AKP Km值测定

实验一底物浓度对酶促反应的影响

实验一底物浓度对酶促反应的影响一、实验目的掌握底物浓度对酶活性的影响，了解碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AKP ）的Km 值的测定原理和方法，理解Km 值的意义。

二、实验原理在温度、pH 及酶浓度等恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。

当底物浓度较低时，酶促反应速度V 随底物浓度[S]的增高而显著加快，随着底物浓度渐高，反应速度加快程度渐小，当底物浓度增加到一定程度以上时，再增高底物浓度，反应速度亦不再增加，成为该条件下极限最大反应速度Vmax 。

底物浓度与反应速度的这种关系可以用下列米－曼（Michaclis-Menten ）氏方程式表示。

V=][]max [S Km S V 或Km=[S](VV max — 1)式中，Km 为米氏常数。

当V=Vmax/2时，则Km=[S]，即米氏常数是反应速度等于最大速度一半时底物物浓度的数值。

如图所示：Km[S]图1 底物浓度与酶促反应速度的关系Km 是酶的特征性常数，不同酶的Km 值不同，同一酶作用于不同底物的Km 值亦不同。

大多数纯酶的Km 值在～100mmol/L 之间。

Km 值的测定在酶学研究中有重要的实际意义。

根据实验结果绘制上述直角双曲线，难以准确求出Km 和Vmax 值。

而用米曼氏方程式的下列变换式，则容易求得Km 及Vmax 值。

米曼氏方程式中各项皆采用倒数表示，则成为Lineweaver —Burk 氏方程式：V 1=max V Km ·][1S +max1V 如图所示：图2 Lineweaver —Burk 氏法作图求Km 值这是个上截式直线方程式。

V 1与S1为直线关系，如上图。

直线斜率为max V Km ，纵轴截距为max 1V ，横轴截距为－Km 1.据此可以测定不同浓度底物的反应速度，按V 1与S1关系作图而容易正确得出Km 值。

另有其他变换式，例如把上式两侧皆乘以[S]，则转换成Wilkinson 氏方程式。

生物化学大实验-akp的浓度测定与活性检测

性。
用于制备样品和分离细胞或组织中的不同组分。
用于保持反应温度恒定。
用于精确移取一定量的样品和试剂。
PART 04
实验步骤与方法
REPORTING
WENKU DESIGN
AKP的浓度测定步骤与方法
准备试剂和设备
01
根据实验要求准备所需的试剂和设备，如AKP标准品、酶标仪、
酶标板等。
配置标准品溶液
改进建议
为了更准确地测定AKP的浓度和活性，建议采取以下措施：首先，确保试剂的纯度，避免使用含有杂质或污染物的试剂；其次，严格控制实验条件，如温度、pH值等，确保实验条件的一致性和准确性；最后，采用更先进的检测方法和技术，如色谱法、质谱法等，以提高实验结果的准确性和可靠性。
PART 07
参考文献
数据处理
根据标准品溶液的浓度和光密度值绘制标准曲线，并计算待
测样本中AKP的浓度。
AKP的活性检测步骤与方法
准备试剂和设备
01 根据实验要求准备所需的试剂
和设备，如底物、终止液、分光光度计等。
配置反应体系
02 将底物溶解在适当的缓冲液中
，加入待测样本，设置空白对照。
启动反应
03 将反应体系在恒温条件下孵育
进行AKP的浓度和活性检测。
PART 02
实验原理
REPORTING
WENKU DESIGN
AKP的浓度测定原理
酶联免疫吸附法（ELISA）
利用抗原与抗体的特异性结合，通过酶与底物反应的显色反应，测定AKP的浓度。
分光光度法
利用特定波长下的吸光度值与AKP浓度的线性关系，通过测定吸光度值计算 AKP的浓度。
掌握AKP的浓度测定与活性检测方法

