AKP Km值测定
实验一底物浓度对酶促反应的影响
实验一 底物浓度对酶促反应的影响
一、实验目的
掌握底物浓度对酶活性的影响，了解碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AKP ）的Km 值的测定原理和方法，理解Km 值的意义。
二、实验原理
在温度、pH 及酶浓度等恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。当底物浓度较低时，酶促反应速度V 随底物浓度[S]的增高而显着加快，随着底物浓度渐高，反应速度加快程度渐小，当底物浓度增加到一定程度以上时，再增高底物浓度，反应速度亦不再增加，成为该条件下极限最大反应速度Vmax 。底物浓度与反应速度的这种关系可以用下列米－曼（Michaclis-Menten ）氏方程式表示。
V=
][]
max [S Km S V 或Km=[S](V
V max — 1)
式中，Km 为米氏常数。当V=Vmax/2时，则Km=[S]，即米氏常数是反应速度等于最大
速度一半时底物物浓度的数值。如图所示：
Km
[S]
图1 底物浓度与酶促反应速度的关系
Km 是酶的特征性常数，不同酶的Km 值不同，同一酶作用于不同底物的Km 值亦不同。大多数纯酶的Km 值在～100mmol/L 之间。Km 值的测定在酶学研究中有重要的实际意义。 根据实验结果绘制上述直角双曲线，难以准确求出Km 和Vmax 值。而用米曼氏方程式的下列变换式，则容易求得Km 及Vmax 值。
米曼氏方程式中各项皆采用倒数表示，则成为Lineweaver —Burk 氏方程式：
V 1=max V Km ·][1S +max
1V 如图所示：
图2 Lineweaver —Burk 氏
碱性磷酸酶(AKP、ALP)的测定及医学意义
碱性磷酸酶（AKP、ALP）的测定及医学意义
1．正常参考值：
①速率法
女性：
1～12岁：＜500 U/L
15岁以上：40～150 U/L
男性：
1～12岁：＜500 U/L
12～15岁：＜750 U/L
25岁以上：40～150 U/L
②比色法：
健康成年人：3-13 金氏单位
儿童：5-28 金氏单位
2．临床意义
碱性磷酸酶活力测定常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床辅助诊断的指标。
血清碱性磷酸活力增高可见于下列疾病：
①肝胆疾病：阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸型肝炎、肝癌等。
②骨骼疾病：由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的碱性磷酸酶释放入
血液中，引起血清碱性磷酸酶活力增高。如纤维性骨炎、成骨不全症、佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复愈合期等
碱性磷酸酶km值的测定实验报告
碱性磷酸酶km值的测定实
验报告
篇一：碱性磷酸酶Km值得测定(1)
碱性磷酸酶Km值得测定
原理
在适宜条件下，酶促反应的初速度随底物浓度【S】增大而增大，当底物浓度达一定时则反应趋于稳定，反应速度最大。关系可用米氏方程表示Km是酶的特征性常数。将米氏方程变形为双倒数方程
对1/S作图可算出Km
步骤，以1/V
结果
由y=9.2961x+1.1465算出当y=0时x=-0.233，继而算出Km值=8.11mmol/L
讨论
计算出来的Km值与查资料所得到的值有一定的差距。
实验是粗测，本身存在实验误差，我们在操作过程中也造成误差，所以导致与实际值差距较大。
尿蛋白定性检测
原理
加热可以使蛋白质变性，溶液pH等于pI时溶解度最小。
步骤
1.取大试管一支，加入5ml澄清尿液。
2.用试管夹持试管上端，酒精灯加热尿液斜面至沸。
3.滴加5%乙酸2~3滴于尿液表面，轻轻混匀局部，加热。
结果
未加热部分是澄清，加热部分浑浊明显
讨论
正常尿液中不会出现浑浊，本实验尿液加入了蛋白质。尿液中如果出现沉淀则说明出现了病症。
分子筛层析（凝胶过滤法）
原理
多孔凝胶对不同大小分子的排阻效应，使不同分子分离。大分子先出，小分子后出。
步骤
1.取5~8滴4mg/ml蓝色葡萄聚糖液和4滴2mg/ml重铬酸钾液混匀。
2.将层析柱出水口打开，缓放柱内液体至凝胶柱表面加入
混匀的待层析液。
3.从上口缓加蒸馏水，成2~3cm高水柱，出水口用小试管接水。
4.在上口加洗脱液洗脱。每支小试管接1cm液体，并编号。
5.观察不同小试管的液体颜色的变化。
结果
讨论
分子筛层析能够大致的分离分子量不同的物质，但是分离的物质不纯有杂质，实验时间也相对较长，操作复杂。
碱性磷酸酶km值测定实验报告
碱性磷酸酶km值测定实验报告
篇一：酶促反应动力学实验报告 酶促反应动力学实验报告
14301050154 杨恩原
实验目的：
