放射免疫分析
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7
剂量反应曲线
8
放射免疫分析原理示意图
9
三、放射免疫测定的优点
1）灵敏度高 大分子，ng/ml水平；小分子，pg/ml水 平。
2）特异性好 3）精确地定量 4）操作方法越来越简便 5）抗体的来源日益广泛，放射免疫可测定的微量物
质越来越多。
10
第二节 放射免疫基本试剂
11
一、标准品
标准品是放射免疫分析法定量的依据，由于以标准 品的量用来表示被测物质的量，标准抗原的基本要求： (1)标准抗原与待测抗原的免疫性必须一致，即它们与
以在测定中得到的相应放射性强度为纵坐标作图。 放射性强度可任选B或F，亦可用计算值B/(B＋F)、 B/F和B/B0 （零标准管结合） 。标本应作双份测定， 取其平均值，在制作的标准曲线图上查出相应的受 检抗原浓度。
33
34
第四节 放射免疫的质控
35
一、质量控制的目的
控制系统误差，减少偶然误差。 系统误差：1、试剂盒的质量；
16
五、缓冲液
目前最常用的缓冲液有下列几种：①磷酸盐缓 冲液；②醋酸盐缓冲液；③Tris –HCl缓冲液；⑤硼 酸缓冲淮。其中以磷酸盐缓冲液应用最多。 ①保护蛋白 ②防腐剂 ③酶抑制剂 ④阻断剂 ⑤载体蛋白
17
六、试剂盒要注意的问题
1）检查药盒的数量与药盒说明书是否一致（一般 药盒内装有标记抗原、抗体、标准品、分离剂）。
特别适用于微量蛋白质、激素和多肽的定量测定。
4
二、基本原理
1、标记抗原（Ag*） 、非标记抗原（Ag）和特异性抗体 （Ab）三者同时存在于一个反应体系，标记抗原和非标 记抗原对特异性抗体具有相同的结合力，两者相互竞争 结合特异性抗体。
Ag* + Ab = Ag* Ab +
Ag AgAb
5
=
2、作为试剂的标记抗原和抗体的量是固定的，非标 记抗原是变化的。标记抗原与非标记抗原与限量的抗 体发生竞争性结合。反应达到平衡时，标记抗原抗体 复合物形成的量就随着非标记抗原的量而改变。
三、脑-肠肽类
胃动素（MTL）——抑肽酶-EDTA 神经降压素（NT）——抑肽酶-EDTA 神经肽（NPY）——抑肽酶-EDTA 胃泌素——血清
41
四、骨代谢类
骨钙素（BGP）——血清 降钙素（CT）——血清 甲旁素相关肽——抑肽酶-EDTA
五、甲状腺功能类
游离T3 游离T4 甲状腺球蛋白TG 总T3 总T4 都为血清
20
二、测定方法
用放射免疫分析进行测定时分三个步骤，即抗原 抗体的竞争抑制反应、B和F的分离及放射性的测量。
21
T：总放射性,只有标记抗原时的放射性。 B0：待测抗原剂量为零时的最大结合。 NSB：非特异结合，标记抗原结合在非抗血清的物质
上的部分。
非特异结合率： （NSB/T）× 100% 最大结合率：（ B0 / T）× 100%
NSB（非特异结合管）<5%；B0/T最大结合率为 50%时曲线最好，但最大结合率>25%曲线就能用，结 合率低于20%曲线就不能用。
38
第五节 放射免疫的应用
39
一、心血管功能类：
血栓素（TXB2）——消炎痛-EDTA抗凝
6-酮-前列腺素F1α——消炎痛-EDTA抗凝
内皮素ET——抑肽酶-EDTA
2）标准品，抗血清、标记抗原要在-20℃以下保存， 加样前要将标准品、抗血清、标记抗原充分混匀， 标记抗原最好当天溶解，当天使用。
3）分离剂不能冷冻保存应保存在4℃冰箱内。
4）缓冲液，每种药盒的缓冲液不相同，不能相互
使用。
18
第三节 放射免疫测定
19
一、样品的处理
血清、血浆（抗凝），尿液，组织匀浆 用蒸馏水或缓冲液作适当稀释。 血清或血浆抽入试管-20℃保存3个月， -70℃ 保存6个月。
(3)聚乙二醇（PEG）沉淀法：PEG沉淀剂的主要优 点是制备方便，沉淀完全。缺点是非特异性结合 率比用第二抗体为高，且温度高于30℃时沉淀物 容易复溶。
30
2、特异性分离法 (1)双抗法(Ab2法) (2)固相分离法：将特性抗体(第一或第二抗体) 或抗原结合在固相物质。 (3)金黄色葡萄球菌A蛋白分离法。
22
（一）抗原抗体反应 将受检标本、标记抗原和抗血清按顺序定量加
入小试管中，在一定的温度下进行竞争抑制反应。 37℃，2h或4℃过夜。
加样程序
由于抗原、标记抗原和抗体三者加样次序不同， 而出现两种加样程序，分述如下：
23
1、平衡饱和加样程序 （1）基本原理：让标记Ag和非标Ag与Ab以相同的机 率反应，反应达到平衡后中止反应，分离结合和游离 的标记Ag。 （2）加样程序：一般先加标准物或被测样品，再加 抗血清，最后加标记物。这样的顺序是让标准物或被 测物与抗体有短暂的结合，提高抗原的竞争抑制能力。
24
试剂 缓冲液 标准液
样品 抗血清 125I-IL-2
PR分离剂
IL-2 RIA加样程序（μL）--B5
-
200