碱性磷酸酶(AKP、ALP)的测定及医学意义

碱性磷酸酶（AKP、ALP）的测定及医学意义
1．正常参考值：
①速率法
女性：
1～12岁：＜500 U/L
15岁以上：40～150 U/L
男性：
1～12岁：＜500 U/L
12～15岁：＜750 U/L
25岁以上：40～150 U/L
②比色法：
健康成年人：3-13 金氏单位
儿童：5-28 金氏单位
2．临床意义
碱性磷酸酶活力测定常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床辅助诊断的指标。

血清碱性磷酸活力增高可见于下列疾病：
①肝胆疾病：阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸型肝炎、肝癌等。

②骨骼疾病：由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的碱性磷酸酶释放入
血液中，引起血清碱性磷酸酶活力增高。

如纤维性骨炎、成骨不全症、佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复愈合期等。

碱性磷酸酶km值测定实验报告

竭诚为您提供优质文档/双击可除碱性磷酸酶km值测定实验报告篇一：酶促反应动力学实验报告酶促反应动力学实验报告14301050154杨恩原实验目的：1.观察底物浓度对酶促反应速度的影响2.观察抑制剂对酶促反应速度的影响3.掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值实验原理：一、底物浓度对酶促反应速度的影响在温度、ph及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。

在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度(v)随底物浓度[s]的增加而迅速增加，但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加率就比较小，当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一个极限值(即最大速度Vmax)。

底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示(michaelis-menten方程)即：式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[s]为底物浓度当v=Vmax/2时，则Km=[s]，Km是酶的特征性常数，测定Km是研究酶的一种重要方法。

但是在一般情况下，根据实验结果绘制成的是直角双曲线，难以准确求得Km和Vmax。

若将米氏方程变形为双倒数方程(Lineweaver-burk方程)，则此方程为直角方程，即:以1/V和1/[s]分别为横坐标和纵坐标。

将各点连线，在横轴截距为-1/Km，据此可算出Km值。

本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同浓度底物时的酶活性，再根据1/v和1/[s]的倒数作图，计算出其Km值。

二、抑制剂对酶促反映的影响凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂。

酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。

可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。

竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。

非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[s]与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度Vmax。

本实验选取na2hpo4作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。

《生物化学与分子生物学》教学大纲

《生物化学与分子生物学》教学大纲课程名称（中文/英文）：生物化学与分子生物学/Biochemistry and Molecular Biology课程类别：专业基础课程课程性质：必修适用专业：临床医学、基础医学、口腔医学、麻醉学、预防医学、医学检验技术、医学实验技术学时数：总学时84学时，其中理论72学时、实验12学时学分数： 4.5学分考核方式：考试先修课程：《人体解剖学》、《组织学与胚胎学》、《医学细胞生物学》、《医学遗传学》、《基础化学》、《有机化学》后续课程：《生理学》、《药理学》、《病理生理学》、《医学免疫学》、《医学微生物学》教材：《生物化学与分子生物学（第9版）》，周春燕、药立波主编，人民卫生出版社，2018年8月参考书：《生物化学原理（第3版）》，杨荣武主编，高等教育出版社，2018年10月《分子生物学（第2版）》，杨荣武主编，南京大学出版社，2017年9月《生物化学（第4版）》，朱圣庚、徐长法主编，高等教育出版社，2017年1月《Lehninger Principles of Biochemistry（Seventh Edition）》, David L. Nelson, Michael. Cox. W. H. Freeman and Company, 2017.《Harper's Illustrated Biochemistry （31st, Edition）》,Victor W. Rodwell. McGraw-Hill Education Medical, 2018.开课单位：基础医学院生物化学与分子生物学教研室一、课程简介：（150～500字，宋体、加粗、小四、段前段后各0.5行）《生物化学与分子生物学》是一门临床医学、基础医学、口腔医学、麻醉学、预防医学、医学检验技术、医学实验技术等专业的专业必修课程。

