免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析ppt课件
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医学知识一免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析..
重视团队
我深刻认识到团队协作的重要性 ，只有大家齐心协力，才能更好
地完成项目。
沟通是关键
沟通是团队协作的关键，只有大家 保持及时有效的沟通，才能更好地 解决问题和推进项目。
互相支持
团队协作中需要互相支持和帮助， 只有大家彼此信任和支持，才能更 好地完成项目。
04
工作中的困难与挑战及解决方 案
工作中遇到的困难与挑战
THANK YOU
1. 技术更新
随着科技的发展，针织机械技术将不断更新，需 要技工不断学习和掌握新技术。
2. 安全生产
随着生产量的增加，安全生产风险也会相应增加 ，需要加强安全培训和设备维护。
3. 供应链波动
供应链的波动可能会影响生产进度和效率，需要 加强与供应商的合作和沟通。
对未来工作中可能出现的困难与挑战的预判及应对措施
对公司内部管理及团队建设的建议
加强团队凝聚力
01
加强团队内部沟通与协作，建立互信互助的氛围，提高团队的
凝聚力和战斗力。
完善激励机制
02
制定合理的薪酬制度和晋升机制，激励员工积极进取，提高员
工的工作积极性和满意度。
加强员工培训
03
建立完善的员工培训体系，提高员工的技能水平和综合素质，
为企业的长远发展提供有力的人才保障。
优化产品结构 根据市场需求和客户反馈，及时 调整产品结构，提高产品的质量 和附加值。
提升员工技能和素质 定期组织员工参加技能培训和素 质提升课程，提高员工的整体素 质和技能水平，增强企业的核心 竞争力。
加强市场营销力度 加大市场宣传力度，提高品牌知 名度和美誉度，进一步拓展市场 份额。
对公司未来发展的展望
拓展国际市场
积极开拓国际市场，扩大产品出口，提升企业在 国际市场的竞争力。
我深刻认识到团队协作的重要性 ，只有大家齐心协力，才能更好
地完成项目。
沟通是关键
沟通是团队协作的关键，只有大家 保持及时有效的沟通，才能更好地 解决问题和推进项目。
互相支持
团队协作中需要互相支持和帮助， 只有大家彼此信任和支持，才能更 好地完成项目。
04
工作中的困难与挑战及解决方 案
工作中遇到的困难与挑战
THANK YOU
1. 技术更新
随着科技的发展，针织机械技术将不断更新，需 要技工不断学习和掌握新技术。
2. 安全生产
随着生产量的增加，安全生产风险也会相应增加 ，需要加强安全培训和设备维护。
3. 供应链波动
供应链的波动可能会影响生产进度和效率，需要 加强与供应商的合作和沟通。
对未来工作中可能出现的困难与挑战的预判及应对措施
对公司内部管理及团队建设的建议
加强团队凝聚力
01
加强团队内部沟通与协作，建立互信互助的氛围，提高团队的
凝聚力和战斗力。
完善激励机制
02
制定合理的薪酬制度和晋升机制，激励员工积极进取，提高员
工的工作积极性和满意度。
加强员工培训
03
建立完善的员工培训体系，提高员工的技能水平和综合素质，
为企业的长远发展提供有力的人才保障。
优化产品结构 根据市场需求和客户反馈，及时 调整产品结构，提高产品的质量 和附加值。
提升员工技能和素质 定期组织员工参加技能培训和素 质提升课程，提高员工的整体素 质和技能水平，增强企业的核心 竞争力。
加强市场营销力度 加大市场宣传力度，提高品牌知 名度和美誉度，进一步拓展市场 份额。
对公司未来发展的展望
拓展国际市场
积极开拓国际市场，扩大产品出口，提升企业在 国际市场的竞争力。
免疫组化技术ppt课件
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗 体和多克隆抗体。单克隆抗体是一个B淋 巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合 杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体 是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从 动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋 巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
免疫组化的作用
组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原， 如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、 受体、酶、激素、核酸及病原体等都可 用相应的特异性抗体进检测。
7、SP反应 • 加入SP后放入37度烤箱中30 min。 • 用PBS洗5次×5 min； 8、显色 • 加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染 液），显色时间控制在约5 min（3～10 min）， 由镜下观察颜色控制时间。0.05％DAB（避光） （1:20储备液）：5 ul 20×DAB＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。1%DAB储备液的配制:50mg DAB+5ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，-20 ℃保 存。
2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 • 用封闭通透液浸润切片30 min（RT避 光）。配法是用预热40 ml PBS加120ul TritonX-100（曲拉通X-100又称清洁剂） 加热几分钟后，临用前加400 ul 30％ H2O2。 • PBS溶液洗3次×3 min。 3、抗原修复暴露抗原决定族 • 切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液 （pH6.0）后，在微波炉里高火4 min至 沸腾后，再加热约6 min×4次，每次间 隔补足液体，防止干片
4、封闭非特异性蛋白 • PBS溶液洗3次×3 min； • 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周 围画上圈,在圆圈内组织滴入5%羊血清（与二抗来源 一致）后放入湿盒中,室温30（10～30）min； 5、一抗孵育 • 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清， 直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后， 放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，从冰箱中取出 需37 ℃复温45 min。 6、二抗孵育 • 将一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次； • 用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放 入37 ℃恒温烤箱中30 min（回收）。 • 用PBS洗5次×5 min；
