菌落总数与大肠菌群数测定

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菌落总数、大肠菌群测定方法

菌落总数、大肠菌群测

定方法

-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1

菌落总数和大肠菌群测定（固体样品）

药品：

1、平板计数琼脂

2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）

3、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）

4、氯化钠

设备材料：

烧杯、三角瓶、广口瓶、培养皿、刻度吸管、倒气管、玻璃棒、试管、硅胶塞、洗耳球、棉花、布或报纸等。

一、准备工作

（指导书是按一个样品所需物品准备的，实验室可按样品量增加）1、平板计数琼脂培养基准备----用于菌落总数测定

将三角瓶放在电子称上，去皮，按平板计数琼脂使用说明称量，加200ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸加热煮沸，充分溶解，盖上硅胶塞，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧。

2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤----用于大肠菌群测定

（a）将烧杯放在电子称上，去皮，按使用说明称量，加100ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸，充分溶解。

（b）用10ml（毫升）的吸管分装到9支(18*180规格)试管中，每支试管加10ml的月桂基溶液LST（合计90毫升）。

（c）9支试管分别放入倒气管（开口向下），排气，盖上硅胶塞。

3、%的生理盐水----用于样品稀释

将广口瓶去皮，称取氯化钠加225ml蒸馏水，摇匀，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧；同样配制第二瓶。

4、准备2个空试管，盖上硅胶塞----用于样品稀释。

5、准备8个培养皿，用布包扎好。

6、准备至少3支5ml和1支10ml带有刻度的吸管，用布包扎好（顶部可用棉球塞住，防止吸液时，液体不慎吸入洗耳球）。

7、准备操作的工具：剪刀1把、镊子1个、勺子等打开产品包装所需工具，用布包扎好。

菌落总数及大肠菌群

菌落总数及大肠菌群的测定

一、菌落总数的测定

1.准备工作：

1.1先将所有仪器用报纸包好，所需药品配置好，放入121℃灭菌锅灭菌15min

分钟

1.1微检室提前开好紫外线灯杀菌30分钟以上。

1.2把灭好菌的培养基加热溶解，放置50℃的水浴锅恒温备用

2.样品处理：先用酒精对产品外袋消毒，然后打开放入放入研钵中压碎或用剪刀剪碎（注：手部接触的部分要丢弃）

3.称取25ɡ样品于225ml生理盐水中，摇匀生理盐水中，摇匀。各吸1ml至两个培养皿中，倒入培养琼脂，转动平板混匀。

4.待琼脂凝固后放翻转平皿，放入36±1℃无菌培养箱培养48小时。

二、大肠菌群的测定：

1.称取25ɡ处理好的样品于225ml生理盐水中，摇匀。各吸取10ml至3根月桂基硫酸盐胰蛋白（LST）肉汤双料管中，再各吸取1ml至3根月桂基硫酸盐胰蛋白（LST）肉汤单料管和9ml生理盐水中，把试管中样液和生理盐水摇匀，用另一支移液管分别吸取1ml至另外3根单料管中。

2.把试管塞好放入36±1℃无菌培养箱培养24小时，观察导管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48小时，不产气者为阴性，产气者进行复发酵实验。

3.复发酵实验：

用接种环从所有48小时内发酵产气的LST肉汤管中分别取1环，移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36±1℃培养48小时，观察是否产气，产气者为大肠菌群阳性。

