疏水性相互作用色谱课件
疏水相互作用色谱
疏水相互作用色谱
在化学里，疏水性指的是一个分子（疏水物）与水互相排斥的物理性质。举例来说，
疏水性分子包含有烷烃、油、脂肪和多数含有油脂的物质。疏水性通常也可以称为亲脂性，但这两个词并不全然是同义的。即使大多数的疏水物通常也是亲脂性的，但还是有例外，
如硅橡胶和碳氟化合物（fluorocarbon）。
疏水性分析
蛋白质肽链上各残基侧链对溶剂的相对亲水性就是一个关键的特征参量。逊于二级结
构中各残基对溶剂的相对亲水性或奏水性的性质就是逊于二级结构的一个关键结构特征。
在天然状态，形成蛋白质的亲水性氨基酸残基多数就是处于分子的内部，构成亲水性内核，从而维系蛋白质的密切三维结构。对于逊于二级结构这一局域空间结构的亲水性特性的构成，奏水性的变化规律等都就是尚待化解的问题。逊于二级结构中亲水性特性的阐明和介绍，对蛋白质肽链的卷曲规律的重新认识和预测存有一定价值。国际上一些生物学家，近
年来对这一工作积极开展了研究，并存有文献报导。首先，运用t．j．richmond和f．m．richards在年明确提出的方法对逊于二级结构中每一残基侧链对溶剂的亲水性展开排序。然后根据hubbard和blundell（）得出的帕累托展开推论。该帕累托就是国际上比较通用型的一种帕累托。如果残基侧链对溶剂相对碰触面积大于7%，那么该残基被称作奏水性的，在疏水性模式中用“i”则表示；如果残基侧链对溶剂相对碰触面积大于7%，则
表示该残基为溶剂亲水性的，在疏水性模式中用“o”则表示而立。奏水性上限值的确认
是因为当氨基酸相对溶剂碰触面积大于7%时，则亲水性质类同，几乎不变化。这样便排序出来各类型逊于二级结构单元奏水性模式。从中可以获得逊于二级结构这一段肽链上每个
第九节 疏水作用色谱
第九节疏水作用色谱
疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatography HIC)是采用具有适度疏水性的填料作为固定相,以含盐的水溶液作为流动相,利用溶质分子的疏水性质差异从而与固定相间疏水相互作用的强弱不同实现分离的色谱方法。
关于在疏水作用色谱条件下进行分离的概念最早在1948年就由Tiselius提出，该技术真正得到发展和应用是在20世纪70年代早期开发出一系列适合进行疏水作用色谱的固定相以后。此后随着新型色谱介质的开发生产和对机理认识的逐步深人，该技术得到了广泛的应用，并且随着高效疏水作用色谱介质的出现，HIC已在HPLC平台上被使用，称为高效疏水作用色谱（High performance hydrophobic interaction chromatography HP-HIC）。
由于疏水作用色谱的分离原理完全不同于离子交换色潜或凝胶过滤色谱等色谱技术，使得该技术与后两者经常被联合使用分离复杂的生物样品.目前该技术的主要应用领域是在蛋白质的纯化方面,成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。
一、疏水作用色谱基本原理
（一）疏水作用
疏水作用是一种广泛存在的作用，在生物系统中扮演着重要角色，它是球状蛋白高级结构的形成、寡聚蛋白亚基间结合、酶的催化和活性调节、生物体内一些小分子与蛋白质结合等生物过程的主要驱动力，同时也是磷脂和其他脂类共同形成生物膜双层结构并整合膜蛋白的基础.