1. 观察底物浓度对酶促反应速度的影响
2. 观察抑制剂对酶促反应速度的影响
3. 掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值
实验原理：
一、底物浓度对酶促反应速度的影响
在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度随底物浓度[S]的增加而迅速增加，但当底物浓度继续增加
时，反应速度的增加率就比较小，当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一个极限值。底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示即：
式中Vmax为最大反应速度，Km 为米氏常数，[S]为底物浓度
当v=Vmax/2时，则Km=[S]，Km 是酶的特征性常数，测定Km是研究酶的一种重要方法。但是在一般情况下，根据实验结果绘制成的是直角双曲线，难以准确求得Km和Vmax。若将米氏方程变形为双倒数方程，则此方程为直角方程，即:
以1/V和1/[S]分别为横坐标和纵坐标。将各点连线，在横轴截
距为-1/Km，据此可算出Km值。 本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同浓度底物时的酶活性，再根据1/v和1/[S]的倒数作图，计算出其Km值。
二、抑制剂对酶促反映的影响
凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂。酶
的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[S]与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度Vmax。本实验选取Na2HPO4作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。实验步骤：
生物化学大实验-akp的浓度测定与活性检测
分析不同浓度和活性 水平下AKP的变化规 律
了解AKP在生物体内 的生理作用和影响因 素
实验背景
AKP（碱性磷酸酶）是一种广泛存在于 生物体内的酶，参与磷酸化反应，对生 物体的能量代谢、信号转导等方面具有
重要作用。
AKP的浓度和活性检测在医学、生物学、 目前，AKP的浓度和活性检测方法有多 农业等领域具有广泛的应用价值，如疾 种，其中常用的有化学比色法、荧光法、 病诊断、药物研发、植物生理研究等。 电化学法等。本实验将采用化学比色法
生物化学大实验-akp 的浓度测定与活性检 测
REPORTING
https://wenku.baidu.com
• 引言 • 实验原理 • 实验材料与设备 • 实验步骤与方法 • 实验结果与分析 • 结论与讨论 • 参考文献
目录
PART 01
引言
REPORTING
WENKU DESIGN
实验目的
AKP的活性检测原理
磷酸苯二钠法
利用AKP能够将磷酸苯二钠水解生成苯酚，通过比色法测定苯酚的生成量，从而判断AKP的活性。
荧光法
利用荧光物质标记磷酸根离子，当AKP催化磷酸化反应时，荧光物质释放出荧光，通过荧光强度判断 AKP的活性。
PART 03
实验材料与设备
REPORTING
WENKU DESIGN
AKP说明书
基质液(ml)
0. 5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
充分混匀,37℃水浴 15 分钟
显色剂(ml)
1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
立即混匀,在 520nm 处,1cm 光径,0 管调零,测各管 OD 值
以所测得的吸光度为纵坐标，以相应的标准浓度单位为横坐标，绘制标准曲线。
3、 单位公式：
碱性磷酸酶 (U / gprot )
测定管吸光度 = 标准管吸光度
标准管含酚的量 ×
(0.003mg )
÷ 取样量中的蛋白克数
4、 计算举例： 取 1%鸡肝组织匀浆 30μl进行AKP测定，测得各管吸光度为：测定管 0.081，标准管
0.194。同时测定该组织匀浆的蛋白含量为 1.29ⅹ10-3gprot/ml。测计算如下：
0.03
双蒸水(ml)
0.03
缓冲液(ml)
0.5
0.5
0.5
基质液(ml)
0.5
0.5
0.5
充分混匀 37℃水浴 15 分钟
显色剂(ml)
1.5
1.5
1.5
立即混匀，520nm，0.5cm 或者 1cm 光径比色，空白管调零，测各管吸光度。
2、 单位定义： 每克组织蛋白在 37℃与基质作用 15 分钟产生 1mg 酚为 1 单位。
Ⅲ—02碱性磷酸酶的分离纯化及鉴定