免疫组化的作用
组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原， 如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、 受体、酶、激素、核酸及病原体等都可 用相应的特异性抗体进检测。
7、SP反应 • 加入SP后放入37度烤箱中30 min。 • 用PBS洗5次×5 min； 8、显色 • 加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染 液），显色时间控制在约5 min（3～10 min）， 由镜下观察颜色控制时间。0.05％DAB（避光） （1:20储备液）：5 ul 20×DAB＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。1%DAB储备液的配制:50mg DAB+5ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，-20 ℃保 存。
2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 • 用封闭通透液浸润切片30 min（RT避 光）。配法是用预热40 ml PBS加120ul TritonX-100（曲拉通X-100又称清洁剂） 加热几分钟后，临用前加400 ul 30％ H2O2。 • PBS溶液洗3次×3 min。 3、抗原修复暴露抗原决定族 • 切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液 （pH6.0）后，在微波炉里高火4 min至 沸腾后，再加热约6 min×4次，每次间 隔补足液体，防止干片
4、封闭非特异性蛋白 • PBS溶液洗3次×3 min； • 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周 围画上圈,在圆圈内组织滴入5%羊血清（与二抗来源 一致）后放入湿盒中,室温30（10～30）min； 5、一抗孵育 • 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清， 直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后， 放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，从冰箱中取出 需37 ℃复温45 min。 6、二抗孵育 • 将一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次； • 用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放 入37 ℃恒温烤箱中30 min（回收）。 • 用PBS洗5次×5 min；
免疫组化课件PPT课件
李
三 华
特点
优点
特异性强，定位准；
结果直观；
形态学改变与功能和代谢相结合；
组织标本可用石蜡保存进性回顾性研究。
缺点
步骤多，影响实验成败的因素多；
以定位、定性和半定量研究为主，绝对定量
分析尚需标准化。
第四页，共28页。
中
心
实
验
室 李 三 华
二 免疫组化技术的基本步骤
1.制片
组织切片(石蜡切片、冰冻切片)
IHC,WB,FC,ELISA,IP； 石蜡切片(IHC－P),冰冻切片(IHC－Fr),
甲醛固定冰冻切片（IHC-FoFr）。 (5)与抗原结合的部位
亚型， C-或N-，胞外区域或胞内区域。 （6）公司，价格。
第十七页，共28页。
中
心
实
验 室 李 三
国外主要抗体试剂公司
华
用途
公司
用途
最全 离子通道
李
三
华
常用酶
辣根过氧化物酶（ Horseradise peroaidase，HRP)
底物：DAB(四盐酸二氨基联苯胺)，产物为棕褐色。
碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase, AP）
底物：NBT（四氮唑蓝），产物为紫蓝色。
葡萄糖氧化酶（glucoseoxdase,GOD）
底物：葡萄糖，产物为蓝色。
第二页，共28页。
中
心 实 验 室
李
应用
三
华
凡是组织细胞内具有抗原性的物质
（肽类、蛋白质、细胞因子、受体、激素
、神经递质、核酸、表面抗原）或抗体均
可用免疫组织化学方法显示而进行定性、
定位分析或定量研究，进而深入研究其
免疫组化的原理与操作 共40页PPT资料
特点或优点：（1）特异性强、灵敏度高； （2）可定性、定位、定量观察； （3）将形态学改变与功能和代谢变化结 合起来；
IHC不仅具有传统形态学（包括LM和EM水平） 能对组织和细胞进行仔细、客观观察的优点（特别 是经苏木精或伊红复染后），而且还克服了传统免 疫学反应只能定性和定量（离体、液相），而不能 定位的缺点。IHC则可在原位和固相对染色结果进 行观察。目前IHC的定位可精确到亚微结构水平。
1、固定的含义
固定是指以某种化学物质使蛋白质、酶类（变性 ）、脂质、糖类等物质保持在组织细胞原位，避免 Ag溶解、扩散、丢失；保持组织细胞的正常形态结 构。
——1974年Stemberger 改良上述技术，建立辣根过氧 化物酶－抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫 细胞化学得到广泛应用；
——80年代Hsu等建立了ABC法之后，免疫金—银染色
法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。 ——90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细
胞化学分类方法迅速发展； ——2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组
化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合 研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个 学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技 术之一； ——国内起步晚，从70s开始。
二、IHC的现状和发展前景
（一）方法学
1.从传统的抗原、抗体反应（免疫反应）→亲和反应。新的亲 和物质对有：生物素与卵白素（biotin&avidin)，葡萄球菌A 蛋白（SPA）与IgG，凝集素与受体，激素与受体。这些亲 和对亲和力强，且可与多种标记物（荧光素、酶、同位素、 胶体金、铁蛋白等）结合，由此产生了亲和组织化学 （affinity histochemistry），这些方法特异性、敏感性、稳 定性高，更方便、适于某些特殊观察（如EM）。
IHC不仅具有传统形态学（包括LM和EM水平） 能对组织和细胞进行仔细、客观观察的优点（特别 是经苏木精或伊红复染后），而且还克服了传统免 疫学反应只能定性和定量（离体、液相），而不能 定位的缺点。IHC则可在原位和固相对染色结果进 行观察。目前IHC的定位可精确到亚微结构水平。