100
-
-
-
-
100
-
-
-
-
-
-
100
100
100
100
100
100
摇匀 4℃
24h
-
500
500
500
样品
-
100 100 100
500
25
2、顺序饱和加样程序 （1）基本原理：先将标准物或样品与抗血清混匀， 免疫反应12～24h，使抗原与抗体充分结合，然后再 加入标记抗原，与抗体反应6～24h，最后分离B与F， 这称为顺序饱和分析法。 （2）应用顺序饱和加样，第1次温育时间可以长， 而第2次温育时间要短，这样可以提高灵敏度。
标记125I的方法可分两大类，即直接标记法和间接 标记法。
14
三、抗体（抗血清）
抗血清中含有对其相应抗原的特异性抗体。 目前常以抗原免疫年轻、健康的纯种小动物而诱 发产生多克隆抗体，选取特异性高、亲和力强及 滴度高的血清，为RIA所用。
15
四、B与F分离剂
以2%加膜活性炭溶液为例，2%加膜活性炭 溶液的配制： 活性炭2g（杭州木材厂生产，森工牌732型） 右旋糖酐T200.2g 加0.1mol/L PBS 至100ml 电磁搅拌1h，然后置于普通冰箱待用。
31
（三）放射性强度的测定
B、F分离后，即可进行放射性强度测定。测量 仪器有两类，液体闪烁计数仪（β射线，如3H、32P、 14C等）和晶体闪烁计数仪（ γ射线，如125、131I、 57Cr等）。
计数单位是探测器输出的电脉冲数，单位为cpm （计数/分），也可用cps（计数/秒）表示。
32
（四）标准曲线的制备 用半对数纸，以标准抗原的不同浓度为横坐标，
降钙素基因相关肽——抑肽酶-EDTA
心钠素ANP——抑肽酶-EDTA
肾上腺髓质素ADM——抑肽酶-EDTA
醛固酮——肝素抗凝
40
二、多肽因子类
肿瘤坏死因子TNF、IL-1β、 IL-2、 IL-4、 IL-8、 IL-10、 粒细胞-集落细胞刺激因子、胰岛素样生长因子-2、红细胞生 成素（EPO）
放射免疫分析
Radio immunoassay （RIA）
王海龙 2006.03
探讨的主要内容
基本概念 基本原理 放射免疫方法的建立 放射免疫分析的要求和影响因素 免疫放射的基本概念 放免分析的应用
2
第一节 放射免疫概述
3
一、概念
一种体外超微量分析法，它是将具有高灵 敏度的放射性核素（如125I）示踪技术与高度 特异性的免疫化学技术二者结合建立起来的分 析方法。用于定量测定受检标本中的抗原。
26
试剂 缓冲液 标准液
样品 抗血清
125I-URO
PR分离 剂
尿钠素 RIA加样程序（μL）
T
NSB
B0
B1---B5
-
300
200
-
-
-
-
200
-
-
-
-
-
-
100
100
摇匀 4℃
48h
100
100
100
100
摇匀 4℃
24h
-
500
500
500
样品
-
200 100
100
500
27
（二）B、F分离技术 在RIA反应中，标记抗原和特异性抗体的含量
42
六、肿瘤检测类
甲胎蛋白（AFP） 癌胚抗原（CEA） 铁蛋白 β2微球蛋白
七、糖尿病类
胰岛素 胰岛素抗体 C-肽
胰高血糖素
43
八、 吗啡、叶酸、维生素 性激素类
44
45
抗体的亲和力和特异性应相同。 (2) (3)标准抗原的量必须准确。 (4)标准抗原应有很好的稳定性。
12
二、标记物
1、标记抗原应具备： ①比放射性高，以保证方法的灵敏度； ②免疫活性好； ③所用的核素的半衰期尽可能长，标记一次可较
长时间使用，这对来之不易的抗原尤其重要； ④标记简便、易防护。
13
2、标记用的核素有放射γ射线和β射线两大类。 前者主要为131I、125I、57Cr和60Co；后者有14C、3H 和32P。放射性核素的选择首先考虑比活性。125I是 目前常用的RIA标记物。
非标记抗原量增加，相应地结合较多的抗体，从 而抑制标记抗原对抗体的结合，使标记抗原抗体复合 物相应减少，游离的标记抗原相应增加，亦即抗原抗 体复合物中的放射性强度与受检标本中抗原的浓度呈 反比。
6
3、将Ag* Ab与游离Ag*分开，分别测定其放射性强度， 就可算出结合态的Ag* （B）与游离态的Ag* （F）的 比值（B/F），或算出其结合率[B/(B＋F)]，这与标 本中的抗原量呈函数关系。用一系列不同剂量的标 准抗原进行反应，计算相应的B/F，可以绘制出一条 剂量反应曲线。 4、受检标本在同样条件下进行测定，计算B/F值， 即可在剂量反应曲线上查出标本中抗原的含量。
极微，形成的标记抗原抗体复合物（B）不能自行 沉淀，因此需用一种合适的沉淀剂使它彻底沉淀， 以完成与游离标记抗原（F）的分离。
28
1、 (1)吸附法：利用表面活性物质将反应液中的小 分子游离部分F吸附，通过离心，将F沉淀，使大 分子结合物B留在上清液中，而达到分离的目的。
29