课程内容包括生物大分子的结构与功能、物质代谢及其调节、遗传信息的传递、医学生化专题和医学分子生物学专题等。

测定km值的方法

测定km值的方法KM值（也称为Michaelis-Menten常数）是指在酶催化反应中衡量酶与底物结合紧密程度的常数。

它是酶底物相互作用的一个重要参数，也是评价酶的亲和性和活性的重要指标之一。

测定KM值对于了解酶的特性以及酶催化机理具有重要意义，因此有很多方法能够用来测定KM值，下面将介绍几种常用的方法。

首先，最常见的测定KM值的方法之一是通过酶动力学实验。

在酶动力学实验中，我们可以通过测定不同底物浓度下酶的催化速率来计算KM值。

通过将底物的浓度逐渐增加，然后测定不同浓度下的酶催化速率，然后根据Michaelis-Menten方程进行拟合，就可以得到KM值。

这种方法简单易行，可以在实验室中进行。

其次，还可以利用双底物试验来测定KM值。

在双底物试验中，我们通过在反应体系中同时加入两种底物，然后测定酶的催化速率随着两种底物的浓度变化而变化。

根据双底物试验得到的实验数据，可以利用特定的方程和算法计算出KM 值。

这种方法适用于那些对底物相互作用行为感兴趣的研究者。

另外，还可以利用工程学方法来测定KM值。

工程学方法主要是通过对酶的结构和功能进行分子模拟和计算来预测酶的KM值。

这种方法适合于那些缺乏实验条件或者需要快速筛选大量酶的研究者。

此外，还可以利用进化学方法来测定KM值。

进化学方法是通过构建和筛选突变库来获得具有不同KM值的酶变体，然后通过比较不同变体的KM值来揭示影响KM值的关键位点和基团。

这种方法适合于那些想要了解酶中不同位点对KM值的影响的研究者。

最后，还可以利用光谱学方法来测定KM值。

光谱学方法是通过利用酶与底物结合产生的光谱变化来测定KM值。

这种方法适合于那些想要在不破坏酶的自然状态下测定KM值的研究者。

总的来说，测定KM值的方法有很多种，每种方法都有其独特的优势和局限性。

选择适合的方法取决于研究者研究的具体问题和实验条件。

希望以上介绍的几种方法能够帮助研究者更好地测定KM值，从而深入了解酶的特性和酶催化机理。

碱性磷酸酶Km值的

底物浓度对反应速率影响
在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速率的影响呈矩形双曲线关系。
V
[S]
Ｖ＝ ── K + [S]
m
Vmax[S]
[S]：底物浓度 V：不同[S]时的反应初速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)
双倒数作图法
Vmax[S]
V=
Km+[S]
两边同取倒数
Km 1/V= + 1/Vmax 1/[S] Vmax （林－贝氏方程）
注意事项
• 1 底物和酶取样准确 • 2 保温时间准确
1 2 3 4 5 6 7
加入酶的时间
加入碱性溶液终止反应的时间
9:00:00
9:00:30
9:01:00
9:01:30
9:02:00
9:0230
9:16:00
9:16:30
9:17:00
9:17:30
9:18:00
保证每个试管的反应时间为15分钟
实验报告
• 1 绘制矩形双曲线图 • 2 绘制双倒数图，并通过双倒数图读出碱性磷酸酶对磷酸本二钠的Km值
注意事项
• 1 做如下表格
1 Abs [S] 1/ABS 1/[S] • 2 可电脑作图 • 3 若人工作图，在坐标轴上禁止出现分数(1/2,1/16) • 4 实验的最终目的是测得Km值，因此实验报告最终必须得出结论：Km值等于多少 2 3 4 5 6 7
第三节碱性磷酸酶km值的测定碱性磷酸酶?碱性磷酸酶简称alp或akp是广泛分布于人体肝脏骨骼肠肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶碱性磷酸酶主要用于阻塞性黄疸原发性肝癌继发性肝癌胆汁淤积性肝炎等的检查

酵母菌碱性磷酸酶的分离及部分性质研究_张晓龙

酵母菌碱性磷酸酶的分离及部分性质研究张晓龙秦　阳（安徽科技学院，安徽凤阳　２３３１００）摘要：　提取酵母菌中的碱性磷酸酶，并对其性质做出分析。

结果显示酶促反应最适ｐＨ值为１０．３，初速度Ｖ０＝０．０１３６７μｍｏｌ／Ｌ・ｍｉｎ，以对硝基苯磷酸二钠（ｐＮＰＰ）为底物测得Ｋｍ＝０．５３５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｖｍ＝０．０１４２９μｍｏｌ／Ｌ。

