大肠杆菌感受态细胞
大肠杆菌热击感受态细胞的制备、注意事项和转化
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
大肠杆菌感受态细胞制备的原理:
大肠杆菌自然条件下很难进行转化,其主要原因是转化因子的吸收较为困难。在转化实验中,通常先采用人工的方法制备感受态细胞,代表性的方法之一是Ca2+诱导法.感受态形成后,细胞生理状态会发生改变,出现各种蛋白质和酶,负责供体DNA的结合和加工等.细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来的DNA分子的受体位点等。
Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化:
①在0℃的CaCl2低渗溶液中,细菌细胞发生膨胀,同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构,促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,诱导大肠杆菌形成感受态。
②Ca2+能与加入的DNA分子结合,形成抗DNA酶(DNase)的羟基—磷酸钙复合物,并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时,细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动,并随之出现许多间隙,为DNA分子提供了进入细胞的通道。
一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E。coli DH5α单菌落,接种于3—5ml LB
液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100—1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 =0.5左右。(OD600值在0.4到0.6之间)二、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L 的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15—30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。4、感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于—80℃可保存半年。
大肠杆菌感受态细胞的转化方法
一、概述
大肠杆菌是一种常见的微生物细菌,广泛存在于自然界中。而大肠杆菌感受态细胞的转化方法,是一项重要的研究课题。本文旨在探讨大肠杆菌感受态细胞的转化方法,以期为相关领域的学者和研究人员提供参考。
二、大肠杆菌感受态细胞的定义
大肠杆菌感受态细胞是指能够接受外源DNA并进行转化的大肠杆菌细胞。在细菌转化的过程中,外源DNA能够通过不同的方式导入大肠杆菌感受态细胞内,并且在某种条件下,使其获得新的遗传信息,从而表现出与原有菌株不同的性状。
三、大肠杆菌感受态细胞的转化方法
1. 热激转化方法
热激转化方法是将需要转化的大肠杆菌细胞与外源DNA在高温条件下共培养,利用高温使大肠杆菌细胞的细胞壁变得松弛,使外源DNA能够顺利进入细胞内。然后在低温下将其复性,并引起DNA与细胞的内合作用,最终实现外源DNA的转化。
2. 电穿孔法
电穿孔法是通过将大肠杆菌感受态细胞暴露在高电场中,在电场作用力下使细胞膜发生孔道破裂,从而使外源DNA顺利进入细胞内,实现转化。
3. 化学法
化学法是使用化学物质(如钙离子、聚乙二醇等)处理大肠杆菌感受
态细胞,使细胞膜通透性提高,从而使外源DNA得以顺利进入细胞内,实现转化。
4. 冷冻法
冷冻法是将需要转化的大肠杆菌感受态细胞与外源DNA共同置于冰冻条件下进行培养,利用冰冻条件下细胞膜通透性增加,使外源DNA能够进入细胞内,最终实现转化。
5. 基因枪法
基因枪法是利用基因枪将外源DNA通过高速微粒轰击的方式,直接送入大肠杆菌感受态细胞内,从而实现转化。
6. 瞬时脉冲法
瞬时脉冲法是利用高压脉冲将外源DNA导入大肠杆菌感受态细胞内,通过瞬时压力使细胞膜通透性增加,从而使外源DNA能够进入细胞内,实现转化。
大肠杆菌感受态细胞的制备方法
大肠杆菌感受态细胞的制备步骤:
1.划线,出单菌落。
2.挑取单菌落,接种于5ml psI液体培养基中(试管),37℃振荡培养12h左右,直至对数生长后期。
3.转接,取菌悬液以1%的比例接种于100ml psI液体培养基中,37℃振荡培养2-3h至OD600=0.5左右。。
4.OD值达到后,取下摇瓶冰上放置20min。
5.将培养液转入50ml离心管中,4℃,5000rpm,离心10min。
6.弃上清,用0.4倍体积冰冷的溶液I轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30min后,4℃下5000rpm 离心10min。
7.弃上清,加入0.04倍体积的溶液II,轻轻悬浮细胞,冰上放置15min,即成感受态细胞悬液。