4.大肠菌群最可能（MPN）的报告

根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表报告每克（或毫升）样品中大肠杆菌的MPN 值。

（1）营养琼脂的配置：称取23.5g于1L蒸馏水中，加热沸腾至完全溶解，分装于500ml锥形瓶中，1瓶大约装350ml，121℃高压灭菌15分钟。

食品中菌落总数和大肠菌群检验的质量控制

2、分子生物学方法
随着分子生物学技术的发展，分子生物学方法逐渐应用于菌落总数和大肠菌群检验的质量控制中。该方法主要包括聚合酶链式反应（PCR）技术、基因测序等方法，具有快速、准确、灵敏度高等优点。同时，该方法能够直接检测食品中的微生物，避免了传统微生物学方法中培养基和生化反应的繁琐操作。
3、代谢组学方法
1、菌落总数检测结果
经过检测，我们发现遂平县农村地区居民饮用水的菌落总数存在超标现象。其中，超标率最高的采样点达到了40%。这表明农村地区的水源可能存在污染问题，或者水处理设备老化、消毒不彻底等问题。
2、总大肠菌群检测结果
在总大肠菌群的检测中，我们发现也有部分采样点的水样存在超标现象。其中，超标率最高的采样点达到了25%。这表明农村地区的水源可能存在粪便污染问题，或者水处理设备运行不稳定等问题。
质量控制的概念
质量控制是指为达到一定的目的而采用的一系列管理和技术手段，其目的是确保产品或服务的质量满足规定的要求。在食品中菌落总数和大肠菌群检验中，质量控制主要包括以下方面：制定质量控制计划，选择合适的检验方法，评估质量结果等。
菌落总数和大肠菌群检验的质量控制
1、样品采集、运输和保存
实验结果表明，不同品牌、不同工艺的月饼样品中菌落总数和大肠菌群的数量存在较大差异。其中，菌落总数最高的样品是传统手工月饼，大肠菌群最高的样品则是采用现代工艺生产的月饼。通过对比不同检测方法的结果，我们发现采用国家标准方法检测出的菌落总数和大肠菌群数量普遍高于企业自检方法。

菌落总数和大肠菌群的区别

关键词：菌落总数；大肠菌群；食品

我国的国家标准绝大多数食品都制订了菌落总数和大肠菌群的指标，并对其数量做了详细的规定，菌落总数和大肠菌群是食品中安全性指标，是影响产品质量问题的常见指标，常常受到生产企业和消费者的高度父注，菌落总数的报告单位是cfu／g (ml )，大肠菌群的报告位是mpn／100g ( ml)，那么cfu，mpn是什么含义呢，有的食品微生物检测中菌落总数结果很高但大肠菌群很低，有关企业对此不太理解，现在将做一下解释说明。

L菌落总数(cfu)

菌落总数是用来判定食品在被加工过程中被污染的程度及卫生质量的重要指标，食品的生产加工过程叶中，卫生质量的高低首先决定食品原料的来源．原料的卫生与否，是否被污染过，这是根本原因，其次是环境卫生水平的高低，再次就是加工人员和加工工具的卫生状况，要保证食品卫生安全就必须保证所加工的原料来源，环境，加工工具和人员符合卫生标准，但是如何判定食品生产加工过程中是否符合卫生要求，以便对被检产品做出一个科学的评价，菌落总数的多少在一定程度上反映出卫生质量的优劣，也可以用这一方法观察出食品中细菌的繁殖动态，以便于对被捡样品进行卫生评价时提供科学依据。

菌落总数中的菌落英文意思是(colony)，定义为细菌和其他几种做微生物在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼所识别的生长物，它是由数以万计的相同细菌聚集而成的，故又有细菌集落之称。各种细菌的菌落各自具有一定的特征，按其特征的不同可以在某种程度上鉴别某种细菌，为卫生检验提供依据，菌落总数是指在被检样品的单位重量( g )．体积(m1) 或表面积(clni) 内所含能于某种固体培养基上在一定条件下培养后所生成的细菌集落的总数。其培养的原理是以检样在被稀释到一定体积后，吸取一定量的检样，检样中的细菌细胞和培养基混合后，每个细菌细胞部形成一个肉眼可见的菌落的假设为基础的．由于检验中采用的是37℃有氧条件下培养。因而并不能测出每克或每毫升样品内的实际活菌数，其中的微嗜氧菌，厌氧菌，冷营养菌在此条件下都不能生长，有特殊营养要求的一些细菌的生长也受到了限制，因此培养的只是一群能在普通营养琼脂中发育中发育的嗜中温的需氧兼性厌氧的细菌总数，只有具备每种细菌生长要求的特定的环境条件，才能将所有细菌全部培养出来，因此要的到全部的茼落总数应将检样接种到不同的培养基上，但国家的食品卫生标准对食品中菌落总数的规定并不需要接种不同的非选择性培养基，原因就是标准所规定的数值全部是在37℃有氧条件下测定得出的。

食品中细菌总数及大肠菌群值的检测

EMB平板典型大肠杆学会食品中细菌菌落总数的测定方法和平板活菌计数法
本表采用3个稀释度：1mL(g)，0.
菌菌落特征：大肠菌群中的细菌种类，一般并非是病原菌，为什么要选用大肠菌群作为食品被污染的指标？
菌落总数测定——卫生学意义菌落总数测定流程(倾注平板法)
中心黑色或紫红色，有（每个稀释度做两个平行）
菌落计数
菌落总数测定几点说明
• 由于检样中采用30/35℃有氧条件下培养，一些特殊营养要求的细菌、厌氧菌、微需氧菌、以及非嗜中温细菌，均难以反映出来。
• 鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因而平板上所得菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位（colony forming units，CFU）报告。
根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。
近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。 3、大肠菌群是肠道最普遍存在和数量最多的一群细菌、常将其作为人畜粪便污染的标志。
选择2~3个连续适宜稀释度
或无绿色金属光泽大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

