疏水性相互作用色谱课件

二、原理

组成蛋白质的氨基酸中包括一些疏水性氨基酸基团，如苯丙 氨酸，酪氨酸；这些基团大部分处于蛋白质内部，但有部分 疏水基团暴露于蛋白质表面。
在高离子强度盐溶液中，蛋白质表面的水化层被破坏，更多 的疏水部分暴露在外，这些暴露在外的疏水基团与介质上的 弱疏水性配基发生疏水性作用，被固定相(疏水性吸附剂)所吸 附。 被固定相吸附蛋白质在疏水性吸附剂上的分配系数随流动相 盐析盐浓度的提高而增大。 HIC采用高盐下吸附，低盐下洗脱。
疏水性吸附剂
图中a的末端氨基以及a和b的键合亚氨基显弱碱性， 在中性pH范围内带正电荷，因此，这类疏水件吸附剂除 疏水性吸附外，还可能存在静电吸附(离子交换)作用。 图中c的吸附剂利用醚键结合．不引入荷电基团，对 蛋白质仅产生疏水性吸附作用。
②破坏水化作用的物质
蛋白质疏水部位的失水有利于疏水性吸附。因此水化能力低的 物质容易作洗脱剂。 SCN－，CIO4－和I－等半径较大、表面电荷密度低，水化能力 差，这类阴离子具有减弱水分子之间相互作用。因此，这类 阴离子称为离液离子（chaotropic ion）；在离液离子存在下疏 水性吸附减弱，蛋白质易于洗脱。 盐析作用强的高价阴离子（如SO42－，HPO42－等）的作用正 好相反，称为反离液离子（antichaotropic ion）。 除离液离子外，乙二醇和丙三醇等含羟基的物质也具有影响 水化的作用，降低蛋白质的疏水性吸附作用，经常用做洗脱 促进剂 ，洗脱时疏水吸附强烈、仅靠降低盐浓度难于洗脱高 疏水性蛋白质。
蒸馏水依次洗涤，装柱，用初始缓冲液平衡吸附
剂。吸附剂经再生后可反复使用。
蛋白质的纯化过程中，各种分离技术结
合的顺序是很重要的。 疏水层析可用在沉淀步骤之后，或与 凝胶过滤、离子交换层析结合使用。
操作
1） 加样：样品溶液中补加适量的盐。
2） 洗脱：用降低盐浓度的平衡缓冲液洗脱。
3） 再生：除去固定相吸附的杂质 ，用水或
①离子强度及种类 除离子强度外，离子的种类亦影响蛋白质的 疏水性吸附。在高价阴离子的存在下，疏水 性吸附作用力较高。 HIC分离过程中主要利用硫酸铵、硫酸钠和氯 化钠等盐溶液为流动相，在略低于盐析点的 盐浓度下进料，然后逐渐降低流动相离子强 度进行洗脱分离。
一般配基修饰密度在（10～40）μmo1／ cm3之间。配基修饰密度过小则疏水性吸附作 用不足，密度过大则洗脱困难。 疏水性配基与亲水性固定相粒子之间的偶 联主要利用氨基或醚键结合，形成各种疏水性 吸附剂，其中R表示疏水配基。
为了有效地洗脱吸附剂上的生物大分子， 可以用下列的一种或几种方法： ①改换一种具有较低盐析效应的离子； ②降低离子强度； ③减弱洗脱剂的极性，也可加入乙二醇； ④用含有表面活性剂的洗脱剂； ⑤提高洗脱剂的pH。
再生
每次实验结束后，吸附剂需要再生。
因为吸附剂中尚留有结合紧密的生物大分子、 表面活性剂等。未经再生的疏水吸附剂，其吸附 容量将明显降低。 一般来说可用蒸馏水、乙醇、正丁醇、乙醇、
③表面活性剂
表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位结合，从而减 弱蛋白质的疏水性吸附。根据这一原理，难溶于水的膜蛋白 质可添加一定量的表面活性剂使其溶解，利用HIC法进行洗 脱分离。 但此时选用表面活性剂的种类和浓度应当适宜：浓度过小 则膜蛋白不溶解，过大则抑制蛋白质的吸附。
④温度
失水是吸热过程，即疏水性吸附为吸热过程，因此与一般物 质吸附相比，趋势相反，即温度越高，吸附越容易。
六、疏水性相互作用色谱的应用及特点
特点

HIC可作为IEC的补充工具。 可直接分离盐析后的蛋白质 可通过调节疏水性配基链长和密度调节HIC的吸附力 疏水性吸附剂种类多，选择余地大，价格与离子交换 剂相当
谢 谢！



盐浓过高， 沉淀不可
原理图示
Mechanism of HIC
三、疏水性吸附剂

常用配基
苯基、短链烷基、 烷氨基、聚乙二醇聚醚

修饰密度
疏水配基修饰密度一般在10~40 umol/ml
疏水性吸附作用与配基的疏水性和配基密度成 正比，故配基的修饰密度应根据配基的疏水性 而异。
四、 影响疏水性吸附的因素
8mol/L 脲素溶液 。
应用Fra Baidu bibliotek
主要用于分离纯化大分子物质。
六、疏水性相互作用色谱的应用及特点
应用
HIC主要用于蛋白质类生物大分子的分离纯化。这种方法 与IEC的离子交换作用完全不同。 它不仅是一种有效的分离纯化手段，而且还可与IEC互补短 长，分离纯化利用IEC难以分离的蛋白质。
但是，疏水性相互作用机理比较复状。吸附剂的选择和洗脱 分离条件不易掌握。
五．疏水性相互作用色谱（HIC）的操作


疏水性相互作用色谱在蛋白质的分离过程中由 于机理比较复杂，吸附剂的选择和洗脱分离条件 不易掌握所以难以取得良好的分离效果。因此， 在利用HIC 分离蛋白质的混合物时，需事先利用 各种小型预装柱进行吸附与洗脱实验，确定最佳 吸附剂和洗脱分离条件分离溶剂。 吸附生物大分子采用柱层析法，装柱和拆柱与 其他类型的柱层析法相同。 为了使要分离的生物大分子能紧密结合在柱上， 选择适当的缓冲液、pH和离子强度，也要考虑温 度因素。
疏水性相互作用色谱 (HIC)
目录
一、概念 二、原理 三、疏水性的吸附剂 四、影响疏水性吸附的因素 五、疏水性相互作用色谱的操作 六、HIC的特点及应用
疏水性相互作用色谱
一、概念
疏 水 性 相 互 作 用 色 谱 (Hydrophobic interaction chromatography ， HIC) 是利用表面偶联弱疏水性基团 ( 疏水性配 基)的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间 的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化 的洗脱层析法。