较低浓度的Ｍｇ２＋对酶有较强的促进作用，２ｍｍｏｌ／Ｌ时达到６４１％，磷酸氢二钠对碱性磷酸酶有竞争性抑制作用。

关键词：　酵母菌；碱性磷酸酶；酶的性质；酶促反应中图分类号Ｑ５５６文献标识码Ｂ文章编号１００７－７７３１（２００８）０８－０９３－０３作者简介：张晓龙（１９７９～），男，安徽蚌埠人，在读研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。

收稿日期：２００８－０４－１４ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｆｒｏｍｙｅａｓｔＺｈａｎｇ　ＸｉａｏｌｏｎｇＱｉｎ　Ｙａｎｇ（Ａｎｈｕｉ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｆｅｎｇｙａｎｇ　２３３１００）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｗａｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｆｒｏｍ　ｙｅａｓｔ　ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｄｕｓｔｙ　ｙｅａｓｔａｎｄ　ｔｈｅ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｐＨ　ｗａｓ　１０．３　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｌｙ－ｓｉｓ　ｏｆ　ｐＮＰＰ．　Ｔｈｅ　ｉｎｉｔｉａｌ　ｖｅｌｏｃｉｔｙ　ｉｓ　０．０１３６７μｍｏｌ／Ｌ・ｍｉｎ．　Ｔｈｅ　Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ　ｃｏｎｓｔａｎｔ　（Ｋｍ）　ｉｓ　０．５３５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ａｎｄｔｈｅ　ｍａｘｉｍｕｎ　ｖｅｌｏｃｉｔｙ　（Ｖｍ）　ｉｓ　０．０１４２９μｍｏｌ／Ｌ　ａｔ　ｐＨ１０．１　ａｎｄ　３７℃．　Ｔｈｅ　Ｍｇ２＋　ｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　２ｍｍｏｌ／Ｌｃｏｕｌｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｂｙ　５４１％，　ｉｍｐｌｙｉｎｇ　ｔｈａｔ　ｌｏｗ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｇ２＋　ｃｏｕｌｄ　ｅｎｈａｎｃｅ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅｅｎｚｙｍｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．　Ｎａ２ＨＰＯ４　ｃｏｕｌｄ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｏｆ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｔｙｐｅ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｙｅａｓｔ；　Ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；　Ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ；Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｒｅａｃｔｉｏｎ碱性磷酸酶（ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，简称ＡＫＰ）广泛存在于动物、植物及微生物的体内，是一种对底物专一性较低的磷酸单酯水解酶。

Km值测定

V Vmax Vmax/2 Km
因为实验条件下，底物浓度很难使酶达到饱和，
实测Vmax 是个近似值，
因而Vmax/2 不精确。此外的关系呈双曲线，实验数
据要求较多，且不易绘制。
[S]
故此法少用。
②双倒数作图法(double reciprocal plot)，又称为林-贝氏(Lineweaver- Burk)作图法
0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8
1.1 1.05 1.0 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1
混匀置入37 ℃ 保温 5 分钟
0.1
0.1
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
混匀并立即计算时间，在37 ℃ 保温 15 分钟,15分钟后即加碱性溶液终止反应 (从第7管开始)
碱性磷酸酶 AKP(Alkaline phosphatase)Km 值的测定
原理：在其他因素不变的情况下，底物浓度对
反应速度的影响呈矩形双曲线关系。 V Vmax Vmax/2 Km
Ｖ＝ ── K + [S]
m
Vmax[S]
[S]
① 双曲线作图法：即根据米-曼氏方程，以v 对[s]作图，Vmax/2 时 [s]即为Km，以摩尔浓度表示。
碱性
K2Fe(CN)6
红色醌衍生物颜色深浅与酚含量成正比,从而可知酶活性的高低。以底物浓度
的倒数为横坐标，以各管光密度的倒数为纵坐标作图求出Km值。
试剂（mL） 0.02 mol/L基质液
碳酸盐缓冲液蒸馏水血清
0 0
0.8
1 2 3 4 5 6 7 0.05 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
碱性溶液 4-氨基安替比林铁氰化钾

