双向电泳技术在生物医学中的应用现状和应用前景

双向电泳技术在生物医学中的应用现状和应用前景

1 双向电泳技术

1.1双向电泳技术概述

双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。

双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。

1.2 双向电泳技术的原理

双向电泳技术是蛋白质组学研究的核心技术之一。它利用了各种蛋白质等电点和分子量的不同来分离复杂蛋白质组分，具有较高的分辨率和灵敏度，目前已成为复杂蛋白质组分检测和分析的最好的生化技术。IPG - DALT系统双向电泳技术原理简明：首先利用等电聚焦( isoelectric focusing ,IEF) 将蛋白质沿pH 梯度分离至各自等电点(isoelectric point ,pI)，通过电荷分离蛋白质；然后沿垂直的方向以十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳( sodium dodecyl sulphate polyacryla -mide gel electrophoresis ,SDS-PAGE)，通过分子量分离蛋白质。所得蛋白双维排列图中每个点代表样本中一个或数个蛋白质，而蛋白质的等电点、分子量和在样本中的含量也可显现出来。蛋白双向电泳的分辨率和灵敏度很高，一般可分离

1000～3000个蛋白质,最高可分辨11000 个蛋白质，pI 差别小于0.003 个pH 单位也可以被分辨。目前在国际蛋白质数据库如SWISS-PROT和PIR中有大量的标准IPG-DALT 双向电泳图谱可供查阅。

2 双向电泳技术在生物医学中的应用现状

双向电泳技术在生物医学的研究中发挥着重要作用,可用于研究样品总蛋白、不同样品蛋白质表达差异、蛋白质间相互作用、蛋白质修饰等。病原微生物的蛋白质组学研究，可以了解其毒性因子、致病机理以及药物抗性等方面，对疾病的诊断、治疗和预防非常重要。

2.1 双向电泳技术在病原微生物致病机理研究中的应用

结核分枝杆菌是病原微生物研究的一个重点，Jungblut等利用双向电泳技术对结核分枝杆菌H，Rv和作为疫苗的BCG菌株的比较蛋白质组分析，有毒和无毒的菌种之间存在25种重要蛋白质的差异，包括rplL和IJeuA编码的持家蛋白质、潜在致病性因子和一些假想蛋白质；通过双向电泳技术分析对培养基和细胞内生长的细菌进行比较，发现感染巨噬细胞的军团菌、布鲁氏菌、沙门氏菌中分别有一些特殊蛋白被诱导或被阻遏。此外，蛋白质组学双向电泳技术可作为致病微生物临床隔离群区分的可靠参数之一。Jungblut等对4个幽门螺杆菌临床隔离群的比较蛋白表达图谱研究发现，按地区来源可以明显分成两组。对29株李斯特菌属(Listeria)分离株的蛋白质组研究可归为6个亚类，其中19株产单核细胞李氏菌分为2个簇，这些与其他方法所得结果一致。在对流感嗜血杆菌研究中发现，实验室培养的和临床分离的遗传背景相同的菌株出现了新的ORF，对临床分离株NCTC8143进行双向电泳，发现色氨酸酶的含量较高，而实验室培养的菌株中则没有色氨酸酶。

2.2 双向电泳技术在病原微生物药物抗性基因功能研究中的应用

双向电泳技术可以进行微生物抗性机理的研究,Diffes等对Divercin V41抗性和野生型的产单核细胞李斯特氏菌进行2-DE分析，发现至少在17个蛋白质存在差异，抗性菌株中缺乏野生型菌株中的9个蛋白质，而新增8个蛋白质，其中只有1个RI是存在于已知该菌的数据库中，为鞭毛蛋白；机会致病真菌如

念珠菌属产生了许多的耐药菌株。最近研究发现，伊曲康唑类化合物通过抑制真菌细胞壁的d-葡萄糖的合成而起作用，而且对耐真菌药物的菌株起作用Bruneau

等对比mulundocandin、氟康唑和伊曲康唑3种杀真菌药处理所产生的白色念珠菌双向电泳差异蛋白质图谱后认为，氟康唑和伊曲康唑在蛋白质组水平具有共同的作用机制。Kahng等对不动杆菌的碳源分解代谢进行研究，生长在琥珀酸盐或p-hydroxybenzoate培养基不动杆菌属的A．1wofii K24(可以分解磺胺药物前体aniline)，对比它们经柱分离后的双向电泳蛋白质图谱，用N端测序和内部测序(ESI．MS／MS)鉴别了差别表达的两种原儿茶酸_3，4．二加氧酶亚基pcaH和pcaG，它们都与p-hydroxybenzoate的分解代谢有关，可能是该菌株耐药性产生的主要原因。因此，病原微生物的耐药菌株和敏感菌株的双向电泳研究，对阐明耐药相关机制、鉴定新的药物靶位和耐药诊断标志有非常重要的价值。

2.3 双向电泳技术在人类恶性肿瘤研究中的进展

人们通过双向电泳技术分离正常组织细胞与肿瘤之间的差异蛋白质组分，在寻找肿瘤的特异标志物、揭示肿瘤的发病机制以及开发新的肿瘤治疗方式和治疗药物提供理论依据等方面都取得了一些重要的进展。肿瘤发生的早期常常无任何症状,而只有在转移时才容易被发现,这往往导致延误了治疗的最佳时期。因此找到肿瘤早期的标志物进行及时的诊断和治疗显得尤为重要。Wadsworth J T等筛选了99例头颈部鳞状细胞癌患者和102例正常对照的血清蛋白质表达情况,发现了几种蛋白在患者与健康人中不同的表达情况，这种血清蛋白质双向电泳图谱经处理分析，确定检测到的几种蛋白质作为早期标志物可以筛选头颈部肿瘤,灵敏度及特异性分别达83. 3 %与100 % 。膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤，居所有恶性肿瘤的第八位，近年来其发病率有逐年上升的趋势。Kageyama等通过双向电泳和质谱技术发现calreticulin(CRT)在膀胱癌组织中高表达,定量Western blotting技术比较22例膀胱癌和10例正常膀胱上皮组织也发现calreticulin(CRT)在膀胱癌组织中高达,Western blotting分析70例膀胱癌病人发现尿样中检测CRT 的特异性为86%。这表明CRT有可能作为临床上检测膀胱癌的诊断标志物。通过双向电泳技术可以从整体出发在分子水平上研究恶性肿瘤的发病机制。Alaiya 等利用双向电泳技术研究了前列腺增生及前列腺癌的多肽图谱,发现增殖细胞核抗原(PCNA)、calreticulin、HSP90等9种蛋白的表达水平在恶性肿瘤中明显增加,而原肌球蛋白- 1,2 和cytokeration 18的表达水平却明显下降。这种变化模式与他们以前研究的多种恶性肿瘤相似，很可能为研究恶性肿瘤的发病机理提供帮助。