1、固定的含义
固定是指以某种化学物质使蛋白质、酶类（变性 ）、脂质、糖类等物质保持在组织细胞原位，避免 Ag溶解、扩散、丢失；保持组织细胞的正常形态结 构。
——1974年Stemberger 改良上述技术，建立辣根过氧 化物酶－抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫 细胞化学得到广泛应用；
——80年代Hsu等建立了ABC法之后，免疫金—银染色
法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。 ——90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细
胞化学分类方法迅速发展； ——2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组
化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合 研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个 学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技 术之一； ——国内起步晚，从70s开始。
二、IHC的现状和发展前景
（一）方法学
1.从传统的抗原、抗体反应（免疫反应）→亲和反应。新的亲 和物质对有：生物素与卵白素（biotin&avidin)，葡萄球菌A 蛋白（SPA）与IgG，凝集素与受体，激素与受体。这些亲 和对亲和力强，且可与多种标记物（荧光素、酶、同位素、 胶体金、铁蛋白等）结合，由此产生了亲和组织化学 （affinity histochemistry），这些方法特异性、敏感性、稳 定性高，更方便、适于某些特殊观察（如EM）。
免疫组化 ppt课件
（2）细胞固定 离心→涂片→固定5到10分钟→漂洗→组化
（三）组织的脱水、浸蜡、包埋和切片
前三步只用于石蜡切片，冰冻切片不需此步骤。
1、包埋
定义：脱水透明后，用石蜡、火棉胶、 环氧树脂等支持剂透入组织内部使之变 硬（利于切片）的过程。石蜡包埋适于 绝大多数组织学和组化技术。
2、常规石蜡包埋过程
(1)脱水：75％、85％乙醇，95％Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ乙醇，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
(二) 内源性酶的消除方法
1、内源性过氧化物酶的消除方法 1） 0.3～3% H2O2甲醇溶液浸泡20min 2） 3％ H2O2溶液浸泡20min
2、内源性碱性磷酸酶的消除方法
左旋咪唑 （24mg/ml）加入底物液 中,并保持pH7.6-8.2。
（三）抗原修复
1、目的 暴露被交联封闭的Ag。主要适用于经长期 formalin固定的标本、石蜡包埋标本。
2、修复液 10mM，pH 6.0的枸橼酸钠缓冲液
3、常用的修复方法有
1） 微波加热 2） 高压锅处理 3） 酶消化处理 ：常用0.1%的胰蛋白酶(含0.1%
CaCl2，pH7.8)，37℃ 10min(细胞内抗原)或 0.4%胃 蛋白酶，37℃ 30min以上(细胞间抗原)。
（四）封闭
采用正常二抗来源的动物血清封闭，以 减少一抗非特异性结合。
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
直接法特点：1、此法特异性高，但敏感性低； 2、每种抗体均需单独标记，使用不便。
间接法特点： 1、敏感性较直接法高3-4倍，但特异 性较低；2、不必标记每种一抗，只需标记某一种动 物的二抗。
常用的免疫组化方法
（一）亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术 （avidin-biotin-peroxidase complex technique， 简称ABC法）。
（三）组织的脱水、浸蜡、包埋和切片
前三步只用于石蜡切片，冰冻切片不需此步骤。
1、包埋
定义：脱水透明后，用石蜡、火棉胶、 环氧树脂等支持剂透入组织内部使之变 硬（利于切片）的过程。石蜡包埋适于 绝大多数组织学和组化技术。
2、常规石蜡包埋过程
(1)脱水：75％、85％乙醇，95％Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ乙醇，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
(二) 内源性酶的消除方法
1、内源性过氧化物酶的消除方法 1） 0.3～3% H2O2甲醇溶液浸泡20min 2） 3％ H2O2溶液浸泡20min
2、内源性碱性磷酸酶的消除方法
左旋咪唑 （24mg/ml）加入底物液 中,并保持pH7.6-8.2。
（三）抗原修复
1、目的 暴露被交联封闭的Ag。主要适用于经长期 formalin固定的标本、石蜡包埋标本。
2、修复液 10mM，pH 6.0的枸橼酸钠缓冲液
3、常用的修复方法有
1） 微波加热 2） 高压锅处理 3） 酶消化处理 ：常用0.1%的胰蛋白酶(含0.1%
CaCl2，pH7.8)，37℃ 10min(细胞内抗原)或 0.4%胃 蛋白酶，37℃ 30min以上(细胞间抗原)。
（四）封闭
采用正常二抗来源的动物血清封闭，以 减少一抗非特异性结合。
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
直接法特点：1、此法特异性高，但敏感性低； 2、每种抗体均需单独标记，使用不便。
间接法特点： 1、敏感性较直接法高3-4倍，但特异 性较低；2、不必标记每种一抗，只需标记某一种动 物的二抗。
常用的免疫组化方法
（一）亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术 （avidin-biotin-peroxidase complex technique， 简称ABC法）。
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题PPT文档36页
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的 应用比较及常见问题
41、俯仰终宇宙，不乐复何如。 42、夏日长抱饥，寒夜无被眠。 43、不戚戚于贫贱，不汲汲于富贵。 44、欲言无予和，挥杯劝孤影。 45、盛年不重来，一日难再晨。及时 当勉励 ，岁月 不待人 。
பைடு நூலகம்
谢谢
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的 应用比较及常见问题
41、俯仰终宇宙，不乐复何如。 42、夏日长抱饥，寒夜无被眠。 43、不戚戚于贫贱，不汲汲于富贵。 44、欲言无予和，挥杯劝孤影。 45、盛年不重来，一日难再晨。及时 当勉励 ，岁月 不待人 。
பைடு நூலகம்
谢谢
免疫检验-第十二章-免疫组化PPT课件
第十二章免疫组织化学技术
掌握各种免疫组织化学技术的原理