根据热力学定律，当某个过程的自由能变化(△G）为负值时,该过程在热力学上是有利的，能够自发发生，反之则不能。而根据热力学公式
完整版第九节疏水作用色谱
第九节疏水作用色谱
疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatography HIC）是采用具有适度疏水性的填料作为固定相，以含盐的水溶液作为流动相，利用溶质分子的疏水性质差异从而与固定相间疏水相互作用的强弱不同实现分离的色谱方法。
关于在疏水作用色谱条件下进行分离的概念最早在1948年就由Tiselius提出，该技术真正得到发展和应用是在20世纪70年代早期开发出一系列适合进行疏水作用色谱的固定相以后。此后随着新型色谱介质的开发生产和对机理认识的逐步深人，该技术得到了广泛的应用，并且随着高效疏水作用色谱介质的出现，HIC 已在HPLC平台上被使用，称为高效疏水作用色谱（High performance hydrophobic interaction chromatography HP-HIC）。
由于疏水作用色谱的分离原理完全不同于离子交换色潜或凝胶过滤色谱等色谱技术，使得该技术与后两者经常被联合使用分离复杂的生物样品。目前该技术的主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。
一、疏水作用色谱基本原理
(一) 疏水作用
疏水作用是一种广泛存在的作用，在生物系统中扮演着重要角色，它是球状蛋白高级结构的形成、寡聚蛋白亚基间结合、酶的催化和活性调节、生物体内一些小分子与蛋白质结合等生物过程的主要驱动力，同时也是磷脂和其他脂类共同形成生物膜双层结构并整合膜蛋白的基础。
根据热力学定律，当某个过程的自由能变化(△G)为负值时，该过程在热力学上是有利的，能够自发发生，反之则不能。而根据热力学公式
第九节 疏水作用色谱
第九节疏水作用色谱
疏水作用色谱(Hydrophobic interaction chromatography HIC）是采用具有适度疏水性的填料作为固定相，以含盐的水溶液作为流动相，利用溶质分子的疏水性质差异从而与固定相间疏水相互作用的强弱不同实现分离的色谱方法。
关于在疏水作用色谱条件下进行分离的概念最早在1948年就由Tiselius提出，该技术真正得到发展和应用是在20世纪70年代早期开发出一系列适合进行疏水作用色谱的固定相以后.此后随着新型色谱介质的开发生产和对机理认识的逐步深人，该技术得到了广泛的应用,并且随着高效疏水作用色谱介质的出现，HIC已在HPLC平台上被使用，称为高效疏水作用色谱(High performance hydrophobic interaction chromatography HP—HIC)。
由于疏水作用色谱的分离原理完全不同于离子交换色潜或凝胶过滤色谱等色谱技术，使得该技术与后两者经常被联合使用分离复杂的生物样品。目前该技术的主要应用领域是在蛋白质的纯化方面,成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子,甚至细胞等分离时的有效手段。
一、疏水作用色谱基本原理
(一) 疏水作用
疏水作用是一种广泛存在的作用，在生物系统中扮演着重要角色，它是球状蛋白高级结构的形成、寡聚蛋白亚基间结合、酶的催化和活性调节、生物体内一些小分子与蛋白质结合等生物过程的主要驱动力，同时也是磷脂和其他脂类共同形成生物膜双层结构并整合膜蛋白的基础.
根据热力学定律，当某个过程的自由能变化（△G)为负值时，该过程在热力学上是有利的,能够自发发生,反之则不能.而根据热力学公式
药学物化课件—疏水相互作用
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2023/Biblioteka Baidu/31
第十三节 疏水相互作用
生物体内蛋白质分子不同的氨基酸排列成有序 系列，除此之外还需维持特定的构象，如螺旋、 折叠，一旦特定构象受到破坏，蛋白质就失去它 所特有的功能。维持和稳定蛋白质构象的作用力 有：静电力、氢键、范德华力和疏水相互作用。 这些都是非共价键相互作用。
疏水相互作用与其它非共价键相互作用不同， 它不是由于某对原子或两个基团的直接作用引起 的，疏水相互作用是指非极性基团有从水中逃逸 的趋势，致使非极性基团相互结合在一起。
疏水相互作用色谱
Purity & characterization
■ Purpose
• Downstream purification • Separation of biomolecuoles • Exploits differences in hydrophobicity. → Number of hydrophobic aminoacids. → Distribution of these aminoacids.
Additives
Salts that cause “salting-in” will weaken protein-ligand interactions. ‰ Alcohols and detergents (non-polar parts) can compete with protein for HIC absorbent sites and may displace proteins.