8.感受态细胞分装成100μl的小份,贮存于-80℃。
溶液与试剂
1.psI培养基配制:
酵母提取物5g,胰蛋白胨20g,MgSO4 7H2O 5g,定容至1000ml,用KOH调pH=7.6 2.溶液I配制:
将5g RbCl,1M KAc 12.3ml,1M CaCl2 4.1ml,1M MnCl2 20.5ml,61.5ml甘油混匀,用0.1M乙酸调pH=5.8,加水定容至410ml。过滤除菌。
3.溶液II配制:
将1M Mops 1.5ml,1M CaCl2 11.25ml,1M RbCl 1.5ml,22.5ml甘油混合均匀后,1M KOH 调pH=6.5,加超纯水定容至150ml,过滤除菌。
大肠杆菌感受态细胞得制备原理、步骤以及重组质粒转化
一、目得
1、了解感受态细胞生理特性及制备条件,掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2、掌握质粒DNA 转化大肠杆菌得方法,了解转化得条件与利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 得原理。
二、原理
(一)大肠杆菌感受态细胞制备得原理
所谓感受态,就是指细菌生长过程中得某一阶段得培养物,只有某一生长阶段中得细菌才能作为转化得受体,能接受外源DNA而不将其降解得生理状态。感受态形成后,细胞生理状态会发生改变,出现各种蛋白质与酶,负责供体DNA 得结合与加工等。细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来得DNA 分子得受体位点等。本实验为了把外源DNA(重组质粒)引入大肠杆菌,就必须先制备能吸收外来DNA分子
得感受态细胞。在细菌中,能发生感受态细胞就是占极少数。而且,细菌得感受态就是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子得本质瞧法不一。主要有两种假说:
1、局部原生质体化假说――细胞表面得细胞壁结构发生变化,即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁,使DNA 分子能通过质膜进细胞。证据有:
(1)发芽得芽孢杆菌容易转化;
(2)大肠杆菌得原生质体不能被噬菌体感染,却能受噬菌体DNA 转化;
(3)适量得溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞得表面形成一种能接受DNA 得酶位点,使DNA分子能进入细胞。证据就是:(1)蛋白质合成得抑制剂如氯霉素,可以抑制转化作用;
(2)细胞分裂过程中,一直有局部原生质化,但感受态只在生长对数期得中早期出现;
(3)分离到感受态因子,能使非感受态细胞转变为感受细胞。
大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)实验目的
1.掌握
大肠杆菌感受态细胞的制备方法。
2.了解
大肠杆菌感受态细胞的生理特性和制备原理。
实验原理
受体或宿主细胞容易接受外源DNA的状态称为感受态,通过物理或化学的方法,人工诱导细胞成为敏感的感受态细胞,以便外源DNA 进入,从而实现外源DNA在宿主细胞内大量复制和表达。在低温、低浓度CaCl2的作用下,大肠杆菌细胞膜的磷脂双分子层形成液晶结构,细胞外膜和细胞内膜间隙中的部分核酸酶解离,细胞膜的通透性增加,此时大肠杆菌成为感受态细胞。
实验器材
高温高压灭菌锅、超净工作台、牙签、移液器、移液器吸头、离心管、离心管架、EP管、恒温摇床、恒温培养箱、三角瓶、培养皿、离心机、制冰机等。
实验试剂
(1)培养基:LB,LA。
(2)溶液:10%甘油+0.1mol/L CaCl2溶液,0.08mol/L
MgCl2+0.02mol/L CaCl2溶液。
(3)菌株:E.coli DH5α。
实验操作
(1)用灭菌的牙签蘸取少量E.coli DH5α菌液划线接种于LA 培养基上,放在恒温培养箱37℃培养后,挑取单菌落接种于10ml LB 培养基中,于37℃摇床、200rpm过夜培养。
(2)按1∶100的接种比例将过夜培养的菌液转接至100~200ml 的LB培养基中,于37℃摇床、200rpm培养3~4h,使菌液的OD600达到0.6~0.8。
(3)冰浴菌液30min,同时将灭菌过的离心管、移液器吸头、“10%甘油+0.1mol/L CaCl2”溶液等放进冰箱预冷,在超净工作台中将菌液分装到预冷的50ml的离心管中,于4℃离心机中4000rpm离心
大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法
大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法
感受态细胞(Competent cells) :常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA,所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl,RuCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许多有外源DNA 的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