免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞 原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗 原进行定性定位、定量测定的一项免疫检测方法。
第一节
免疫组织化学技术要点
根据标记物的性质不同分类： 荧光免疫组织化学技术 酶免疫组织化学技术 免疫金（银）组织化学技术 亲和组织化学技术 免疫电镜组织化学技术等
察组织和细胞结构的理想方法，可以用于回顾性研究。 缺点：抗原常被封闭和破坏。对抗原的保存不如冰冻切片。
冰冻切片： 优点：能避免石蜡切片因固定，脱水，浸蜡等对抗原的损失，
较好的保存组织抗原的免疫活性，适用于不稳定的抗原。 缺点：不易保存（-800C）；细胞内易形成冰晶而破坏抗原
结构，造成抗原的弥散使定位不准确。
优点： 敏感性较酶标法有所提高 缺点： ➢ 操作分四步，较复杂 ➢ 如果抗酶抗体与酶结合弱，在操作中酶常被冲洗掉 ➢ 如果酶标记在非特异性抗体上会存在背景着色问题 ➢ 如果抗酶抗体的非特异性成分与桥抗结合，结果就与抗 酶抗体竞争桥抗的结合位点，也会影响方法的敏感性
兔源一抗/Ab1
+
Ag
+
Ag
底物
+ HRP
（四）特异性染色与非特异性染色
分布在特定的部位，显色不均一
特异性染色无分布规律，均匀显色
特异性染色
非特异性染色
分布在特非定特的部异位性, 染具结色构性
无分布规律，常出现在切片边缘、 刀痕或皱折部位及坏死或挤压的 细胞区域
由于细胞内抗原含量不同，所以 不限于单个细胞，而是累及一片
显色不均一
细胞，均匀显色
（一) 亲合素-生物素-过氧化酶复合物技术ABC
掌握各种免疫组织化学技术的原理
免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞 原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗 原进行定性定位、定量测定的一项免疫检测方法。
第一节
免疫组织化学技术要点
根据标记物的性质不同分类： 荧光免疫组织化学技术 酶免疫组织化学技术 免疫金（银）组织化学技术 亲和组织化学技术 免疫电镜组织化学技术等
察组织和细胞结构的理想方法，可以用于回顾性研究。 缺点：抗原常被封闭和破坏。对抗原的保存不如冰冻切片。
冰冻切片： 优点：能避免石蜡切片因固定，脱水，浸蜡等对抗原的损失，
较好的保存组织抗原的免疫活性，适用于不稳定的抗原。 缺点：不易保存（-800C）；细胞内易形成冰晶而破坏抗原
结构，造成抗原的弥散使定位不准确。
优点： 敏感性较酶标法有所提高 缺点： ➢ 操作分四步，较复杂 ➢ 如果抗酶抗体与酶结合弱，在操作中酶常被冲洗掉 ➢ 如果酶标记在非特异性抗体上会存在背景着色问题 ➢ 如果抗酶抗体的非特异性成分与桥抗结合，结果就与抗 酶抗体竞争桥抗的结合位点，也会影响方法的敏感性
兔源一抗/Ab1
+
Ag
+
Ag
底物
+ HRP
（四）特异性染色与非特异性染色
分布在特定的部位，显色不均一
特异性染色无分布规律，均匀显色
特异性染色
非特异性染色
分布在特非定特的部异位性, 染具结色构性
无分布规律，常出现在切片边缘、 刀痕或皱折部位及坏死或挤压的 细胞区域
由于细胞内抗原含量不同，所以 不限于单个细胞，而是累及一片
显色不均一
细胞，均匀显色
（一) 亲合素-生物素-过氧化酶复合物技术ABC
《免疫组化和荧光》课件
染色效果等方面。
信号获取
免疫组化通常通过酶促反应产生颜色 变化以观察抗原，而荧光技术则通过 特定波长的光激发产生荧光信号进行
观察。
标记方法
免疫组化使用酶或化学发光剂作为标 记物，而荧光技术则使用荧光染料或 荧光蛋白。
染色效果
免疫组化染色通常为细胞或组织提供 较好的背景染色效果，而荧光染色则 具有较高的特异性和敏感性。
实验操作比较
总结词
免疫组化和荧光技术的实验操作 有所不同，前者需要较长的孵育 时间和多步洗涤步骤，后者则相
对简便。
免疫组化实验操作
需要进行抗原修复、阻断、加一 抗和二抗、洗涤以及显色等步骤 ，每个步骤都需要一定的时间孵 育和洗涤，因此整个实验过程相
对较长。
荧光实验操作
通常包括荧光染料的标记、洗涤 和观察等步骤，由于荧光染料具 有较高的特异性和敏感性，因此 实验操作相对简便，且荧光信号
应用范围比较
01 总结词
免疫组化和荧光技术在应用范围上有所不同，前 者更常用于临床病理诊断，后者更适用于生物学 和医学研究。
02 临床病理诊断
免疫组化技术广泛应用于临床病理诊断，用于检 测和定位肿瘤、感染性疾病和其他疾病的相关抗 原。
03 生物学和医学研究
荧光技术则广泛应用于生物学和医学研究，如基 因表达、蛋白质定位和相互作用以及细胞生物学 等领域。
分类与应用
01
分类
直接法、间接法、夹心法等。
02
应用
在病理学、生物学、医学等领域广泛应用，用于 肿瘤诊断、鉴别诊断、疗效评估等。
优缺点分析
优点
高特异性、高灵敏度、定位准确等。
缺点
操作复杂、耗时长、成本较高等。
02
荧光技术概述
信号获取
免疫组化通常通过酶促反应产生颜色 变化以观察抗原，而荧光技术则通过 特定波长的光激发产生荧光信号进行
观察。
标记方法
免疫组化使用酶或化学发光剂作为标 记物，而荧光技术则使用荧光染料或 荧光蛋白。
染色效果
免疫组化染色通常为细胞或组织提供 较好的背景染色效果，而荧光染色则 具有较高的特异性和敏感性。
实验操作比较
总结词
免疫组化和荧光技术的实验操作 有所不同，前者需要较长的孵育 时间和多步洗涤步骤，后者则相
对简便。
免疫组化实验操作
需要进行抗原修复、阻断、加一 抗和二抗、洗涤以及显色等步骤 ，每个步骤都需要一定的时间孵 育和洗涤，因此整个实验过程相
对较长。
荧光实验操作
通常包括荧光染料的标记、洗涤 和观察等步骤，由于荧光染料具 有较高的特异性和敏感性，因此 实验操作相对简便，且荧光信号
应用范围比较
01 总结词
免疫组化和荧光技术在应用范围上有所不同，前 者更常用于临床病理诊断，后者更适用于生物学 和医学研究。
02 临床病理诊断
免疫组化技术广泛应用于临床病理诊断，用于检 测和定位肿瘤、感染性疾病和其他疾病的相关抗 原。
03 生物学和医学研究
荧光技术则广泛应用于生物学和医学研究，如基 因表达、蛋白质定位和相互作用以及细胞生物学 等领域。
分类与应用
01
分类
直接法、间接法、夹心法等。
02
应用
在病理学、生物学、医学等领域广泛应用，用于 肿瘤诊断、鉴别诊断、疗效评估等。
优缺点分析
优点
高特异性、高灵敏度、定位准确等。
缺点
操作复杂、耗时长、成本较高等。
02
荧光技术概述
免疫组化结果判断及常见问题的分析ppt课件
（＋＋
P53
Barnes法
A：瘤细胞显色有无及深浅 0（不着色） 1（浅黄色） 2（棕黄色） 3（棕褐色）
B：显色细胞的比例 1（1%~10%） 2（11%~50%） 3（51%~80%） 4（＞80%）
评分=A×B 0分：阴性 1~4分：弱阳性 ＞4分：强阳性
PCNA
阳性面积百分比
40×10视野，选取5个视野，计算阳性区域面积占整个参考 面积的百分率。
嗜酸性粒细胞中细胞色素显色
吞噬细胞内 含铁血黄素
坏死组织着色：AE1/AE3
坏死组织着色
交叉反应：乳腺ki-67组织细胞胞浆着色
黑色素瘤，细胞内含黑色素，呈紫黑色，HE染色
灶状着色：机械原因着色
全片着色
Cyclin D1 套细胞淋巴瘤
全片着色