菌落总数与大肠菌群数测定

第一区划线灭菌接种环第二区划线灭菌接种环第三区划线灭菌接种环
分区划线法
操作要点 1.划下一个区前必须灭菌接种环 2.划线时接种环同平板呈30-40°角 3.每次划线应该压到上一个区域的2-3条线 4.用接种环的“面”而不是“弧”在平板上滑动
大肠菌群数测定
实验步骤 2.分离培养：
涂片
热固定
初染
媒染
脱色
复染
革兰染色法
革兰氏染色阴性
革兰氏染色阳性
复发酵
器材与试剂培养24小时后的伊红美兰平板、酒精灯、接种环、复发酵管
大肠菌群数测定
实验步骤 3.复发酵（1）选取鉴定为无芽孢G-杆菌的菌落 1-3个（2）接种至10ml乳糖蛋白胨培养液（3）培养：37℃，24h （4）观察指标：产酸，产气
液体接种
复发酵
复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产生
大肠菌群数测定
注意事项： 1.无菌操作 2.吸管使用 3.洗去染液的方法 4.显微镜保养 5.液体接种
MPN法原理
MPN法（Most Probable Number Method）目的：对某种细菌进行选择性计数核心思想：泊松分布实施方法：多次稀释直至无菌，每个稀释度分
别接种若干培养管，根据阳性管数估算MPN值
MPN法原理
MPN法（Most Probable Number Method） 1.细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布:

食品中菌落总数大肠菌群数测定

任务二练习：MPN检索表用法
• 十倍稀释1ml ，百倍稀释1ml ，千倍稀释1ml 各三管，都为阴性，结果为＜300MPN/100mL • 原样品1ml或十倍稀释10ml ，十倍稀释1ml ，百倍稀释 1ml 各三管，都为阴性，结果为＜ 30MPN/100mL • 原样品10ml ，原样品1ml，十倍稀释1ml 各三管，都为阴性，结果为＜3MPN/100mL
水样的检验
• 一般只检验菌落总数和大肠菌群MPN
• 只有在流行病学调查时才进行致病菌检验 • 大肠菌群是水的卫生学指示菌 • 水样中大肠菌群的检验方法：MPN法（特殊） - 初发酵、平板分离、复发酵
水中总大肠菌群的测定
多管发酵法
(1) 生活饮用水
① 初发酵试验 ② 平板分离阳性管接种在伊红美兰培养基上，37℃培养 18～24h，挑选典型特征的菌落，涂片、革兰氏染色、镜检
12.4 MPN法估计大肠菌群数量（任务二）
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查 MPN 检索表，报告为：个/100mL（或g）
或 MPN/100ml（或g）
What…? MPN (Most Probable Number)?
• MPN法是一种常见的间接计数法，相对来说，
CFU是直接计数法 • MPN法是一种概率估计法，有可信区间， MPN值并不能表示实际菌落数，而实际菌落数落在可信区间内的任何一点

菌落总数测定与大肠菌群计数准备工作

1、5个平板培养明（用报纸包封好）一个空白，其他4个就两个稀释度分别做两个平板

2、6条1ml吸管（用报纸包封好）吸管多包几条都没问题

3、称取3.3g营养琼脂加100ml蒸馏水(加热煮沸制成液)

《用500ml凸瓶装，用棉花蜜封瓶口，加报纸包蜜》

以上三步就是菌落总数测定的准备工作

4、称取0.85g氯化钠加100ml蒸馏水（摇匀制成生理盐水）

《用500ml凸瓶装，用棉花蜜封瓶口，加报纸包蜜》

5、（装有9ml盐水2支小试管，多放一支预做空白）做样品稀释

（装有9ml肉汤9支小试管，多放一支预做空白）做三个稀释度，每个稀释度做三支小试管

6、称取?克LST肉汤100ml蒸馏水（摇匀分装下以下9支小试管，每个9ml）

9支小试管要倒放小试管（装有9ml LST肉汤1：10 / 1：100 / 1：1000）每个稀释度做三支小试管

7、量斗、量杯

(以上全部放入高压锅消毒121~126℃约15~30分)