Hydrophobic interaction chromatography
Umair Saleem Methods in protein chemistry
■ Alternatives
• Gel filtration chromatography • Ion exchange chromatography • Reverse phase chromatography Why HIC? • Different basis of separation • Weaker interactions → Less structural damage → Maintain high activity
疏水作用色谱原理
疏水作用色谱原理
疏水作用色谱是一种基于样品中分子间的疏水相互作用实现分
离的色谱方法。在疏水作用色谱中，分离材料通常是一种疏水性的固定相，如碳氢化合物和硅氧化合物。这些固定相的表面上具有疏水性，可以吸附和保持疏水性分子，而使其他分子在固定相表面上滞留时间较短，从而实现分离。在疏水作用色谱中，流动相通常是一种极性溶剂，如水和乙醇。通过调节流动相中极性溶剂的比例和流速，可以实现不同分子的选择性分离。疏水作用色谱已广泛应用于多种分离领域，如生物分子分离、环境水质分析和药物分离纯化等。
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亲水作用色谱和疏水作用色谱
亲水作用色谱和疏水作用色谱
亲水作用色谱和疏水作用色谱是两种常用的分离技术，它们在化学分析、生物医药等领域中广泛应用。
亲水作用色谱（Hydrophilic Interaction Chromatography，HILIC）是一种基于样品和固定相之间亲水作用进行分离的色谱技术。在亲水作用色谱中，固定相通常采用极性的硅胶或亲水性的高性能液相色谱（HPLC）柱。亲水作用色谱适用于分离极性化合物，如极性小分子、多肽、糖类、核酸等。在亲水作用色谱中，样品溶液中的化合物与固定相之间通过氢键、静电相互作用等亲水作用进行分离。通过调节流动相的组成和pH值，可以实现对目标化合物的选择性分离。
疏水作用色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是一种基于样品和固定相之间疏水作用进行分离的色谱技术。在疏水作用色谱中，固定相通常采用疏水性的高性能液相色谱柱，如碳链（C4、C8、C18等）柱。疏水作用色谱适用于分离非极性和中等极性的化合物，如脂类、蛋白质、抗体等。在疏水作用色谱中，样品溶液中的化合物与固定相之间通过疏水作用进行分离。通过调节流动相的组成和温度，可以实现对目标化合物的选择性分离。
总的来说，亲水作用色谱和疏水作用色谱是两种互补的分离技术，可根据待分离化合物的性质选择合适的色谱方法，实现高效、精确的分析和纯化。
疏水性相互作用色谱
但是，疏水性相互作用机理比较复状。吸附剂的选择和洗脱 分离条件不易掌握。
六、疏水性相互作用色谱的应用及特点
特点
HIC可作为IEC的补充工具。 可直接分离盐析后的蛋白质 可通过调节疏水性配基链长和密度调节HIC的吸附力 疏水性吸附剂种类多，选择余地大，价格与离子交换
盐析作用强的高价阴离子（如SO42－，HPO42－等）的作用正 好相反，称为反离液离子（antichaotropic ion）。
除离液离子外，乙二醇和丙三醇等含羟基的物质也具有影响 水化的作用，降低蛋白质的疏水性吸附作用，经常用做洗脱
促进剂 ，洗脱时疏水吸附强烈、仅靠降低盐浓度难于洗脱高
疏水性蛋白质。
③表面活性剂
表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位结合，从而减 弱蛋白质的疏水性吸附。根据这一原理，难溶于水的膜蛋白 质可添加一定量的表面活性剂使其溶解，利用HIC法进行洗 脱分离。
但此时选用表面活性剂的种类和浓度应当适宜：浓度过小 则膜蛋白不溶解，过大则抑制蛋白质的吸附。
④温度
失水是吸热过程，即疏水性吸附为吸热过程，因此与一般物 质吸附相比，趋势相反，即温度越高，吸附越容易。
被固定相吸附蛋白质在疏水性吸附剂上的分配系数随流动相 盐析盐浓度的提高而增大。
HIC采用高盐下吸附，低盐下洗脱。
疏水色谱的原理和应用
疏水色谱的原理和应用