边缘着色
“阴阳脸”着 色
气泡
非特异性着色及其对策
内源性生物素 电荷吸附 抗体不纯
切片制片不当 加试剂后切片干燥
对策 每步冲洗3×5min
3％H2O2封闭 使用生物素阻断试剂盒阻断
非免疫动物血清封闭 采用单克隆抗体 改善取材和制片 防止切片干燥
内源性生物素—肾小管
内源性生物素—淋巴结转移性甲状腺腺癌
蜕膜组织部分胞核PR阳性，血管内红细胞过氧化物酶显色
不合格的免疫组化染色切片 容易导致误判
C-erbB-2
优
中
良
差
ER
4
2
3
1ห้องสมุดไป่ตู้
PR
子宫内膜PR染色，修复不足
子宫内膜PR染色，修复良好
二、染色结果的判断
编号 1 2 3 4 5
阳性片 － ＋ － ＋ ＋
待检片 － ＋ ＋ － ＋
流式细胞术免疫标记简介完整ppt课件
T细胞及其亚群 T祖细胞（pro-T）的表型为CD34+、TdT+、CD10+、
CD7+ 未成熟T细胞标志CD3、CD4和CD8。 在T细胞发育过程中，CD7是最早出现的T细胞标志，
且贯穿表达在整个T细胞分化发育过程中。 胸腺细胞要分化发育为有功能的成熟T细胞，细胞
表面标志需经历一定的变化过程。
流式细胞术系列讲座之——免疫标记
流式细胞术免疫标记应用简介
2009-12-03
上次流式细胞术讲座内容（概述）
流式细胞术的一般介绍 流式细胞术在临床检测和科研中的应用
流式细胞仪可检测的细胞参数
细胞结构 细胞大小 细胞颗粒性程度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量
（6）浆细胞（plasma cell）：激活B细胞进 一步分化成为产生抗体的浆细胞，这时获得 PC-1、PCA-1和CD138浆细胞特异抗原，CD85表 达增加，CD38抗原再出现。而SIg和上述B抗原 消失。CD79仍可存在于胞质中。
CD7+、CD2+、CD3+、 CD4-、CD8+、TCR+
进入外周淋巴器官和血液，执行免疫功能
正常外周血中通常存在的T细胞亚群
CD3+、CD4+、CD8-：T辅助/诱导细胞（Th/Ti），占
T细胞总数的60%~70%；
CD3+、CD4-、CD8+：T抑制/杀伤细胞（Ts/Tc） ，
20%~30%； CD3+ CD4+ CD8+ ： 1%~3%； CD3+ CD4- CD8-：1%~10%。
细胞功能 细胞表面蛋白抗原 细胞胞浆内蛋白性
CD7+ 未成熟T细胞标志CD3、CD4和CD8。 在T细胞发育过程中，CD7是最早出现的T细胞标志，
且贯穿表达在整个T细胞分化发育过程中。 胸腺细胞要分化发育为有功能的成熟T细胞，细胞
表面标志需经历一定的变化过程。
流式细胞术系列讲座之——免疫标记
流式细胞术免疫标记应用简介
2009-12-03
上次流式细胞术讲座内容（概述）
流式细胞术的一般介绍 流式细胞术在临床检测和科研中的应用
流式细胞仪可检测的细胞参数
细胞结构 细胞大小 细胞颗粒性程度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量
（6）浆细胞（plasma cell）：激活B细胞进 一步分化成为产生抗体的浆细胞，这时获得 PC-1、PCA-1和CD138浆细胞特异抗原，CD85表 达增加，CD38抗原再出现。而SIg和上述B抗原 消失。CD79仍可存在于胞质中。
CD7+、CD2+、CD3+、 CD4-、CD8+、TCR+
进入外周淋巴器官和血液，执行免疫功能
正常外周血中通常存在的T细胞亚群
CD3+、CD4+、CD8-：T辅助/诱导细胞（Th/Ti），占
T细胞总数的60%~70%；
CD3+、CD4-、CD8+：T抑制/杀伤细胞（Ts/Tc） ，
20%~30%； CD3+ CD4+ CD8+ ： 1%~3%； CD3+ CD4- CD8-：1%~10%。
细胞功能 细胞表面蛋白抗原 细胞胞浆内蛋白性
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析ppt课件
免疫组织化学原理及特点 ➢利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的标记 技术，通过化学反应使标记抗体显色，对组织细 胞内的特异性抗原进行定位、定性、定量检测的 一门技术。
➢免疫组化具有操作简单，特异性强，敏感性高， 定位准确，形态与功能相结合等特点。
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
4. BCIP/INT显色法
➢产品描述：BCIP/INT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷 酸/p-碘硝基四唑）是一种冷藏稳定的、单一 组分溶液，用于免疫组化、原位杂交、 western blot、northern blot和southern blot， 特异性地与碱性磷酸酶反应生成橙色/棕褐 色物质。
➢ 试剂盒组成：
24
流式细胞术常见结果分析
直方图：单参数分析
人外周全血细胞双参数散点图
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
12
免疫荧光 （Immunofluorescence, IF）
免疫荧光原理及特点
➢免疫荧光就是利用抗原与抗体的特异性结合原理及特殊的 荧光素标记技术，通过激光激发使荧光素发出荧光，在荧光 显微镜下观察荧光的变化从而对细胞内的抗原进行分析的技 术。用免疫荧光显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质 等方法称为免疫荧光细胞（或组织）技术。
流式细胞术flowcytometryfc免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析21荧光物质fitcpe等不同颜色的激发光激光源转化为计算机识别数据免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析22流式细胞仪工作原理图免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析23免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析24流式细胞术实验过程细胞悬浮液制备浓度为1510个ml细胞固定合适的固定液如4甲醛溶液等细胞膜穿透冰冷的甲醇等封闭3bsapbs等一抗孵育荧光二抗孵育流式细胞仪分析免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析25人外周全血细胞双参数散点图直方图
➢免疫组化具有操作简单，特异性强，敏感性高， 定位准确，形态与功能相结合等特点。
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
4. BCIP/INT显色法
➢产品描述：BCIP/INT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷 酸/p-碘硝基四唑）是一种冷藏稳定的、单一 组分溶液，用于免疫组化、原位杂交、 western blot、northern blot和southern blot， 特异性地与碱性磷酸酶反应生成橙色/棕褐 色物质。