转化:是将异源DNA分子引入一细胞株系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段,是基因工程等研究领域的基本实验技术。进入细胞的DNA分子通过复制表达,才能实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
α-互补现象:因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息,编码α-互补肽,该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补(α-互补)。当这种载体转入可编码?-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时,在异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下,宿主可同时合成这两种肽段,虽然它们各自都没有酶活性,但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为α-互补现象。由互补产生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落,所以利用这个特点,在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点,当插入一个外源DNA片段时,会造成LacZ(α)基因的失活,破坏α-互补作用,就不能产生具有活性的酶。所以,有重组质粒的菌落为白色,而没有重组质粒的菌落为蓝色。
大肠杆菌感受态细胞的制备原理步骤以及重组质粒转化
大肠杆菌感受态细胞的制备原理步骤以及重组质粒转化
一、目的
1.了解感受态细胞生理特性及制备条件,掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法,了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理
(一)大肠杆菌感受态细胞制备的原理
所谓感受态,是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物,只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体,能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后,细胞生理状态会发生改变,出现各种蛋白质和酶,负责供体DNA 的结合和加工等。细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。本实验为了把外源DNA(重组质粒)引入大肠杆菌,就必须先制备能吸收外来DNA分子
的感受态细胞。在细菌中,能发生感受态细胞是占极少数。而且,细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。主要有两种假说:1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化,即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁,使DNA 分子能通过质膜进细胞。证据有:
(1)发芽的芽孢杆菌容易转化;
(2)大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染,却能受噬菌体DNA 转化;
(3)适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点,使DNA 分子能进入细胞。证据是:(1)蛋白质合成的抑制剂如氯霉素,可以抑制转化作用;
(2)细胞分裂过程中,一直有局部原生质化,但感受态只在生长
对数期的中早期出现;
大肠杆菌热击感受态细胞的制备、注意事项和转化
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
大肠杆菌感受态细胞制备的原理:
大肠杆菌自然条件下很难进行转化,其主要原因是转化因子的吸收较为困难。在转化实验中,通常先采用人工的方法制备感受态细胞,代表性的方法之一是Ca2+诱导法.感受态形成后,细胞生理状态会发生改变,出现各种蛋白质和酶,负责供体DNA的结合和加工等。细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来的DNA分子的受体位点等。
Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化:
①在0℃的CaCl2低渗溶液中,细菌细胞发生膨胀,同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构,促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,诱导大肠杆菌形成感受态.