(2)过滤法：反应液中B与F混合物在通过一定规格 孔径的滤膜时，大分子不会通过滤膜孔被阻留在 滤膜上，小分子游离的放射性物质F被抽吸通过滤 膜而分离。
2、检测仪的性状（稳定性、灵敏度） 偶然误差：1、实验方法的不同；
2、实验人员的操作
36
二、放射免疫分析中测量误差的控制
1．选择准确性高的方法； 2．建立各种类型的标准；
对标准品应规定纯度及制备方法，使用年限及贮 存条件。 3．建立操作规程，按章操作； 4．建立可靠的检查制度。
37
5）为了达到适宜的灵敏度，在系统中抗原剂量为零 时的最大结合（即B0），是测定的起点（基准）。
剂量反应曲线
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放射免疫分析原理示意图
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三、放射免疫测定的优点
1）灵敏度高 大分子，ng/ml水平；小分子，pg/ml水 平。
2）特异性好 3）精确地定量 4）操作方法越来越简便 5）抗体的来源日益广泛，放射免疫可测定的微量物
质越来越多。
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第二节 放射免疫基本试剂
11
一、标准品
标准品是放射免疫分析法定量的依据，由于以标准 品的量用来表示被测物质的量，标准抗原的基本要求： (1)标准抗原与待测抗原的免疫性必须一致，即它们与
以在测定中得到的相应放射性强度为纵坐标作图。 放射性强度可任选B或F，亦可用计算值B/(B＋F)、 B/F和B/B0 （零标准管结合） 。标本应作双份测定， 取其平均值，在制作的标准曲线图上查出相应的受 检抗原浓度。
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34
第四节 放射免疫的质控
35
一、质量控制的目的
控制系统误差，减少偶然误差。 系统误差：1、试剂盒的质量；
16
五、缓冲液
目前最常用的缓冲液有下列几种：①磷酸盐缓 冲液；②醋酸盐缓冲液；③Tris –HCl缓冲液；⑤硼 酸缓冲淮。其中以磷酸盐缓冲液应用最多。 ①保护蛋白 ②防腐剂 ③酶抑制剂 ④阻断剂 ⑤载体蛋白
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六、试剂盒要注意的问题
1）检查药盒的数量与药盒说明书是否一致（一般 药盒内装有标记抗原、抗体、标准品、分离剂）。
特别适用于微量蛋白质、激素和多肽的定量测定。
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二、基本原理
1、标记抗原（Ag*） 、非标记抗原（Ag）和特异性抗体 （Ab）三者同时存在于一个反应体系，标记抗原和非标 记抗原对特异性抗体具有相同的结合力，两者相互竞争 结合特异性抗体。
Ag* + Ab = Ag* Ab +
Ag AgAb
5
=
2、作为试剂的标记抗原和抗体的量是固定的，非标 记抗原是变化的。标记抗原与非标记抗原与限量的抗 体发生竞争性结合。反应达到平衡时，标记抗原抗体 复合物形成的量就随着非标记抗原的量而改变。
三、脑-肠肽类
胃动素（MTL）——抑肽酶-EDTA 神经降压素（NT）——抑肽酶-EDTA 神经肽（NPY）——抑肽酶-EDTA 胃泌素——血清
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四、骨代谢类
骨钙素（BGP）——血清 降钙素（CT）——血清 甲旁素相关肽——抑肽酶-EDTA
五、甲状腺功能类
游离T3 游离T4 甲状腺球蛋白TG 总T3 总T4 都为血清
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二、测定方法
用放射免疫分析进行测定时分三个步骤，即抗原 抗体的竞争抑制反应、B和F的分离及放射性的测量。
21
T：总放射性,只有标记抗原时的放射性。 B0：待测抗原剂量为零时的最大结合。 NSB：非特异结合，标记抗原结合在非抗血清的物质
上的部分。
非特异结合率： （NSB/T）× 100% 最大结合率：（ B0 / T）× 100%
NSB（非特异结合管）<5%；B0/T最大结合率为 50%时曲线最好，但最大结合率>25%曲线就能用，结 合率低于20%曲线就不能用。
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第五节 放射免疫的应用
39
一、心血管功能类：
血栓素（TXB2）——消炎痛-EDTA抗凝
6-酮-前列腺素F1α——消炎痛-EDTA抗凝
内皮素ET——抑肽酶-EDTA
2）标准品，抗血清、标记抗原要在-20℃以下保存， 加样前要将标准品、抗血清、标记抗原充分混匀， 标记抗原最好当天溶解，当天使用。