➢ 试剂盒组成：
24
流式细胞术常见结果分析
直方图：单参数分析
人外周全血细胞双参数散点图
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
12
免疫荧光 （Immunofluorescence, IF）
免疫荧光原理及特点
➢免疫荧光就是利用抗原与抗体的特异性结合原理及特殊的 荧光素标记技术，通过激光激发使荧光素发出荧光，在荧光 显微镜下观察荧光的变化从而对细胞内的抗原进行分析的技 术。用免疫荧光显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质 等方法称为免疫荧光细胞（或组织）技术。
流式细胞术flowcytometryfc免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析21荧光物质fitcpe等不同颜色的激发光激光源转化为计算机识别数据免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析22流式细胞仪工作原理图免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析23免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析24流式细胞术实验过程细胞悬浮液制备浓度为1510个ml细胞固定合适的固定液如4甲醛溶液等细胞膜穿透冰冷的甲醇等封闭3bsapbs等一抗孵育荧光二抗孵育流式细胞仪分析免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析25人外周全血细胞双参数散点图直方图
免疫组化技术常见问题及处理方法ppt课件
• 温度有 4 度、室温、37度，其中4 度最佳，反应 最温和，背景较浅；而 37度反应速度较快，时间 较短；室温不太提倡
• 4度过夜和从冰箱拿出后需37度复温45min
45
复温的必要性
• 防止切片从4度直接放入PBS易脱片
• 使抗原抗体结合更稳定 4度和37度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机 率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性 也提高了并易造成非特异染色
• 80℃烘烤1～2h
• 玻片用防脱片或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性
26
冰冻切片的处理
• 冰冻切片的组织抗原保存好 • 通常以5um的厚度为佳 • 冷风吹干后用纯丙酮固定2遍,干燥置入4 ℃冰箱
短期保存，－20℃冰箱长期干燥保存 • 缺点是不易做出好的冰冻切片，易出现冰晶、细
胞肿胀等现象
27
细胞涂片的处理
48
• （3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用 现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的 DAB不应存放时间太长，DAB的显色最好在显微 镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应
• （4）组织变干 • （5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长
（大于24小时） • （6）一抗变质、质量差的多克隆抗体
• （2）显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的 棕褐色，说明抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要 下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间；或前面的封闭非特 异性蛋白不全，需要延长封闭时间
• （3）显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染 色，说明抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度 过夜）；或封闭时间过长
育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗3分钟×5次。 • 7）应用DAB 溶液显色。 • 8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。
• 4度过夜和从冰箱拿出后需37度复温45min
45
复温的必要性
• 防止切片从4度直接放入PBS易脱片
• 使抗原抗体结合更稳定 4度和37度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机 率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性 也提高了并易造成非特异染色
• 80℃烘烤1～2h
• 玻片用防脱片或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性
26
冰冻切片的处理
• 冰冻切片的组织抗原保存好 • 通常以5um的厚度为佳 • 冷风吹干后用纯丙酮固定2遍,干燥置入4 ℃冰箱
短期保存，－20℃冰箱长期干燥保存 • 缺点是不易做出好的冰冻切片，易出现冰晶、细
胞肿胀等现象
27
细胞涂片的处理
48
• （3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用 现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的 DAB不应存放时间太长，DAB的显色最好在显微 镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应
• （4）组织变干 • （5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长
（大于24小时） • （6）一抗变质、质量差的多克隆抗体
• （2）显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的 棕褐色，说明抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要 下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间；或前面的封闭非特 异性蛋白不全，需要延长封闭时间
• （3）显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染 色，说明抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度 过夜）；或封闭时间过长
育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗3分钟×5次。 • 7）应用DAB 溶液显色。 • 8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。