酶工程实验内容实验一碱性磷酸酶的分离纯化一、实验目的1.掌握酶分离纯化的一般步骤及相关原理2.悉碱性磷酸酶的分离纯化的方法步骤。二、实验原理本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶简称AKP。先用低浓度醋酸钠低渗破模作用制备肝匀浆。醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用。匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性释出膜中酶过滤后以去除杂蛋白。含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。根据AKP 在33的丙酮或30的乙醇中溶解而在50的丙酮或60的乙酸中不溶解的性质用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。三、仪器、原料与试剂仪器移液管、量筒、玻璃勺浆器管、剪刀、离心机、新华定性滤纸。原料新鲜兔肝试剂 1. 0.5mol/L 醋酸镁溶液107.25g 醋酸镁溶于蒸馏水中定容至1000 m1。 2. 0.1mol/L 醋酸钠溶液8.2g 醋酸钠溶于蒸馏水中定容至1000 m1 3. 0.0lmol/L 醋酸镁一0.01mol/L 酸酸钠
溶液准确吸取20mL 0.5mol/L 醋酸镁溶液及100mL0.14mol/L 醋酸钠溶液混匀后定容至1000 m1。4. Tris—HCl pH8.8缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷12.1g用蒸馏水溶解后定容至1000mL即为0.1mol/LTrls 溶液。取100m10.1mol/LTrls 溶液加蒸馏水约780mL再加0.1mol/L 醋酸镁溶液100m1混匀后用1冰醋酸调pH 为8.8用蒸馏水定容至l000m1。 5. 正丁醇、丙酮、95乙醇均为分析纯试剂。四、实验操作分离纯化碱性磷酸酶的操作流程如下以下操作均在0-4℃进行将分离提取的碱性磷酸分装成2ml瓶冰冻干燥保存或液体保存也可但均置于-60℃低温冰箱保存。应用时稀释5—7倍测其Km值。实验二碱性磷酸酶的动力学鉴定——Km测定一、原理当温度、PH及酶浓度恒定的条件下酶促反应的初速度随作用物浓度S增大而增大但增大到一定限度时作用物浓度再增加则反应速度不再增加。此时反应速度为最大速度Vmax。Michaelis Menten对酶促反应速度与作用物浓度之间的这种关系进行了大量实验研
碱性蛋白酶(AKP)活性检测试剂盒说明书 可见分光光度法
碱性蛋白酶（AKP）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法
注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。
货号：BC2300
规格：50T/24S
产品内容：
提取液：液体35mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加10mL蒸馏水溶解。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入10mL提取液，沸水浴中磁力搅拌溶解。
试剂三：液体50ml×1瓶，4℃保存。
试剂四：液体10mL×1瓶，4℃保存。
标准品：液体1mL×1支，0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液，4℃保存。
产品说明：
AKP是指在碱性条件下催化蛋白质肽键水解的酶类，属于丝氨酸蛋白酶。此外，该酶还能够水解酯键、酰胺键，具有转酯及转肽的功能。该酶是主要工业用酶之一，广泛应用于制药、丝绸、食品、制革等行业。
在碱性条件下，AKP水解酪蛋白生成酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸生成钨蓝；钨蓝在680nm 有特征吸收峰，测定680nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。
试验所需自备的仪器和用品：
研钵、台式离心机、可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1.5mL EP管、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
操作步骤：
一、粗酶液提取：
称取约0.1g组织，加入1mL提取液，冰上充分研磨，10000rpm4℃离心10min，取上清液，即粗酶液，置冰上待测。或直接称取0.1g酶制品，加入1mL提取液，置冰上待测。
二、测定：
1.分光光度计预热30min以上，调节波长到680nm，蒸馏水调零。
2.试剂一、试剂二和试剂三置于40℃水浴保温30min以上。
km和kcat测定方法
km和kcat测定方法