3）分离剂不能冷冻保存应保存在4℃冰箱内。
4）缓冲液，每种药盒的缓冲液不相同，不能相互
使用。
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第三节 放射免疫测定
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一、样品的处理
血清、血浆（抗凝），尿液，组织匀浆 用蒸馏水或缓冲液作适当稀释。 血清或血浆抽入试管-20℃保存3个月， -70℃ 保存6个月。
(3)聚乙二醇（PEG）沉淀法：PEG沉淀剂的主要优 点是制备方便，沉淀完全。缺点是非特异性结合 率比用第二抗体为高，且温度高于30℃时沉淀物 容易复溶。
30
2、特异性分离法 (1)双抗法(Ab2法) (2)固相分离法：将特性抗体(第一或第二抗体) 或抗原结合在固相物质。 (3)金黄色葡萄球菌A蛋白分离法。
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（一）抗原抗体反应 将受检标本、标记抗原和抗血清按顺序定量加
入小试管中，在一定的温度下进行竞争抑制反应。 37℃，2h或4℃过夜。
加样程序
由于抗原、标记抗原和抗体三者加样次序不同， 而出现两种加样程序，分述如下：
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1、平衡饱和加样程序 （1）基本原理：让标记Ag和非标Ag与Ab以相同的机 率反应，反应达到平衡后中止反应，分离结合和游离 的标记Ag。 （2）加样程序：一般先加标准物或被测样品，再加 抗血清，最后加标记物。这样的顺序是让标准物或被 测物与抗体有短暂的结合，提高抗原的竞争抑制能力。
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试剂 缓冲液 标准液
样品 抗血清 125I-IL-2
PR分离剂
IL-2 RIA加样程序（μL）--B5
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摇匀 4℃
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样品
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2、顺序饱和加样程序 （1）基本原理：先将标准物或样品与抗血清混匀， 免疫反应12～24h，使抗原与抗体充分结合，然后再 加入标记抗原，与抗体反应6～24h，最后分离B与F， 这称为顺序饱和分析法。 （2）应用顺序饱和加样，第1次温育时间可以长， 而第2次温育时间要短，这样可以提高灵敏度。
标记125I的方法可分两大类，即直接标记法和间接 标记法。
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三、抗体（抗血清）
抗血清中含有对其相应抗原的特异性抗体。 目前常以抗原免疫年轻、健康的纯种小动物而诱 发产生多克隆抗体，选取特异性高、亲和力强及 滴度高的血清，为RIA所用。
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四、B与F分离剂
以2%加膜活性炭溶液为例，2%加膜活性炭 溶液的配制： 活性炭2g（杭州木材厂生产，森工牌732型） 右旋糖酐T200.2g 加0.1mol/L PBS 至100ml 电磁搅拌1h，然后置于普通冰箱待用。
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（三）放射性强度的测定
B、F分离后，即可进行放射性强度测定。测量 仪器有两类，液体闪烁计数仪（β射线，如3H、32P、 14C等）和晶体闪烁计数仪（ γ射线，如125、131I、 57Cr等）。
计数单位是探测器输出的电脉冲数，单位为cpm （计数/分），也可用cps（计数/秒）表示。
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（四）标准曲线的制备 用半对数纸，以标准抗原的不同浓度为横坐标，
降钙素基因相关肽——抑肽酶-EDTA
心钠素ANP——抑肽酶-EDTA
肾上腺髓质素ADM——抑肽酶-EDTA
醛固酮——肝素抗凝
40
二、多肽因子类
肿瘤坏死因子TNF、IL-1β、 IL-2、 IL-4、 IL-8、 IL-10、 粒细胞-集落细胞刺激因子、胰岛素样生长因子-2、红细胞生 成素（EPO）
放射免疫分析
Radio immunoassay （RIA）
王海龙 2006.03
探讨的主要内容
基本概念 基本原理 放射免疫方法的建立 放射免疫分析的要求和影响因素 免疫放射的基本概念 放免分析的应用
