、紫外分光光度法和双缩脲法）2010-04-04 09:45:31 来源：易生物浏览次数：1431 网友评论0 条一、Folin－酚试剂法（又名Lowry）法二、考马氏亮蓝G－250染色法三、紫外分光光度法四、双缩脲法关键词：马氏染色法亮蓝蛋白质定量测定Lowry法考马氏亮蓝G－250染色法紫外分光光度法双缩脲法）蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。
在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。
蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法代来了许多具体的困难。
目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：物理性质：紫外分光光度法化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法，BCA法，胶体金法染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法其他性质：荧光法蛋白质测定的方法很多，但每种方法都有其特点和局限性，因而需要在了解各种方法的基础上根据不同情况选用恰当的方法，以满足不同的要求。
例如凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，用于大批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量大，测量范围窄，因此在科研上的应用受到限制；而酚试剂法弥补了它的缺点，因而在科研中被广泛采用，但是它的干扰因素多；考马氏亮兰染色法因其灵敏而又简便开始重新受到关注；BCA法又以其试剂稳定，抗干扰能力较强，结果稳定，灵敏度高而受到欢迎；胶体金法具有较高的灵敏度，可达到毫微克水平，用于微量蛋白的测定。
常用的测定蛋白质含量方法的比较方法测定范围（μg/ml）不同种类蛋白的差异最大吸收波长(nm)特点凯氏定氮法小标准方法，准确，操作麻烦，费时，灵敏度低，适用于标准的测定紫外分光光度法100—1000大280205灵敏，快速，不消耗样品，核酸类物质有影响双缩脲法1000—10000 小540重复性、线性关系好，灵敏度低，测定范围窄，样品需要量大Folin-酚试剂法20—50大750 灵敏，费时较长，干扰物质多考马氏亮蓝G-250 50—50大595灵敏度高，稳定，误差较大，颜色会转移BCA50—500 大562灵敏度高，稳定，干扰因素少，费时较长由于凯氏定氮法的操作作过于复杂，双缩脲法的灵敏度又太低，下面介绍Folin—酚试剂法，考马氏亮蓝G—250染色法，紫外分光光度法、胶体金法等几种最常用使用的方法。
实验一蛋白质定量测定
1 聚丙烯酰胺凝胶(PAGE) 丙稀酰胺（单体）＋N,N-甲叉双丙稀酰胺（交联剂）→（催化 剂） →聚合 催化剂：过硫酸铵＋四甲基乙二胺（TEMED） 改变单体和交联剂浓度可改变凝胶孔径 2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS （十二烷基磺酸钠）
蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合， 形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。 SDS处理前必须用巯基乙醇完全打开蛋白质之间的二硫键， 使蛋白质分子被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上。
3. 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr29g，甲叉双丙烯酰胺 （Bis）1g，加蒸馏水至100ml，过滤后臵棕色瓶中 4. 10%SDS（十二烷基磺酸钠） 5. 10%过硫酸铵(AP) 6. TEMED（四甲基乙二胺） 7. 2x上样缓冲液：10%SDS（4ml）+巯基乙醇（1ml）+0.2%溴酚蓝（2ml）+甘油 2ml +1M pH6.8Tris-HCl（1ml） 8. 浓缩胶缓冲液（1M Tris-Cl缓冲液 pH6.8） 9. 分离胶缓冲液（1.5M Tris-Cl缓冲液 pH8.8） 10. 固定液：取乙醇500ml，冰乙酸100ml混匀，定溶至1000ml。 11. 染色液：称取考马斯亮蓝R250 1.25g，甲醇225ml，冰乙酸50ml，双蒸水 225ml. 12. 脱色液：冰乙酸80ml，乙醇250ml，加蒸馏水定容至1000ml。 13. 电泳缓冲液（SDS 20g，Tris 60g, 甘氨酸282.2g, pH8.3）加蒸馏水使其溶 解后定容至2000ml。