km和kcat是生物化学中常用的两个参数，用于评估酶的催化效率和底物亲和力。本文将介绍km和kcat的测定方法，以及它们在酶学研究中的应用。
一、km的测定方法
km是酶与底物之间的亲和力常数，表示酶对底物的结合能力。常用的测定km的方法有线性回归法、双倒数法和Eadie-Hofstee法等。
1. 线性回归法
线性回归法是最常见的测定km的方法之一。该方法通过测定不同底物浓度下反应速率的变化，绘制底物浓度与反应速率的曲线，然后利用线性回归分析求得km的值。
2. 双倒数法
双倒数法也是常用的测定km的方法。该方法通过将反应速率的倒数与底物浓度的倒数绘制成直线，然后根据直线的斜率和截距计算得到km的值。
3. Eadie-Hofstee法
Eadie-Hofstee法是一种图形法，通过绘制反应速率与反应速率除以底物浓度的曲线，然后通过线性回归分析获得km的值。
二、kcat的测定方法
kcat是酶的催化效率常数，表示酶每秒钟催化的底物分子数。常用的测定kcat的方法有比色法、荧光法和质谱法等。
1. 比色法
比色法是测定kcat的常用方法之一。该方法通过测定酶催化反应产生的产物的吸光度变化来计算kcat的值。
2. 荧光法
荧光法是一种灵敏、准确的测定kcat的方法。该方法通过添加荧光标记的底物或产物，测定荧光强度的变化来计算kcat的值。
3. 质谱法
质谱法是一种高灵敏度的测定kcat的方法。该方法通过质谱分析酶催化反应产生的产物，计算kcat的值。
三、km和kcat的应用
km和kcat作为酶学研究中的重要参数，在许多领域有着广泛的应用。
测定km值的方法
测定km值的方法
KM值（也称为Michaelis-Menten常数）是指在酶催化反应中衡量酶与底物结合紧密程度的常数。它是酶底物相互作用的一个重要参数，也是评价酶的亲和性和活性的重要指标之一。测定KM值对于了解酶的特性以及酶催化机理具有重要意义，因此有很多方法能够用来测定KM值，下面将介绍几种常用的方法。
首先，最常见的测定KM值的方法之一是通过酶动力学实验。在酶动力学实验中，我们可以通过测定不同底物浓度下酶的催化速率来计算KM值。通过将底物的浓度逐渐增加，然后测定不同浓度下的酶催化速率，然后根据Michaelis-Menten方程进行拟合，就可以得到KM值。这种方法简单易行，可以在实验室中进行。
其次，还可以利用双底物试验来测定KM值。在双底物试验中，我们通过在反应体系中同时加入两种底物，然后测定酶的催化速率随着两种底物的浓度变化而变化。根据双底物试验得到的实验数据，可以利用特定的方程和算法计算出KM 值。这种方法适用于那些对底物相互作用行为感兴趣的研究者。
另外，还可以利用工程学方法来测定KM值。工程学方法主要是通过对酶的结构和功能进行分子模拟和计算来预测酶的KM值。这种方法适合于那些缺乏实验条件或者需要快速筛选大量酶的研究者。
此外，还可以利用进化学方法来测定KM值。进化学方法是通过构建和筛选突
变库来获得具有不同KM值的酶变体，然后通过比较不同变体的KM值来揭示影响KM值的关键位点和基团。这种方法适合于那些想要了解酶中不同位点对KM值的影响的研究者。
最后，还可以利用光谱学方法来测定KM值。光谱学方法是通过利用酶与底物结合产生的光谱变化来测定KM值。这种方法适合于那些想要在不破坏酶的自然状态下测定KM值的研究者。
碱性磷酸酶Km值的
碱性磷酸酶Km值的测定
影响 酶促反应的因素
底物浓度
酶浓度
pH
温度
激活剂
抑制剂
※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。
底物浓度对反应速率影响
在其他因素不变 的情况下，底物浓度 对反应速率的影响呈 矩形双曲线关系。
V
[S]
Ｖ＝ ── K + [S]
m
Vmax[S]
[S]：底物浓度 V：不同[S]时的反应初速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)
9:02:00
9:02:30
9:03:00
9:15:00
9:15:30
9:16:00
9:16:30
9:17:00
9:17:30
9:18:00
保证每个试管的反应时间为15分钟
实验报告
• 1 绘制矩形双曲线图 • 2 绘制双倒数图，并通过双倒数图读出碱 性磷酸酶对磷酸本二钠的Km值
注意事项
• 1 做如下表格
Km值
① Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时
酶促反应动力学实验
ml要依次加入，充分混匀，放置10分钟，放置时 间不可过长。
18
16
❖ 酶活性计算及Km值求取
1、在37°C下保温15分钟产生1mg酚为1个酶活性单位，从标准曲线查出释放的 酚量（ug），以此计算处各管的酶活性（v）。
2、以1/v为纵坐标、1/S为横坐标，在坐标纸上作图，求出酶的Km值，并判断该 抑制剂属于何种类型。
Km＝？ 该抑制剂为？
17
注意事项：