8、5g样品

菌落总数（以下步骤为已消毒好，要进入已消毒的室内及消毒台操作）

5g样品加入45ml 生理盐水配成1：10的样品A试剂

↓

在其中一支装有9ml生理的小试管中加入1ml A试剂

配成1：100的样品B试剂

↓↓

在其中一支装有9ml生理的小试管中加入1ml B试剂

配成1：1000的样品C试剂

↓（以下要在洒精灯下操作要在消毒台操作

菌落总数我们一般做两个稀释度

在A管中抽取2次，每次1ml，分别至于两个已经倒好营养琼脂的培养基中

在B管中抽取2次，每次1ml，分别至于两个已经倒好营养琼脂的培养基中

菌落总数、大肠菌群检验原始记录

产品名称：规格型号：检验报告编号：

检验依据:GB/T4789.2 GB/T4789.3 检测项目：菌落总数、大肠菌群生产批量：

所使用主要仪器：电热恒温培养箱、手提式压力灭菌锅、电热恒温干燥箱、显微镜。

一、菌落总数

取 5 份样品，分别取25g做为测试样品，加入225 mL无菌生理盐水，均质，制成1:10样品均液，用1ml 灭菌吸管吸取1:10的稀释液1ml加入9ml灭菌生理盐水的试管内，振荡摇匀做成1:100稀释液，以此法制备10倍系列递增稀释液，依据样品污染状况的估计，选取2个适宜稀释度的样品稀释液，每个稀释度各吸取1ml稀释液放入无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时吸取1ml稀释液放入两个无菌平皿中做空白对照。将凉至46℃的营养琼脂培养基注入培养皿内15～20ml混匀，待琼脂凝固后，翻转平板置36℃±1℃

二、大肠菌群

依据标准要求，选择稀释好的2个稀释度检测，培养基为结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA），置于36°C±1°C培养18-24h。证实实验：挑选10个不同类型典型和可疑菌落，接种煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管，36°C±1°C培养24-48h。观察产气情况，凡BGLB肉汤管产气，即可报告大肠菌群阳性。

检验：复核：审核：检验日期：

细菌总数与大肠菌群数测定

液体接种
复发酵
复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产生
根据证实有大肠菌群存在的阳性管〔瓶〕数查表，报告每升水中的大肠菌群数
MPN法原理
MPN法〔Most Probable Number Method〕目的：对某种细菌进行选择性计数核心思想：泊松分布实施方法：屡次稀释直至无菌，每个稀释度分
已灭菌的3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液〔50ml〕
〔2〕10支试管〔内有倒管〕，10ml水样+已
灭菌的3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液〔5ml〕
〔3〕培养：37 ℃，24h
〔4〕观察指标：
产酸〔黄色〕，产气〔倒管内有气泡〕
吸取水样
加注水样
初发酵结果
左2为阳性结果，培养基变成黄色〔产酸〕，小倒管内有气体产生。
培养结果
〔3〕如果测定水源水
用灭菌吸管取2~3个适宜稀释度的水样 1mL，分别注入灭菌平皿内。以下操作同生活饮用水的检验步骤。
八、计算
1、菌落计数及报告方法
作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。
总大肠菌群的检验方法中，多管发酵法适用于各种水样〔包括底泥〕，但操作复杂，需要时间长；滤膜法主要适用于杂质较少的水样，操作简单快捷
大肠菌群数测定