疏水色谱是利用样品分子与固定相的疏水力作用的不同，用流动相洗脱时，各组分迁移速度不同而达到分离的目的。流动相一般为pH6-8的盐水溶液，具有对蛋白质的回收率高，蛋白质变性可能性小等优势。由于流动相中不使用有机溶剂，也有利于蛋白质保持固有的活性。
疏水作用色谱是在高离子强度的条件下，蛋白质溶解度降低，易吸附在中等疏水性的填料表面。随着离子强度的降低，蛋白质的溶解度增加，逐步从柱子上洗脱下来。该法具有高分辨率及保持蛋白质生物活性的特点。
疏水作用色谱的固定相表面为弱疏水性基团，它的疏水性比反相色谱用的固定相低几十到几百倍，而流动相为高离子浓度的盐溶液。蛋白质分子在这样的固定相和流动相中进行分配，蛋白质分子上的疏水性基团和固定相的疏水基团作用而被保留。当用流动相洗脱时逐渐降低流动相的离子强度，洗脱能力增强。利用被分离组分分子表面的疏水微区、（可逆）变性后暴露出的疏水残基，或在高盐环境下暴露于分子表面的疏水残基与固定相的疏水性配体之间的作用强弱，依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水作用由弱到强的组分分离开。蛋白质分子按其疏水性大小被依次洗脱出来，疏水性小的先流出。在这样的高盐水溶液中，蛋白质不会失活。高浓度盐与水分子发生强烈作用，导致疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进疏水性分子与介质的疏水配基之间发生结合。这种疏水作用的大小取决于固定相和溶质的极性、流动相的组成和浓度。由于各种蛋白质表面氨基酸残基极性不同，因此有可能通过改变固定相的极性和流动相的组成使蛋白质得到分离。
疏水层析的原理完全不同于离子交换层析或凝胶过滤层析等技术，使该技术与后两者经常联合使用来分离复杂的生物样品。目前该技术主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。
疏水性相互作用色谱
二、原理
组成蛋白质的氨基酸中包括一些疏水性氨基酸基团，如苯丙 氨酸，酪氨酸；这些基团大部分处于蛋白质内部，但有部分 疏水基团暴露于蛋白质表面。
在高离子强度盐溶液中，蛋白质表面的水化层被破坏，更多 的疏水部分暴露在外，这些暴露在外的疏水基团与介质上的 弱疏水性配基发生疏水性作用，被固定相(疏水性吸附剂)所吸 附。 被固定相吸附蛋白质在疏水性吸附剂上的分配系数随流动相 盐析盐浓度的提高而增大。 HIC采用高盐下吸附，低盐下洗脱。
盐浓过高， 沉淀不可
原理图示
Mechanism of HIC
三、疏水性吸附剂
常用配基
苯基、短链烷基、 烷氨基、聚乙二醇聚醚
修饰密度
疏水配基修饰密度一般在10~40 umol/ml
疏水性吸附作用与配基的疏水性和配基密度成 正比，故配基的修饰密度应根据配基的疏水性 而异。
四、 影响疏水性吸附的因素
8mol/L 脲素溶液 。
应用
主要用于分离纯化大分子物质。
六、疏水性相互作用色谱的应用及特点
应用
HIC主要用于蛋白质类生物大分子的分离纯化。这种方法 与IEC的离子交换作用完全不同。 它不仅是一种有效的分离纯化手段，而且还可与IEC互补短 长，分离纯化利用IEC难以分离的蛋白质。
但是，疏水性相互作用机理比较复状。吸附剂的选择和洗脱 分离条件不易掌握。
第九节--疏水作用色谱
第九节疏水作用色谱
疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatography HIC）是采用具有适度疏水性的填料作为固定相，以含盐的水溶液作为流动相，利用溶质分子的疏水性质差异从而与固定相间疏水相互作用的强弱不同实现分离的色谱方法。
关于在疏水作用色谱条件下进行分离的概念最早在1948年就由Tiselius提出，该技术真正得到发展和应用是在20世纪70年代早期开发出一系列适合进行疏水作用色谱的固定相以后。此后随着新型色谱介质的开发生产和对机理认识的逐步深人，该技术得到了广泛的应用，并且随着高效疏水作用色谱介质的出现，HIC已在HPLC平台上被使用，称为高效疏水作用色谱（High performance hydrophobic interaction chromatography HP-HIC）。