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有机溶剂中的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和p-碘硝 基四唑
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
10
免疫组织化学结果分析
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
11
免疫组织化学常见问题分析
1.显色过深
➢一抗浓度过高或孵育时间过长，建议降低 一抗浓度或减少孵育时间。
3
二 抗
IHC
一
反
抗
应 原
抗
理
原
示
意
图
辣根过氧化物酶（HRP）
棕褐色络合物
3，3-二氨联苯胺（DAB） 显色剂
细 胞
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
4
组织切片/芯片制作
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
5
组织芯片/切片应用
1. 组织芯片
➢组织芯片（或组织微阵列）是将数十个甚 至上千个不同个体的组织标本集成在一张固 相载体上，组织芯片中含有蛋白，RNA及 DAN分子，是一种高通量的研究分析工具。 研究者一次可有效利用成百上千份正常或疾 病状态下的组织标本来研究特定基因及其所 表达的蛋白质与疾病之间的关系。
2. AEC显色法
➢产品描述：3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9ethylcarbazole，AEC) 是过氧化物酶 (Peroxidase) 的显色底物，在过氧化物酶的 催化下，AEC显色工作液会于反应部位产生 溶于酒精的红色沉淀，必须在水溶性介质中 复染和封片。本试剂盒适用于辣根过氧化物 酶（HRP）系统的免疫组化显色，包括AEC 显色原和与之配套的稀释液。 ➢试剂盒组成： AEC显色原（试剂A） AEC底物缓冲液（试剂B）
免疫组化、免疫荧光、 流式细胞术的应用比较 及常见问题分析
➢ 免疫组化（IHC）的应用介绍 ➢ 免疫荧光（IF）的应用介绍 ➢ 流式细胞术（FC）的应用介绍 ➢ IHC、IF、FC区别与联系
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
2
免疫组织化学 （Immunohistochemistry, IHC）
➢特点：该法孵育时间短（通常为10min）， 灵敏度高以及低背景染色等特点。
3. Polymer酶标二抗法
➢原理：该法采用一段多聚氨基酸聚合物做 为载体链，将该多聚物与二抗结合，然后可 再标记上多个HRP/AP酶分子，所以同样具 有很高的信号放大作用。
➢特点：灵敏度高；操作步骤简单；无需进 行内源性的生物素封闭。
9
IHC显色方法原理及选择
1. DAB显色法
➢产品描述：二氨基联苯胺( 3，3’diaminobenzidine，DAB ) 是过氧化物酶 (Peroxidase) 的显色底物，在过氧化物酶的 催化下，DAB显色工作液会于反应部位产生 不溶于酒精的棕褐色沉淀。本试剂盒适用于 辣根过氧化物酶（HRP）系统的免疫组化显 色。 ➢试剂盒组成： DAB显色原（20×）（试剂A） DAB底物缓冲液（1×）（试剂B）
3. BCIP/NBT显色法
➢产品描述：BCIP/NBT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷 酸/氮蓝四唑）是一种冷藏稳定的、单一组 分溶液，用于免疫组化、原位杂交、 western blot、northern blot和southern blot， 特异性地与碱性磷酸酶（AP）反应生成紫色 物质。 ➢试剂盒组成： 有机溶剂中的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氮蓝四 唑
免疫组织化学原理及特点 ➢利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的标记 技术，通过化学反应使标记抗体显色，对组织细 胞内的特异性抗原进行定位、定性、定量检测的 一门技术。
➢免疫组化具有操作简单，特异性强，敏感性高， 定位准确，形态与功能相结合等特点。
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
2. 组织芯片应用领域
组织芯片的应用领域包括与生命科学相关的 基础研究、临床研究、应用研究和新药开发 等。 ➢免疫组化染色（IHC）； ➢原位杂交（ISH）； ➢荧光原位杂交（FISH）； ➢原位末端标记分析（TUNEL）； ➢原位PCR 以及激光捕获显微分离系统辅 助的cDNA杂交。
3. Abgent 现有组织切片/芯片产品
2. SP法
➢原理：根据生物素(Biotin) 与链霉亲和素 (Streptavidin)具有强结合力的原理设计。在 一抗（兔源与鼠源）与相应的靶抗原结合后， 生物素化标记的抗多价二抗与一抗特异结合； 二抗上标记的生物素与标记了辣根过氧化物 酶（HRP）的链霉亲和素结合，形成抗原～ 特异性一抗～生物素化的二抗～HRP 标记 的链霉亲和素复合物。
4. BCIP/INT显色法
➢产品描述：BCIP/INT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷 酸/p-碘硝基四唑）是一种冷藏稳定的、单一 组分溶液，用于免疫组化、原位杂交、 western blot、northern blot和southern blot， 特异性地与碱性磷酸酶反应生成橙色/棕褐 色物质。
➢ 试剂盒组成：
➢全套鼠类器官组织切片；
➢全套猴类器官组织切片；
➢人类常见癌症组织切片；
➢组织芯片客户定制服务。
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
6
Hale Waihona Puke 疫组化流程示意图免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
7
IHC二抗原理及选择
1. SABC法
➢原理：SABC法是利用链酶亲和素 (Streptavidin)与生物素(Biotin)特有的高度亲 和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过 氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP， 然后与链酶亲和素按一定比例混合，形成 SABC复合物。用生物素化二抗与第一抗体 结合，再与SABC复合物联结形成抗原～抗 体～生物素化二抗～ SABC复合物。最后用 底物显色剂显色。 ➢特点：该法具有灵敏度高以及低背景染色 等特点。
4. 直接酶标二抗法
➢该法是将HRP/AP酶分子直接标记于二抗 上。因此需要普通的酶标二抗即可完成。实 验简单，成本低，但是因为没有信号放大作 用，所以对很多表达丰度不是很高的抗原就 可能检测不到。
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