❖ 配制的各种试剂及反应液必须混匀。 ❖ 加酶液要准确快速，以保证各管酶促反应同时开
碱性条件 K3Fe（CN）6
醌衍生物（红色）
3
一、pH对酶促反应速度的影响 ❖ 碱性磷酸酶（AKP）的最适pH值是10。
二、温度对酶促反应速度的影响 ❖ 碱性磷酸酶（AKP）的最适温度是37℃。
4
三、底物浓度对酶促反应速度的影响 ——碱性磷酸酶米氏常数的测定
米-曼氏（Michaelis-Menten）
pH10碳酸钠缓 0 10/16 10/14 10/12 10/10 10/8 10/6 10/4 10/2 冲液（ml）
加入酶液后立即计时，各管混匀后在37 ℃准确保温15分钟。 3、保温结束，立即加入0.5mol/L NaOH 1.0 ml 以中止反应。 4、各管分别加入0.3% 4-氨基安替比林1.0 ml及0.5％ 铁氰化钾 2.0 ml， 充分混匀，放置10分钟，以管1为对照，于波长510 nm处比色。
碱性磷酸酶km值的测定实验报告
碱性磷酸酶Km值的测定实验报告
引言
碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, ALP）是一种常见的酶类，广泛存在于生物体内。测定其底物浓度与酶反应速率之间的关系可以得到酶的Km值，Km值是酶
对底物的亲和力的指标。本实验旨在通过逐渐增加底物浓度，测定酶反应速率的变化，并通过绘制酶反应速率与底物浓度的曲线来确定碱性磷酸酶的Km值。
材料与方法
材料
•碱性磷酸酶溶液
•5% Na2CO3溶液
•磷酸盐缓冲液（pH 10.0）
•对硝基酚磷酸盐（PNPP）底物溶液
方法
1.准备一系列不同浓度的PNPP底物溶液，如0.01 mM、0.02 mM、
0.03 mM等。确保每个浓度的底物溶液均经过严格配制和标定。
2.在试管中分别取一定体积的磷酸盐缓冲液（pH 10.0）、Na2CO3溶
液、碱性磷酸酶溶液和不同浓度的PNPP底物溶液，使得试管中各组分的最终浓度符合实验设计的要求。
3.将试管放置在恒温水浴中，保持温度在37°C。
4.开始计时后，每隔一定时间（如30秒）取出一个试管，加入适量的
5% Na2CO3溶液停止反应。
5.使用分光光度计测定反应液中产生的黄色对硝基酚的吸光度，记录每
个试管的吸光度数值。
6.通过绘制吸光度与反应时间的曲线，确定酶反应速率的变化。
结果与讨论
根据实验所得数据，我们可以绘制酶反应速率与底物浓度的曲线。理论上，当
底物浓度较低时，酶反应速率随着底物浓度的增加呈现线性增加的趋势。而当底物浓度达到一定水平时，酶反应速率趋于饱和，不再随着底物浓度的增加而增加。通过观察曲线的斜率，我们可以确定酶的Km值，即底物浓度达到一半时的反应速率。
碱性磷酸酶km实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除碱性磷酸酶km实验报告
篇一：碱性磷酸酶Km值得测定(1)
碱性磷酸酶Km值得测定
原理
在适宜条件下，酶促反应的初速度随底物浓度【s】增大而增大，当底物浓度达一定时则反应趋于稳定，反应速度最大。关系可用米氏方程表示Km是酶的特征性常数。将米氏方程变形为双倒数方程
对1/s作图可算出Km
步骤，以1/V
结果
由y=9.2961x+1.1465算出当y=0时x=-0.233，继而算出Km值=8.11mmol/L
讨论
计算出来的Km值与查资料所得到的值有一定的差距。
实验是粗测，本身存在实验误差，我们在操作过程中也造成误差，所以导致与实际值差距较大。
尿蛋白定性检测
原理
加热可以使蛋白质变性，溶液ph等于pI时溶解度最小。
步骤
1.取大试管一支，加入5ml澄清尿液。
2.用试管夹持试管上端，酒精灯加热尿液斜面至沸。(:碱性磷酸酶km实验报告)
3.滴加5%乙酸2~3滴于尿液表面，轻轻混匀局部，加热。
结果
未加热部分是澄清，加热部分浑浊明显
讨论
正常尿液中不会出现浑浊，本实验尿液加入了蛋白质。尿液中如果出现沉淀则说明出现了病症。
分子筛层析（凝胶过滤法）
原理
多孔凝胶对不同大小分子的排阻效应，使不同分子分离。大分子先出，小分子后出。
步骤
1.取5~8滴4mg/ml蓝色葡萄聚糖液和4滴2mg/ml重铬酸钾液混匀。
2.将层析柱出水口打开，缓放柱内液体至凝胶柱表面加入混匀的待层析液。
3.从上口缓加蒸馏水，成2~3cm高水柱，出水口用小试管接水。
4.在上口加洗脱液洗脱。每支小试管接1cm液体，并编号。
5.观察不同小试管的液体颜色的变化。
生化实验课件：Km值测定
试剂（mL） 0 1 2 3 4 5 6 7 0.02 mol/L基质液 0 0.05 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
碳酸盐缓冲液
0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8
蒸馏水
1.1 1.05 1.0 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1