由于疏水作用色谱的分离原理完全不同于离子交换色潜或凝胶过滤色谱等色谱技术，使得该技术与后两者经常被联合使用分离复杂的生物样品。目前该技术的主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。
一、疏水作用色谱基本原理
(一) 疏水作用
疏水作用是一种广泛存在的作用，在生物系统中扮演着重要角色，它是球状蛋白高级结构的形成、寡聚蛋白亚基间结合、酶的催化和活性调节、生物体内一些小分子与蛋白质结合等生物过程的主要驱动力，同时也是磷脂和其他脂类共同形成生物膜双层结构并整合膜蛋白的基础。
根据热力学定律，当某个过程的自由能变化(△G)为负值时，该过程在热力学上是有利的，能够自发发生，反之则不能。而根据热力学公式
第九节--疏水作用色谱
第九节疏水作用色谱
疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatography HIC）是采用具有适度疏水性的填料作为固定相，以含盐的水溶液作为流动相，利用溶质分子的疏水性质差异从而与固定相间疏水相互作用的强弱不同实现分离的色谱方法。
关于在疏水作用色谱条件下进行分离的概念最早在1948年就由Tiselius提出，该技术真正得到发展和应用是在20世纪70年代早期开发出一系列适合进行疏水作用色谱的固定相以后。此后随着新型色谱介质的开发生产和对机理认识的逐步深人，该技术得到了广泛的应用，并且随着高效疏水作用色谱介质的出现，HIC已在HPLC平台上被使用，称为高效疏水作用色谱（High performance hydrophobic interaction chromatography HP-HIC）。
由于疏水作用色谱的分离原理完全不同于离子交换色潜或凝胶过滤色谱等色谱技术，使得该技术与后两者经常被联合使用分离复杂的生物样品。目前该技术的主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。
一、疏水作用色谱基本原理
(一) 疏水作用
疏水作用是一种广泛存在的作用，在生物系统中扮演着重要角色，它是球状蛋白高级结构的形成、寡聚蛋白亚基间结合、酶的催化和活性调节、生物体内一些小分子与蛋白质结合等生物过程的主要驱动力，同时也是磷脂和其他脂类共同形成生物膜双层结构并整合膜蛋白的基础。
根据热力学定律，当某个过程的自由能变化(△G)为负值时，该过程在热力学上是有利的，能够自发发生，反之则不能。而根据热力学公式
疏水性相互作用色谱
目录
一、概念 二、原理 三、疏水性的吸附剂 四、影响疏水性吸附的因素 五、疏水性相互作用色谱的操作 六、HIC的特点及应用
疏水性相互作用色谱
一、概念
疏 水 性 相 互 作 用 色 谱 (Hydrophobic interaction chromatography，HIC)是利用表面偶联弱疏水性基团(疏水性配 基)的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间 的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化 的洗脱层析法。
被固定相吸附蛋白质在疏水性吸附剂上的分配系数随流动相 盐析盐浓度的提高而增大。
HIC采用高盐下吸附，低盐下洗脱。
盐浓过高， 沉淀不可
原理图示
Mechanism of HIC
三、疏水性吸附剂
常用配基
苯基、短链烷基、 烷氨基、聚乙二醇聚醚
修饰密度
疏水配基修饰密度一般在10~40 umol/ml 疏水性吸附作用与配基的疏水性和配基密度成 正比，故配基的修饰密度应根据配基的疏水性
它不仅是一种有效的分离纯化手段，而且还可与IEC互补短 长，分离纯化利用IEC难以分离的蛋白质。
但是，疏水性相互作用机理比较复状。吸附剂的选择和洗脱 分离条件不易掌握。
六、疏水性相互作用色谱的应用及特点
特点
HIC可作为IEC的补充工具。 可直接分离盐析后的蛋白质 可通过调节疏水性配基链长和密度调节HIC的吸附力 疏水性吸附剂种类多，选择余地大，价格与离子交换
dna 疏水相互作用色谱原理
DNA疏水相互作用色谱是一种用于分离和纯化DNA的技术，其原理基于DNA与疏水相互作用的特性。在疏水相互作用色谱中，使用了含有疏水性固定相的柱子，通过DNA分子与固定相之间的疏水作用来实现DNA的分离。