(动物来源)碱性磷酸酶提取与性质研究

蛋白进行分离鉴定）（1）安装双垂直板电泳槽；（2）配12%的分离胶5 mL，浓缩胶3 mL；（3）制样：取样品20 µL与样品缓冲液10 µL混合，100 ℃
加热5分钟；（4）上样：用微量注射器加样15-20 µL （5）电泳：在凝胶上加40 V/cm电压，待染料进入分离胶
后将电压提高到140 V/cm继续电泳直到染料到达底部；（6）固定和染色：用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡，加热
（动物来源）碱性磷酸酶的提取及性质研究
主要内容
课题研究现状研究方案实验器材及试剂配置方法
课题研究现状
碱性磷酸酶(简称ALP或AKP) 是一种底物专一性较低的磷酸单酯酶，广泛存在于植物、动物和微生物体内，是一种重要的调控酶，在生物体内直接参与了磷酸基团的转移和代谢过程。
目前，国内外学者对 ALP 进行了广泛的研究，包括不同物种 ALP 的结构、催化反应机理、理化性质、分离纯化、功能基团、检测方法等。
碱性磷酸酶的分离纯化
④在B液中加95%的冷乙醇，使乙醇最终浓度达到30%，混匀后立即离心5min，量取上清液，倒入另一干燥洁净的刻度离心管2中，记录溶液体积，弃去沉淀。 ⑤在离心管2中加入冷95%的乙醇，使乙醇最终浓度达到60%，混匀后离心5min，弃去上清液，留下沉淀。 ⑥向沉淀中加入0.5mol/L醋酸镁溶液10mL，充分溶解，向沉淀中逐滴加入冷丙酮至丙酮的最终浓度达到33%，离心5min，取上清液，放入干燥洁净的离心管3中 ⑦向3中加冷丙酮，直至丙酮的最终浓度为60%，混匀后离心5min，弃去上清液，留下沉淀，该沉淀即为部分纯化的碱性磷酸酶。向沉淀中加入 PH8.8的Tris缓冲液10mL，使其溶解，称为C液。
几分钟；（7）脱色：半小时更换一次脱色液，处理3-5次，直到胶板

碱性磷酸酶km实验报告

竭诚为您提供优质文档/双击可除碱性磷酸酶km实验报告篇一：碱性磷酸酶Km值得测定(1)碱性磷酸酶Km值得测定原理在适宜条件下，酶促反应的初速度随底物浓度【s】增大而增大，当底物浓度达一定时则反应趋于稳定，反应速度最大。

关系可用米氏方程表示Km是酶的特征性常数。

将米氏方程变形为双倒数方程对1/s作图可算出Km步骤，以1/V结果由y=9.2961x+1.1465算出当y=0时x=-0.233，继而算出Km值=8.11mmol/L讨论计算出来的Km值与查资料所得到的值有一定的差距。