混匀置入37 ℃ 保温 5 分钟
血清
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
混匀并立即计算时间，在37 ℃ 保温 15 分钟,15分钟后立即加碱性 溶液终止反应 (从第6管开始)
碱性溶液
1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1
立即混匀
4-氨基安替比林 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
铁氰化钾
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
混匀
1234567 A 1/A
[S] (mmol/L) 0.5 1 2 4 6 8 10
1/[S]
2 1 0.5 0.25 0.167 0.125 0.1
碱性磷酸酶 AKP(Alkaline phosphatase)Km 值的测定
原理： 在其他因素不变的情况下，底物浓度对
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
VMAX
1/2VMAX
1/Vmax
1/[s]
[S] Km
-1/Km
底物浓度与反应速度关系曲线
双倒数曲线
【实验讨论】
比较两个值的大小,分析实验误差产生 的原因 比较两种Km测定方法各自的优缺点
【实验操作】
1 2 3 4 5 6 7 管号 底物液 0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80
(0.04M) 碳酸缓 液(pH=10)
8 0.00
0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.95 0.85 0.75 0.70 0.60
0.90 0.90 0.40 0.20
Vmax•[S]
V=
Km + [S]
其中Km为米氏常数， Vmax为最大反应速度， 当V=Vmax/2时，则Km=[s]。 Km是酶的特征常数，测定Km是研究酶 的一种方法
将米氏方程变形为双倒数方程，以l/ v －1／[s]作图，将各点连线，在横轴截 距为-／km，据此可算出Km值。
1/V=Km/
Vmax•[S] + 1/ Vmax
本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其 底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨 基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌 的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。 其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O AKP OH苯酚
苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物 （红色）
1
3
5
6
8
12
16
0
1/[S]
1/OD
1
0.333 0.200
0.167 0.125 0.083 0.063
-
2、作图
以 [s]为横轴，OD510为纵横作图，观 察曲线形状；查Km 值
以1／［s]为横轴，1／OD510为纵轴作 图，观察曲线形状；查Km 值 比较两个值的差异.
OD510
1/OD510
碱性磷酸酶Km值 的测定
【实验目的】
1.了解酶的Km值测定原理和方法
2.掌握碱性磷酸酶（AKP）活性测
定的原理和方法
【实验原理】
在温度，PH及酶浓度恒定的条件下，酶促 反应的初速度随底物浓度（S）增大而增加， 但当底物浓度增大到一定极限时，则反应 速度趋于恒定，此最大反应速度Vmax，反 应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方 程来表示，即：
1.0
1.0
1.0 1.0
1.0 1.0
1.0
1.0
4-氨基安 替比林
1.0 1.0
铁氰化钾
2.0 2.0
2.0
2.0
பைடு நூலகம்2.0
2.0 2.0
2.0
混匀，室温放置10分钟左右, 以8号管为 空白，于5l0nm比色，记录各管的光密度
【实验结果】
1、原始数据
结果记录 OD 1 2 3 4 5 6 7 8
底物浓度 mmol/L
0.90 1.00
蒸馏水
混匀后37℃水浴，预温5分钟左右
酶液
0.1 0.1
0.1
0.1
0.1
0.1 0.1
0.1
加入酶液后立即混匀（保持37℃水浴）， 反应开始。
从加入酶液起计时至下一步 加入碱性 溶液停止反应，各管反应时间应准确一 致，为15分钟。
碱性溶液
1.0 1.0
1.0 1.0
1.0
1.0