具体原理如下：
1.疏水性固定相：色谱柱填充有疏水性固定相，常用的固定相包括疏水性树脂或疏水
修饰的聚合物。这些固定相具有较强的疏水性质，能够与DNA中的疏水部分发生相互作用。
2.DNA样品加载：待分离的DNA样品通过柱子时，DNA分子中的碱基对和疏水区域
会与固定相发生疏水相互作用，从而使DNA分子滞留在色谱柱中，而非极性或疏水性较低的杂质则会迅速流过色谱柱。
3.洗脱：在DNA样品加载完成后，通过改变溶剂条件（如溶剂类型、浓度或pH 值
等），可以改变DNA与固定相之间的相互作用强度，进而实现DNA分子的逐步洗脱。
DNA疏水相互作用色谱的原理基于DNA分子的结构特性和与固定相的相互作用，通过调控疏水相互作用的强度来实现DNA的选择性吸附和洗脱分离。这种方法通常用于分离DNA的不同构象或大小，以及用于DNA的富集和纯化等应用。
(完整版)第九节疏水作用色谱
第九节疏水作用色谱
疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatography HIC）是采用具有适度疏水性的填料作为固定相，以含盐的水溶液作为流动相，利用溶质分子的疏水性质差异从而与固定相间疏水相互作用的强弱不同实现分离的色谱方法。
关于在疏水作用色谱条件下进行分离的概念最早在1948年就由Tiselius提出，该技术真正得到发展和应用是在20世纪70年代早期开发出一系列适合进行疏水作用色谱的固定相以后。此后随着新型色谱介质的开发生产和对机理认识的逐步深人，该技术得到了广泛的应用，并且随着高效疏水作用色谱介质的出现，HIC已在HPLC平台上被使用，称为高效疏水作用色谱（High performance hydrophobic interaction chromatography HP-HIC）。
由于疏水作用色谱的分离原理完全不同于离子交换色潜或凝胶过滤色谱等色谱技术，使得该技术与后两者经常被联合使用分离复杂的生物样品。目前该技术的主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。
一、疏水作用色谱基本原理
(一) 疏水作用
疏水作用是一种广泛存在的作用，在生物系统中扮演着重要角色，它是球状蛋白高级结构的形成、寡聚蛋白亚基间结合、酶的催化和活性调节、生物体内一些小分子与蛋白质结合等生物过程的主要驱动力，同时也是磷脂和其他脂类共同形成生物膜双层结构并整合膜蛋白的基础。
根据热力学定律，当某个过程的自由能变化(△G)为负值时，该过程在热力学上是有利的，能够自发发生，反之则不能。而根据热力学公式
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二、原理
组成蛋白质的氨基酸中包括一些疏水性氨基酸基团，如苯丙 氨酸，酪氨酸；这些基团大部分处于蛋白质内部，但有部分 疏水基团暴露于蛋白质表面。
在高离子强度盐溶液中，蛋白质表面的水化层被破坏，更多 的疏水部分暴露在外，这些暴露在外的疏水基团与介质上的 弱疏水性配基发生疏水性作用，被固定相(疏水性吸附剂)所吸 附。 被固定相吸附蛋白质在疏水性吸附剂上的分配系数随流动相 盐析盐浓度的提高而增大。 HIC采用高盐下吸附，低盐下洗脱。
疏水性吸附剂
图中a的末端氨基以及a和b的键合亚氨基显弱碱性， 在中性pH范围内带正电荷，因此，这类疏水件吸附剂除 疏水性吸附外，还可能存在静电吸附(离子交换)作用。 图中c的吸附剂利用醚键结合．不引入荷电基团，对 蛋白质仅产生疏水性吸附作用。
②破坏水化作用的物质
蛋白质疏水部位的失水有利于疏水性吸附。因此水化能力低的 物质容易作洗脱剂。 SCN－，CIO4－和I－等半径较大、表面电荷密度低，水化能力 差，这类阴离子具有减弱水分子之间相互作用。因此，这类 阴离子称为离液离子（chaotropic ion）；在离液离子存在下疏 水性吸附减弱，蛋白质易于洗脱。 盐析作用强的高价阴离子（如SO42－，HPO42－等）的作用正 好相反，称为反离液离子（antichaotropic ion）。 除离液离子外，乙二醇和丙三醇等含羟基的物质也具有影响 水化的作用，降低蛋白质的疏水性吸附作用，经常用做洗脱 促进剂 ，洗脱时疏水吸附强烈、仅靠降低盐浓度难于洗脱高 疏水性蛋白质。
蒸馏水依次洗涤，装柱，用初始缓冲液平衡吸附