实验是粗测，本身存在实验误差，我们在操作过程中也造成误差，所以导致与实际值差距较大。

尿蛋白定性检测原理加热可以使蛋白质变性，溶液ph等于pI时溶解度最小。

步骤1.取大试管一支，加入5ml澄清尿液。

2.用试管夹持试管上端，酒精灯加热尿液斜面至沸。

(:碱性磷酸酶km实验报告)3.滴加5%乙酸2~3滴于尿液表面，轻轻混匀局部，加热。

结果未加热部分是澄清，加热部分浑浊明显讨论正常尿液中不会出现浑浊，本实验尿液加入了蛋白质。

尿液中如果出现沉淀则说明出现了病症。

分子筛层析（凝胶过滤法）原理多孔凝胶对不同大小分子的排阻效应，使不同分子分离。

大分子先出，小分子后出。

步骤1.取5~8滴4mg/ml蓝色葡萄聚糖液和4滴2mg/ml重铬酸钾液混匀。

2.将层析柱出水口打开，缓放柱内液体至凝胶柱表面加入混匀的待层析液。

3.从上口缓加蒸馏水，成2~3cm高水柱，出水口用小试管接水。

4.在上口加洗脱液洗脱。

每支小试管接1cm液体，并编号。

5.观察不同小试管的液体颜色的变化。

结果讨论分子筛层析能够大致的分离分子量不同的物质，但是分离的物质不纯有杂质，实验时间也相对较长，操作复杂。

篇二：实验名称碱性磷酸酶的分离纯化实验报告实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析实验日期20XX年10月25号实验地点生化实验室合作者指导老师总分教师签名批改日期碱性磷酸酶（AKp或ALp）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。

碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定(优选参考)

碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定一、实验原理(1).碱性磷酸酶的分离纯化1. 机械破碎法制备肝匀浆低浓度乙酸钠：低渗破膜低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加入不同有机溶剂重复离心正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP(2).比活性测定1.比活性的定义*单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。

*通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。

*用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一。

2.测定样品的比活性必须测定：*每毫升样品中的酶活性单位数。

*每毫升样品中的蛋白质毫克数。

3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理(3).米氏常数测定K m 即为米氏常数，V max为最大反应速度＊如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此,米氏常数的单位为mol/L。

当反应速度等于最大速度一半时,即V= 1/2 V max, K m = [S]＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。

以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km值。

二. 器材721分光光度计台式离心机恒温水浴锅微量移液器托盘天平匀浆器试管三. 试剂1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁5.3625g溶于蒸馏水中,稀释至50ml.2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.4. 丙酮(分析纯).5. 95%乙醇(分析纯).6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/L Tris液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2.2H2o) 0.3g,4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期; 临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可.8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取无水碳酸钠0.318g及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml.9. 碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.10. 0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏水中,溶解后两液混合均匀,再加蒸馏水至50ml,置棕色瓶中暗处保存.11. 0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.12. 酚标准液(0.1mg/ml).四.实验步骤(1). “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作。

《AKPKm值测定》课件

《AKPKm值测定》PPT课件
本PPT课件将详细介绍AKPKm值的意义和应用，包括测定方法、实验条件和样品处理方法等。探讨AKPKm值在抗氧化能力、食品保健及人类健康方面的关联，并展望其未来发展方向。
什么是AKPKm值
AKPKm值是一种用于衡量食品中抗氧化能力的指标。它反映了食品抗氧化物质对抗自由基的能力，是评估食品质量和食品保健功能的重要参数。
AKPKm值的测定方法简介
AKPKm值的测定方法包括化学测试和生物学测试两种。化学测试通过特定的实验步骤和仪器测量食品样品中的抗氧化能力；生物学测试则通过动物模型或体外细胞模型评估食品的抗氧化活性。
AKPKm值的实验条件
AKPKm值的测定需要在恒温、光照控制等条件下进行，以确保实验结果的准确性。实验室必须具备必要的设备和试剂，并严格遵守实验操作规范。
AKPKm值实验所需器材和试剂
器材
试管、移液管、加热器、pH计等
试剂
抗氧化物标准品、溶剂、显色剂等 NhomakorabeaAKPKm值测定步骤
1
添加试剂
2
将特定溶剂和标准品加入样品中
3
样品制备
对食品样品进行处理，如研磨、溶解等
反应与显色
根据实验方案，观察样品的反应和产生的显色变化
样品处理方法
为了准确测定AKPKm值，样品处理是非常关键的。常用的样品处理方法包括挥发性物质的去除、溶剂提取和固相萃取等。
AKPKm值的重要性
AKPKm值能够帮助我们评估食品的抗氧化能力，了解食品中的抗氧化物质对人体健康的重要影响，从而选择更健康、更具营养的食物。
AKPKm值的应用领域
AKPKm值被广泛应用于食品行业、医学研究和食品安全领域。它为我们评估食品质量、研究抗氧化物质的功能和探索食品对人类健康的影响提供了重要的依据。