0 30 45 60 ug/ml 90 120
思考题
1.folin-酚测定蛋白质的原理是什么 2.有哪些因素可干扰folin-酚测定蛋白质含量？
蛋白质定量法实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质定量方法的基本原理和操作步骤。
2. 学会使用BCA法和Folin-酚试剂法进行蛋白质定量。
3. 了解蛋白质定量在生物研究中的应用。
二、实验原理蛋白质定量是生物研究中的一个重要环节，它可以帮助我们了解蛋白质在生物体内的含量、分布和功能。
常用的蛋白质定量方法有BCA法、Folin-酚试剂法、双缩脲法等。
本实验主要介绍BCA法和Folin-酚试剂法的原理和操作步骤。
1. BCA法BCA法（Bicinchoninic Acid法）是一种基于双缩脲反应的蛋白质定量方法。
在碱性条件下，蛋白质与Cu2+络合，将Cu2+还原成Cu+，然后BCA与Cu+螯合，产生蓝紫色，其吸光度与蛋白质浓度呈线性关系。
2. Folin-酚试剂法Folin-酚试剂法是一种基于酚试剂与蛋白质中的肽键发生反应的蛋白质定量方法。
蛋白质中的肽键与酚试剂反应生成蓝绿色化合物，其吸光度与蛋白质浓度呈线性关系。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）样品：待测蛋白质样品；（2）试剂：BCA试剂、Folin-酚试剂、双缩脲试剂、牛血清白蛋白标准品、蒸馏水等；（3）仪器：酶标仪、恒温水浴锅、移液器、试管等。
2. 实验仪器：（1）酶标仪：用于测定吸光度；（2）恒温水浴锅：用于加热反应；（3）移液器：用于准确移取试剂；（4）试管：用于混合试剂和样品。
四、实验步骤1. BCA法（1）配制BCA工作液：取BCA试剂A 50μl，加入BCA试剂B 1μl，充分混匀；（2）配制标准曲线：取6个试管，依次加入牛血清白蛋白标准液0、20、40、60、80、100μl，然后加入BCA工作液200μl，混匀；（3）加入样品：取6个试管，依次加入待测蛋白质样品0、20、40、60、80、100μl，然后加入BCA工作液200μl，混匀；（4）加热反应：将试管放入恒温水浴锅中，37℃反应30min；（5）测定吸光度：用酶标仪在562nm波长下测定各试管吸光度；（6）绘制标准曲线：以蛋白含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
蛋白定量法实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质定量法的基本原理和操作步骤。
2. 了解不同蛋白质定量方法的优缺点及适用范围。
3. 通过实验，验证蛋白质定量方法的有效性。
二、实验原理蛋白质定量方法主要包括比色法、电泳法和质谱法等。
本实验采用比色法中的BCA 法和双缩脲法进行蛋白质定量。
1. BCA法原理：在碱性条件下，蛋白质与Cu2+络合，将Cu2+还原成Cu+，Cu+与BCA形成紫色的络合物，其吸光度与蛋白质浓度呈线性关系。
2. 双缩脲法原理：蛋白质中的肽键与双缩脲试剂反应，形成紫色络合物，其吸光度与蛋白质浓度呈线性关系。
三、实验材料1. 蛋白质样品：牛血清白蛋白、大豆蛋白、小麦蛋白等。
2. 试剂：BCA试剂盒、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G-250、氯化钠、硫酸铜等。
3. 仪器：紫外-可见分光光度计、移液器、酶标板等。
四、实验步骤1. BCA法：（1）配制BCA工作液：按照BCA试剂盒说明书配制。
（2）配制标准蛋白溶液：将牛血清白蛋白稀释成不同浓度的标准溶液。
（3）取酶标板，按表格加入试剂。
（4）将酶标板置于振荡器上振荡30s，37℃孵育30min。
（5）在562nm波长下，测定吸光度。
（6）以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（7）测定样品蛋白质浓度。