8
IHC常用酶标二抗原理示意图
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
10
免疫组织化学结果分析
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
11
免疫组织化学常见问题分析
1.显色过深
➢一抗浓度过高或孵育时间过长，建议降低 一抗浓度或减少孵育时间。
3
二 抗
IHC
一
反
抗
应 原
抗
理
原
示
意
图
辣根过氧化物酶（HRP）
棕褐色络合物
3，3-二氨联苯胺（DAB） 显色剂
细 胞
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
4
组织切片/芯片制作
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
5
组织芯片/切片应用
1. 组织芯片
➢组织芯片（或组织微阵列）是将数十个甚 至上千个不同个体的组织标本集成在一张固 相载体上，组织芯片中含有蛋白，RNA及 DAN分子，是一种高通量的研究分析工具。 研究者一次可有效利用成百上千份正常或疾 病状态下的组织标本来研究特定基因及其所 表达的蛋白质与疾病之间的关系。
2. AEC显色法
➢产品描述：3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9ethylcarbazole，AEC) 是过氧化物酶 (Peroxidase) 的显色底物，在过氧化物酶的 催化下，AEC显色工作液会于反应部位产生 溶于酒精的红色沉淀，必须在水溶性介质中 复染和封片。本试剂盒适用于辣根过氧化物 酶（HRP）系统的免疫组化显色，包括AEC 显色原和与之配套的稀释液。 ➢试剂盒组成： AEC显色原（试剂A） AEC底物缓冲液（试剂B）
免疫组化、免疫荧光、 流式细胞术的应用比较 及常见问题分析
➢ 免疫组化（IHC）的应用介绍 ➢ 免疫荧光（IF）的应用介绍 ➢ 流式细胞术（FC）的应用介绍 ➢ IHC、IF、FC区别与联系
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
2
免疫组织化学 （Immunohistochemistry, IHC）
➢特点：该法孵育时间短（通常为10min）， 灵敏度高以及低背景染色等特点。
3. Polymer酶标二抗法
➢原理：该法采用一段多聚氨基酸聚合物做 为载体链，将该多聚物与二抗结合，然后可 再标记上多个HRP/AP酶分子，所以同样具 有很高的信号放大作用。
➢特点：灵敏度高；操作步骤简单；无需进 行内源性的生物素封闭。
9
IHC显色方法原理及选择
1. DAB显色法
➢产品描述：二氨基联苯胺( 3，3’diaminobenzidine，DAB ) 是过氧化物酶 (Peroxidase) 的显色底物，在过氧化物酶的 催化下，DAB显色工作液会于反应部位产生 不溶于酒精的棕褐色沉淀。本试剂盒适用于 辣根过氧化物酶（HRP）系统的免疫组化显 色。 ➢试剂盒组成： DAB显色原（20×）（试剂A） DAB底物缓冲液（1×）（试剂B）
3. BCIP/NBT显色法
➢产品描述：BCIP/NBT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷 酸/氮蓝四唑）是一种冷藏稳定的、单一组 分溶液，用于免疫组化、原位杂交、 western blot、northern blot和southern blot， 特异性地与碱性磷酸酶（AP）反应生成紫色 物质。 ➢试剂盒组成： 有机溶剂中的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氮蓝四 唑
免疫组织化学原理及特点 ➢利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的标记 技术，通过化学反应使标记抗体显色，对组织细 胞内的特异性抗原进行定位、定性、定量检测的 一门技术。
➢免疫组化具有操作简单，特异性强，敏感性高， 定位准确，形态与功能相结合等特点。
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
2. 组织芯片应用领域
组织芯片的应用领域包括与生命科学相关的 基础研究、临床研究、应用研究和新药开发 等。 ➢免疫组化染色（IHC）； ➢原位杂交（ISH）； ➢荧光原位杂交（FISH）； ➢原位末端标记分析（TUNEL）； ➢原位PCR 以及激光捕获显微分离系统辅 助的cDNA杂交。
3. Abgent 现有组织切片/芯片产品
2. SP法
➢原理：根据生物素(Biotin) 与链霉亲和素 (Streptavidin)具有强结合力的原理设计。在 一抗（兔源与鼠源）与相应的靶抗原结合后， 生物素化标记的抗多价二抗与一抗特异结合； 二抗上标记的生物素与标记了辣根过氧化物 酶（HRP）的链霉亲和素结合，形成抗原～ 特异性一抗～生物素化的二抗～HRP 标记 的链霉亲和素复合物。
4. BCIP/INT显色法
➢产品描述：BCIP/INT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷 酸/p-碘硝基四唑）是一种冷藏稳定的、单一 组分溶液，用于免疫组化、原位杂交、 western blot、northern blot和southern blot， 特异性地与碱性磷酸酶反应生成橙色/棕褐 色物质。
➢ 试剂盒组成：
➢全套鼠类器官组织切片；
➢全套猴类器官组织切片；
➢人类常见癌症组织切片；
➢组织芯片客户定制服务。
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
6
Hale Waihona Puke 疫组化流程示意图免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
7
IHC二抗原理及选择
1. SABC法
➢原理：SABC法是利用链酶亲和素 (Streptavidin)与生物素(Biotin)特有的高度亲 和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过 氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP， 然后与链酶亲和素按一定比例混合，形成 SABC复合物。用生物素化二抗与第一抗体 结合，再与SABC复合物联结形成抗原～抗 体～生物素化二抗～ SABC复合物。最后用 底物显色剂显色。 ➢特点：该法具有灵敏度高以及低背景染色 等特点。
4. 直接酶标二抗法
➢该法是将HRP/AP酶分子直接标记于二抗 上。因此需要普通的酶标二抗即可完成。实 验简单，成本低，但是因为没有信号放大作 用，所以对很多表达丰度不是很高的抗原就 可能检测不到。
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
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IHC常用酶标二抗原理示意图
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析