检验原始记录菌落总数及大肠菌群表格

检验原始记录

共页第页

样品名称样品编号

检验环境温度℃相对湿度% 菌落总数的测定（依据GB4789.2－2010检验）

主用仪器：培养箱

检验项目检测结果

样品稀释度10 10 10

菌落数，个

两稀释液之比

空白对照

菌落总数cfu/g

培养温度36℃±1℃培养时间：48 h±2h

主检校核日期

大肠菌群的测定（依据GB4789.3－2010检验）

主用仪器：培养箱

接

种量0.1g×3

初发酵试验LST肉汤管

复发酵试验BGLB肉汤管0.01g×3

初发酵试验LST肉汤管

复发酵试验BGLB肉汤管

0.001g×3

初发酵试验LST肉汤管

复发酵试验BGLB肉汤管

查大肠菌群最可能数（MPN）检索表[MPN/ ]:：

培养温度36℃±1℃培养时间：48 h±2h

备注：‘＋’表示阳性；‘－’表示阴性。

主检校核日期

食品中细菌菌落总数和大肠菌群的检测

精选PPT
3
解读标准
GB 7099-2003 糕点、面包卫生标准
GB/T 4789.24-2003 食品卫生微生物学检验糖果、糕点、蜜饯检验
GB 4789.1-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验总则
GB 4789.2-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定
GB/T 4789.3-2003 食品卫生微生物学检验大肠菌群测定
3
设备
7
样品处理
4
检验用品
8
报告
精选PPT
7
解读标准——GB 4789.2-2010 食品安全国家标准
食品微生物学检验菌落总数测定
精选PPT
8
精选PPT
9
精选PPT
10
精选PPT
11
解读标准——GB/T 4789.3-2003
食品卫生微生物学检验大肠菌群测定
为规范食品中大肠菌群指标的检测工作，现公告如下：现行食品标准中规定的大肠菌群指标以“MPN/100克或 MPN/100毫升”为单位的，适用《食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》（GB/T4789.3-2003）进行检测；以“MPN/克或 MPN/毫升”、“CFU/克或CFU/毫升”为单位的，适用《食品卫生微生物学检验大肠菌群计数》（GB/T4789.3-2008）进行检测。特此公告。

菌落总数及大肠菌群测定 - 副本

不产气
大肠菌群阴性
报告
左图，大肠菌群革兰氏染色后在显微镜下呈现典型的革兰氏阴性特征颜色红色
ＥＭＢ（伊红美蓝）琼脂培养基原理
ＥＭＢ琼脂培养基中含有的伊红和美蓝染料，可抑制革兰氏阳性细菌。那些能发酵乳糖的细菌，能将染料摄入细胞，从而使菌落呈现出紫色或边缘无色、中央暗黑色的菌落。
ＥＭＢ培养结果观察
若有二个稀释度均在30－300之间时，按国家标准方法要求应以计算公式计数。
若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。
如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
平板计数琼脂培养基（PCA）
胰蛋白胨5.0g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖1.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000ml，
pH7.0±0.2 121℃15分钟灭菌。
菌落总数计数原则及注意事项
到达规定培养时间，应立即计数。特殊情况需延长培养时间观察的，也应先行计数。
中国国家标准 GB 计数时应选取菌落数在 30 －300cfu/g的平板。
被检样品
稀释
图
大
乳糖胆盐发酵管3537

菌落总数(cfu)和大肠菌群(mpn)的区别

摘要：菌落总数和大肠菌群是食品中安全性指标，针对食品微生物检测中茵落总数结果很高但大肠菌群很低进行分析。

关键词：菌落总数；大肠菌群；食品

L菌落总数(cfu)

菌落总数和大肠菌群数测定PPT讲稿

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MPN法原理
• MPN法（Most Probable Number Method）
• 目的：对某种细菌进行选择性计数
• 核心思想：泊松分布 • 实施方法：多次稀释直至无菌，每个稀释度分
别接种若干培养管，根据阳性管数估算MPN值
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数
当前你正在浏览到的事第三页PPTT，共四十二页。
菌落总数测定
• 器材与试剂：
样品，无菌生理盐水，平板计数琼脂培养基， 1ml吸管，培养皿
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菌落总数测定
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倾注培养
当前你正在浏览到的事第六页PPTT，共四十二页。
当前你正在浏览到的事第十一页PPTT，共四十二页。
初发酵
• 器材与试剂
样品、225ml无菌生理盐水、9ml无菌生理盐水、双料LST肉汤，单料 LST肉汤，10ml吸管、1ml吸管、吸球
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大肠菌群数测定
• 实验步骤：
1.初发酵
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革兰氏染色阴性
革兰氏染色阳性
当前你正在浏览到的事第三十三页PPTT，共四十二页。

细菌总数与大肠菌群数测定 PPT课件

31
吸取水样
32
加注水样
33
初发酵结果
左2为阳性结果，培养基变成黄色（产酸），小倒管内有气体产生。
34
大肠菌群数测定
实验步骤 2.分离培养（1）制备伊红美蓝平板： 45 ℃，无菌，倾注，15ml （2）选产酸产气的发酵管（3）接种至伊红美蓝平板分区划线法（4）培养： 37℃，24h
பைடு நூலகம்
2019/9/16
16
八、计算
1、菌落计数及报告方法
作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。
2019/9/16
17
在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘2以代表全皿菌落数。然后再求该稀释度的平均菌落数。
倾注培养
13
（2）待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36±1℃培养箱内培养24h，进行菌落计数，即为水样1mL中的细菌总数。
2019/9/16
14
培养结果
15
（3）如果测定水源水
用灭菌吸管取2~3个适宜稀释度的水样 1mL，分别注入灭菌平皿内。以下操作同生活饮用水的检验步骤。