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第一节 放射免疫概述
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一、概念
一种体外超微量分析法，它是将具有高灵 敏度的放射性核素（如125I）示踪技术与高度 特异性的免疫化学技术二者结合建立起来的分 析方法。用于定量测定受检标本中的抗原。
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试剂 缓冲液 标准液
样品 抗血清
125I-URO
PR分离 剂
尿钠素 RIA加样程序（μL）
T
NSB
B0
B1---B5
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300
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48h
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样品
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（二）B、F分离技术 在RIA反应中，标记抗原和特异性抗体的含量
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六、肿瘤检测类
甲胎蛋白（AFP） 癌胚抗原（CEA） 铁蛋白 β2微球蛋白
七、糖尿病类
胰岛素 胰岛素抗体 C-肽
胰高血糖素
43
八、 吗啡、叶酸、维生素 性激素类
44
45
抗体的亲和力和特异性应相同。 (2) (3)标准抗原的量必须准确。 (4)标准抗原应有很好的稳定性。
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二、标记物
1、标记抗原应具备： ①比放射性高，以保证方法的灵敏度； ②免疫活性好； ③所用的核素的半衰期尽可能长，标记一次可较
长时间使用，这对来之不易的抗原尤其重要； ④标记简便、易防护。
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2、标记用的核素有放射γ射线和β射线两大类。 前者主要为131I、125I、57Cr和60Co；后者有14C、3H 和32P。放射性核素的选择首先考虑比活性。125I是 目前常用的RIA标记物。
非标记抗原量增加，相应地结合较多的抗体，从 而抑制标记抗原对抗体的结合，使标记抗原抗体复合 物相应减少，游离的标记抗原相应增加，亦即抗原抗 体复合物中的放射性强度与受检标本中抗原的浓度呈 反比。
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3、将Ag* Ab与游离Ag*分开，分别测定其放射性强度， 就可算出结合态的Ag* （B）与游离态的Ag* （F）的 比值（B/F），或算出其结合率[B/(B＋F)]，这与标 本中的抗原量呈函数关系。用一系列不同剂量的标 准抗原进行反应，计算相应的B/F，可以绘制出一条 剂量反应曲线。 4、受检标本在同样条件下进行测定，计算B/F值， 即可在剂量反应曲线上查出标本中抗原的含量。
极微，形成的标记抗原抗体复合物（B）不能自行 沉淀，因此需用一种合适的沉淀剂使它彻底沉淀， 以完成与游离标记抗原（F）的分离。
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1、 (1)吸附法：利用表面活性物质将反应液中的小 分子游离部分F吸附，通过离心，将F沉淀，使大 分子结合物B留在上清液中，而达到分离的目的。
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(2)过滤法：反应液中B与F混合物在通过一定规格 孔径的滤膜时，大分子不会通过滤膜孔被阻留在 滤膜上，小分子游离的放射性物质F被抽吸通过滤 膜而分离。
2、检测仪的性状（稳定性、灵敏度） 偶然误差：1、实验方法的不同；
2、实验人员的操作
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二、放射免疫分析中测量误差的控制
1．选择准确性高的方法； 2．建立各种类型的标准；
对标准品应规定纯度及制备方法，使用年限及贮 存条件。 3．建立操作规程，按章操作； 4．建立可靠的检查制度。
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5）为了达到适宜的灵敏度，在系统中抗原剂量为零 时的最大结合（即B0），是测定的起点（基准）。