实验二过氧化氢酶km值的测定

实验二过氧化氢酶km值的测定
过氧化氢酶（H2O2）是一种经典的多功能过氧化物。

它可以在氧化还原或化学反应中发挥作用。

因此，它在生物氧化解氧化反应中非常重要。

H2O2可以与其他过氧化物，包括氧原子和自由基，反应形成复杂的反应物组合。

这些反应控制着氧化脱氢反应，而过氧化氢酶（Km）是这种反应序列的关键步骤。

Km是H2O2和其他过氧化物之间氧化脱氢反应的活性位置，它表示H2O2在氧化脱氢反应中显示出其最大活性的浓度。

它是生物体氧化脱氢反应进行的重要指标，可以帮助我们了解这种反应的效率和机理。

测定Km值可以看出这个过程的氧化-脱氢速率，从而优化氧化脱氢反应的效率。

Km值的测定大致可以分为三个部分：进行反应的准备工作、进行该反应的实验操作和数据处理。

首先，用实验室内的设备准备反应液，其中应包括酶溶液、过氧化氢和反应基质。

其次，把反应液倒入试剂瓶，用磁力搅拌器搅拌均匀，使酶蛋白完全溶解。

然后，用光度仪测定溶液的响应时间，并确定反应停止的时间。

最后，对得到的数据进行分析，以确定Km值。

Km值测定是一个比较复杂的实验，需要实验室设备、当心操作和熟练的数据处理。

这些都是关键因素，控制着测定结果的准确性和可信度。

因此，在实验室中必须做好准备，并且试剂、实验仪器要有正确的温度、湿度和搅拌速度，以保证实验的准确性和可靠性。

此外，实验室人员还需要做好安全防护措施，以防止接触有毒物质，确保实验的安全性。

总之，测定H2O2的Km值是比较复杂的，需要安全准备、细心操作和合理数据分析，以获得准确、可靠的结果，为氧化解氧化反应提供参考。

km测定实验报告

km测定实验报告KM测定实验报告引言：KM测定是一种常用的酶动力学实验方法，用于测定酶的催化活性。

本实验旨在通过对酶催化反应速率的测定，探索KM值对酶活性的影响，并深入理解酶催化过程的基本原理。

实验材料与方法：1. 实验材料：- 酶溶液：选择一种适合的酶作为实验对象，如过氧化氢酶。

- 底物溶液：选择一种合适的底物，如过氧化氢。

- 缓冲液：根据实验需要选择适当的缓冲液，如磷酸盐缓冲液。

- 辅助试剂：如辅酶、金属离子等。

- 试剂盒：包括所需的试管、移液管、离心管等。

2. 实验方法：- 步骤一：制备酶溶液。

按照实验要求，将酶粉末溶解于适量的缓冲液中，制备所需浓度的酶溶液。

- 步骤二：制备底物溶液。

按照实验要求，将底物溶解于适量的缓冲液中，制备所需浓度的底物溶液。

- 步骤三：实验组设置。

根据实验要求，设置不同浓度的底物溶液，配制不同的实验组。

- 步骤四：开始实验。

将实验组中的底物溶液分别加入试管中，并在恒温条件下加入相应浓度的酶溶液，开始反应。

- 步骤五：反应停止。

根据实验要求，选择适当方法停止反应，如加入某种试剂或调整pH值。

- 步骤六：测定反应产物。

使用合适的测定方法，如分光光度法或比色法，测定反应产物的浓度。

- 步骤七：数据处理。

根据实验结果，计算不同实验组的反应速率，并绘制相关曲线。

实验结果与讨论：通过实验，我们得到了不同浓度底物溶液在酶催化下的反应速率数据，并绘制了相关的酶动力学曲线。

根据实验结果，我们可以得出以下结论：1. KM值的影响：- KM值是酶底物结合的亲和力指标，表示酶与底物结合的紧密程度。

KM值越小，表示酶与底物结合越紧密，酶对底物的亲和力越高。

- 实验结果显示，随着底物浓度的增加，反应速率逐渐增加，但增速逐渐减缓。

当底物浓度接近KM值时，反应速率趋于饱和，增速几乎为零。

- 这表明KM值对酶催化速率有重要影响，较小的KM值意味着酶对底物的亲和力更高，反应速率更快。

2. 酶活性与酶浓度的关系：- 实验结果还显示，随着酶浓度的增加，反应速率也随之增加。

碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定

碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定一、实验原理(1).碱性磷酸酶的分离纯化1.机械破碎法制备肝匀浆低浓度乙酸钠：低渗破膜低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加入不同有机溶剂重复离心正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP(2).比活性测定1.比活性的定义*单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。

*通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。

*用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一。

2.测定样品的比活性必须测定：*每毫升样品中的酶活性单位数。

*每毫升样品中的蛋白质毫克数。