剂。吸附剂经再生后可反复使用。
蛋白质的纯化过程中，各种分离技术结
合的顺序是很重要的。 疏水层析可用在沉淀步骤之后，或与 凝胶过滤、离子交换层析结合使用。
操作
1） 加样：样品溶液中补加适量的盐。
2） 洗脱：用降低盐浓度的平衡缓冲液洗脱。
3） 再生：除去固定相吸附的杂质 ，用水或
①离子强度及种类 除离子强度外，离子的种类亦影响蛋白质的 疏水性吸附。在高价阴离子的存在下，疏水 性吸附作用力较高。 HIC分离过程中主要利用硫酸铵、硫酸钠和氯 化钠等盐溶液为流动相，在略低于盐析点的 盐浓度下进料，然后逐渐降低流动相离子强 度进行洗脱分离。
一般配基修饰密度在（10～40）μmo1／ cm3之间。配基修饰密度过小则疏水性吸附作 用不足，密度过大则洗脱困难。 疏水性配基与亲水性固定相粒子之间的偶 联主要利用氨基或醚键结合，形成各种疏水性 吸附剂，其中R表示疏水配基。
为了有效地洗脱吸附剂上的生物大分子， 可以用下列的一种或几种方法： ①改换一种具有较低盐析效应的离子； ②降低离子强度； ③减弱洗脱剂的极性，也可加入乙二醇； ④用含有表面活性剂的洗脱剂； ⑤提高洗脱剂的pH。
再生
每次实验结束后，吸附剂需要再生。
因为吸附剂中尚留有结合紧密的生物大分子、 表面活性剂等。未经再生的疏水吸附剂，其吸附 容量将明显降低。 一般来说可用蒸馏水、乙醇、正丁醇、乙醇、
③表面活性剂
表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位结合，从而减 弱蛋白质的疏水性吸附。根据这一原理，难溶于水的膜蛋白 质可添加一定量的表面活性剂使其溶解，利用HIC法进行洗 脱分离。 但此时选用表面活性剂的种类和浓度应当适宜：浓度过小 则膜蛋白不溶解，过大则抑制蛋白质的吸附。
④温度
失水是吸热过程，即疏水性吸附为吸热过程，因此与一般物 质吸附相比，趋势相反，即温度越高，吸附越容易。
六、疏水性相互作用色谱的应用及特点
特点
HIC可作为IEC的补充工具。 可直接分离盐析后的蛋白质 可通过调节疏水性配基链长和密度调节HIC的吸附力 疏水性吸附剂种类多，选择余地大，价格与离子交换 剂相当
谢 谢！
盐浓过高， 沉淀不可
原理图示
Mechanism of HIC
三、疏水性吸附剂
常用配基
苯基、短链烷基、 烷氨基、聚乙二醇聚醚
修饰密度
疏水配基修饰密度一般在10~40 umol/ml
疏水性吸附作用与配基的疏水性和配基密度成 正比，故配基的修饰密度应根据配基的疏水性 而异。
四、 影响疏水性吸附的因素
8mol/L 脲素溶液 。
应用Fra Baidu bibliotek
主要用于分离纯化大分子物质。
六、疏水性相互作用色谱的应用及特点
应用
HIC主要用于蛋白质类生物大分子的分离纯化。这种方法 与IEC的离子交换作用完全不同。 它不仅是一种有效的分离纯化手段，而且还可与IEC互补短 长，分离纯化利用IEC难以分离的蛋白质。
但是，疏水性相互作用机理比较复状。吸附剂的选择和洗脱 分离条件不易掌握。
五．疏水性相互作用色谱（HIC）的操作
疏水性相互作用色谱在蛋白质的分离过程中由 于机理比较复杂，吸附剂的选择和洗脱分离条件 不易掌握所以难以取得良好的分离效果。因此， 在利用HIC 分离蛋白质的混合物时，需事先利用 各种小型预装柱进行吸附与洗脱实验，确定最佳 吸附剂和洗脱分离条件分离溶剂。 吸附生物大分子采用柱层析法，装柱和拆柱与 其他类型的柱层析法相同。 为了使要分离的生物大分子能紧密结合在柱上， 选择适当的缓冲液、pH和离子强度，也要考虑温 度因素。
疏水性相互作用色谱 (HIC)
目录
一、概念 二、原理 三、疏水性的吸附剂 四、影响疏水性吸附的因素 五、疏水性相互作用色谱的操作 六、HIC的特点及应用
疏水性相互作用色谱
一、概念
疏 水 性 相 互 作 用 色 谱 (Hydrophobic interaction chromatography ， HIC) 是利用表面偶联弱疏水性基团 ( 疏水性配 基)的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间 的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化 的洗脱层析法。