2. 双缩脲法：（1）配制标准蛋白溶液：将牛血清白蛋白稀释成不同浓度的标准溶液。
（2）取酶标板，按表格加入试剂。
（3）将酶标板置于振荡器上振荡30s，室温孵育10min。
（4）在595nm波长下，测定吸光度。
（5）以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（6）测定样品蛋白质浓度。
五、实验结果与分析1. BCA法：根据标准曲线，计算样品蛋白质浓度为X mg/mL。
2. 双缩脲法：根据标准曲线，计算样品蛋白质浓度为Y mg/mL。
3. 结果分析：通过比较两种方法的测定结果，分析其准确性和精密度。
六、实验结论1. BCA法和双缩脲法均能有效地进行蛋白质定量。
蛋白质的定量测定
实验题目：蛋白质的定量测定⒈准确吸取一定量血清(人或动物)。
用凯氏定氮法，测出蛋白质实际含氮量，再换算成标准蛋白质含量（×6.25）。
⒉吸取以上血清若干毫升，用蒸馏水准确稀释50倍，再按下述方法进一步稀释为（1）-（4）四种不同浓度的标准血清样品液。
(1) 号液：取1:50 稀释液20.0ml，用容量瓶稀释至100ml。
(2) 号液：取(1) 液2.0ml与蒸馏水2.0ml混匀。
(3) 号液：_取（2）液2.0ml与蒸馏水2.0ml混匀(4) 号液：取（3）液2.0ml与蒸馏水2.0ml混匀。
⒊取未知血清样品0.1ml，直接置于50ml容量瓶中，然后用蒸馏水稀释至刻度，倒置混匀。
此为未知样品稀释液。
⒋取6支试管，编号，继续按下表操作。
编号 1 2 3 4 5 6标准样品液 1.0 1.0 1.0 1.0未知样品稀释液 1.0蒸馏水 1.0碱性铜试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0混匀后,室温下放置20分钟。
酚试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0混匀各管30分钟后, 以______6______为空白管, 在___650nm______下比色, 读取各管吸光度值。
5. 分别算出1-4管中所加入的稀释血清的实际浓度。
以蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，此即标准曲线。
6. 未知样品中蛋白质含量的计算。
方法有二：（1）根据测定管（第5管）的吸光度值，在标准曲线上查出未知样品稀释液中蛋白质含量，再根据其稀释倍数，算出未知血清样品的蛋白质含量。
（2）无标准曲线时，可以根据测定管和与测定管同样处理的标准管（例如以第2管为标准管）的吸光度值，按下式计算未知样品中的蛋白质含量：血清蛋白质含量（g/dl）=测定吸光度×标准管蛋白质含量×血清样品稀释倍数实验结果：1.标准曲线法分析讨论。
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考马斯亮蓝染色法
一、试剂：
1、染色液：考马斯亮蓝G－250 10mg，95％乙醇50ml，85％磷酸100ml，溶解于无离
子水，定容至100ml，装入棕色试剂瓶备用。
2、标准蛋白质溶液（0.1％浓度）：牛血清白蛋白100mg溶解于100mL0.15MNaCl水溶
液中。
（因为使用牛血清白蛋白就需要配制生理盐水，是否可以用酪蛋白代替直接用蒸馏水配制从而简化实验步骤）
3、样品溶液：未知浓度的蛋白质溶液（浓度落在标准曲线范围内）
4、0.15M NaCl水溶液（生理盐水）
二、仪器：
1.带帽塑料试管（8*10ml）
2.棕色试剂瓶（1000ml）
3.量筒（50、100、1000ml）
4.移液管（0.5mL和1.0mL、5mL）
5.移液枪*1
6.分光光度计
7.试管架
8.普通漏斗、滤纸
9.烧杯（10ml、100ml）
10.100ml容量瓶
11.玻璃棒*1
三、操作：
标准曲线绘制
取6支25ml刻度试管，按照下列表格配方加样，并测定OD595。
注：经查阅文献本实验可以采用1ml（蛋白+水）与5ml染色液作为测定体系
参考文献：刘国琴，等。
现代蛋白质实验技术。
中国农业大学出版社
样品溶液中牛血清白蛋白的浓度测定
量取1ml牛奶于100ml容量瓶中再用蒸馏水定容。
取样品溶液0.5ml，加生理盐水0.5mL，染色液5.0ml，与标准曲线反应相同的时间后，测定OD595。
计算：
C BSA=m*稀释倍数/V
m为样品OD595在标准曲线中所对应的BSA的含量
V为移取的样品溶液体积（mL）。