3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理(3).米氏常数测定K m即为米氏常数，V max为最大反应速度＊如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此,米氏常数的单位为mol/L。

当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 V max, K m = [S]＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。

以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km值。

二. 器材721分光光度计台式离心机恒温水浴锅微量移液器托盘天平匀浆器试管三.试剂1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁5.3625g溶于蒸馏水中,稀释至50ml.2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.4. 丙酮(分析纯).5. 95%乙醇(分析纯).6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/L Tris 液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2.2H2o)0.3g,4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期;临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可.8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取无水碳酸钠0.318g及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml.9. 碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.10. 0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏水中,溶解后两液混合均匀,再加蒸馏水至50ml,置棕色瓶中暗处保存.11. 0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.12. 酚标准液(0.1mg/ml).四.实验步骤(1). “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作(2).“碱性磷酸酶比活性测定”实验操作1.样品中碱性磷酸酶活性测定:(1).取5支试管,编号,按表1操作:表1A’B’C’D’标准空白各阶段稀释液(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 - -0.1mg/ml酚标准液(ml) - -- - 0.1 -pH8.8Tris缓冲液(ml) - - - - - 0.1置37℃水浴中保温5分钟复合基质液(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0混匀,37℃水浴中准确保温15分钟.保温结束后,各管立即加入1.0ml碱性溶液终止反应,再加入0.5%铁氰化物钾2.0ml,立即混匀,静置10min,在510nm波长下比色测定.2.酶活性单位计算每毫升酶液中酶活性单位=测定OD/标准OD X标准管中酚含量X1/0.1X稀释倍数3.样品中蛋白质含量的测定(1)测定蛋白质时,保留的A’管还需稀释5倍为A’’管,否则蛋白质浓度太高,其余各管不需再稀释,各用1.0ml进行测定.表2A’’B’C’D’空白各阶段稀释液(ml) 1.01.01.01.0 -0.1mg/ml酚标准液(ml) - -- -1.0pH8.8Tris缓冲液(ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0混匀,置20~25℃水浴中保温10分钟复合基质液(ml) 0.50.50.50.50.5(2)立即振摇均匀,在20~25℃保温30min后,于650nm波长处比色.(3)蛋白质浓度计算:从Lowry法标准曲线查得的蛋白质毫克数,乘以稀释倍数,即为每毫升样品中蛋白质毫克数.4.比活性及得率计算碱性磷酸酶比活性=每毫升样品中碱性磷酸酶活性单位数/每毫升样品中蛋白质毫克数纯化倍数=各阶段比活性数/匀浆(A液)比活性数得率=各阶段酶的总活性单位/匀浆(A液)中的酶的总活性单位X100%5.实验结果将上述各实验计算结果填入表3内.表3分离总体积蛋白质总蛋白每毫升酶总活性比活性纯化得率阶段(ml) 浓度(mg) 活性单位单位(U/mg ) 倍数(%)(mg/ml) (U/ml) (U)匀浆(A液)第一次丙酮沉淀(B液)第二次丙酮沉淀(C液)第三次丙酮沉淀(D液)3．米氏常数测定1. 取15只试管，按照下表操作，1～7号重复两组，0 号为空白对照。

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