②Ca2+能与加入的DNA分子结合,形成抗DNA酶(DNase)的羟基—磷酸钙复合物,并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时,细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动,并随之出现许多间隙,为DNA分子提供了进入细胞的通道。
一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E。coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2—3小时至OD600 =0.5左右。(OD600值在0。4到0。6之间)二、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15—30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。4、感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-80℃可保存半年。
大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法
大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法
感受态细胞(Competent cells) :常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA,所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl,RuCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许多有外源DNA 的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
转化:是将异源DNA分子引入一细胞株系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段,是基因工程等研究领域的基本实验技术。进入细胞的DNA分子通过复制表达,才能实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
α-互补现象:因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息,编码α-互补肽,该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补(α-互补)。当这种载体转入可编码?-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时,在异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下,宿主可同时合成这两种肽段,虽然它们各自都没有酶活性,但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为α-互补现象。由互补产生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落,所以利用这个特点,在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点,当插入一个外源DNA片段时,会造成LacZ(α)基因的失活,破坏α-互补作用,就不能产生具有活性的酶。所以,有重组质粒的菌落为白色,而没有重组质粒的菌落为蓝色。
大肠杆菌热击感受态细胞的制备、注意事项和转化
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
大肠杆菌感受态细胞制备的原理:
大肠杆菌自然条件下很难进行转化,其主要原因是转化因子的吸收较为困难。在转化实验中,通常先采用人工的方法制备感受态细胞,代表性的方法之一是Ca2+诱导法。感受态形成后,细胞生理状态会发生改变,出现各种蛋白质和酶,负责供体DNA的结合和加工等。细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来的DNA分子的受体位点等。
Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化:
①在0℃的CaCl2低渗溶液中,细菌细胞发生膨胀,同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构,促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,诱导大肠杆菌形成感受态。
②Ca2+能与加入的DNA分子结合,形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物,并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时,细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动,并随之出现许多间隙,为DNA分子提供了进入细胞的通道。
一、受体菌的培养
从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 =0.5左右。(OD600值在0.4到0.6之间)
二、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
大肠杆菌感受态细胞的制备与重组质粒的转化目的1了解感受态
大肠杆菌感受态细胞的制备与重组质粒的转化
一、目的
1.了解感受态细胞生理特性及制备条件,掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法,了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理
(一)大肠杆菌感受态细胞制备的原理
所谓感受态,是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物,只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体,能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后,细胞生理状态会发生改变,出现各种蛋白质和酶,负责供体DNA 的结合和加工等。细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来的D NA 分子的受体位点等。本实验为了把外源DNA(重组质粒)引入大肠杆菌,就必须先制备能吸收外来D NA分子
的感受态细胞。在细菌中,能发生感受态细胞是占极少数。而且,细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。主要有两种假说:
1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化,即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁,使DNA 分子能通过质膜进细胞。证据有:
(1)发芽的芽孢杆菌容易转化;
(2)大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染,却能受噬菌体DNA 转化;
(3)适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点,使DNA分子能进入细胞。证据是:(1)蛋白质合成的抑制剂如氯霉素,可以抑制转化作用;
(2)细胞分裂过程中,一直有局部原生质化,但感受态只在生长对数期的中早期出现;
(3)分离到感受态因子,能使非感受态细胞转变为感受细胞。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌(Escherichia coli)是一种常见的细菌,广泛应用于生物技术领域。在生物技术中,大肠杆菌感受态细胞的制备是非常重要的一步。感受态细胞是指细胞表面有特定的受体,能够感受到外界的信号,从而引发细胞内的反应。下面将介绍大肠杆菌感受态细胞的制备方法。
1. 菌株的选择
首先需要选择适合的大肠杆菌菌株。常用的菌株有DH5α、BL21等。这些菌株具有较高的转化效率和稳定性,适合用于感受态细胞的制备。
2. 受体的构建
感受态细胞的制备需要构建受体。受体是一种蛋白质,能够与外界的信号分子结合,从而引发细胞内的反应。常用的受体有蛋白激酶、离子通道等。构建受体需要进行基因克隆、表达、纯化等步骤。
3. 质粒的构建
构建受体需要使用质粒。质粒是一种环状DNA分子,能够在细胞内自主复制。常用的质粒有pET、pGEX等。构建质粒需要进行基因克隆、转化、筛选等步骤。
4. 细胞的转化
将构建好的质粒转化到大肠杆菌中。转化是指将外源DNA导入到细胞内,使其表达外源蛋白。转化需要进行化学转化、电转化等步骤。
5. 细胞的培养
转化后的细胞需要进行培养。培养条件包括温度、氧气、营养物质等。培养时间需要根据不同的实验目的进行调整。
6. 受体的表达和纯化
经过培养后,细胞内的受体会被表达出来。为了得到纯净的受体,需要进行蛋白质纯化。常用的纯化方法有亲和层析、离子交换层析等。
7. 受体的功能验证
得到纯净的受体后,需要进行功能验证。功能验证是指验证受体是否能够与外界的信号分子结合,并引发细胞内的反应。常用的功能验证方法有荧光共振能量转移(FRET)、酶联免疫吸附实验(ELISA)等。
大肠杆菌感受态细胞
4) 检出转化体和计算转化率
统计每个培养皿中的菌落数,各实验组 培养皿内菌落生长状况应如表所示:
各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析
组
转化实验组
含抗菌素的平板
白色菌落和少量 蓝色菌落 无菌落或极少量 白色菌落 蓝色菌落
结果说明
说明有重组质粒导入细 胞中(有时还需要酶切 进一步鉴定〕 说明插入片段比较纯或 有少量模板DNA存在 可以判断感受态细胞的 效率
转化(transformation): 是将异源 DNA分子引入一细胞株系,使受体细 胞获得新的遗传性状的一种手段,是基因工程 等研究领域的基本实验技术。
进入细胞的DNA分子通过复制表达,才能实现 遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性 状。转化过程所用的受体细胞一般是限制-修 饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和 甲基化酶的突变株。
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插入DNA片 段对照组 质粒对照组
预冷CaCl2溶液(0.1mol/L)
4.操作步骤
1)大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
( 1 )从新活化的 E.coli DH5α 菌平板上挑取 一单菌落,接种于 3 ~ 5ml LB 液体培养中, 37℃ 振荡培养 12h 左右,直至对数生长期。 将该菌悬液以1:100~1:50转接于100ml LB液 体培养基中, 37℃ 振荡扩大培养,当培养液 开 始 出 现 混 浊 后 , 每 隔 20 ~ 30min 测 一 次 OD600nm,至OD600nm≤0.5时停止培养;
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项1、感受态细胞的概念
重组DNA分子体外构建完成后必须导入特定的宿主(受体细胞)使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中,转化是一个较普遍的现象,在细胞间转化是否发生,一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系,另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。所谓的感受态:即指受体或者宿主最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态,是由受体菌的遗传性状所决定的同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍,而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存有效期6
2、转化的概念及原理
在基因克隆技术中,转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验
,如电击法、CaCl2等化学试剂法处理后,使细胞膜的通透性发生变化,成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。大肠杆菌的转化常用化学法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃CaCl2的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促使细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增值,被转化的细菌中重组子中基因得到表达,在选择性培养基平板上可选出所需的转化子。Ca2+处理的感受态细胞其转化率一般能达到5×
大肠杆菌感受态细胞的制备注意事项
大肠杆菌感受态细胞的制备注意事项
一、引言
大肠杆菌感受态细胞是一种重要的实验材料,用于研究细胞信号转导等生物学问题。制备感受态细胞需要注意许多事项,本文将从实验前的准备、菌种的选取、培养条件的控制、质量检测等方面进行详细阐述。
二、实验前的准备
1. 实验室环境要保持干净卫生,避免灰尘和异味对实验产生影响。
2. 实验器具和试剂要提前清洗消毒,确保无菌状态。
3. 实验人员要做好个人卫生,穿上实验服和手套,并进行必要的消毒处理。
三、菌种的选取
1. 选择适合自己实验目的和条件的大肠杆菌品种。
2. 选择优质的菌株,如DH5α或BL21(DE3)等常用品种。
3. 菌株应该保存在低温下,并定期检测其纯度和活性。
四、培养条件的控制
1. 培养基应该选择适合大肠杆菌生长和表达蛋白质所需营养物质组成的培养基。
2. 培养温度、pH值、氧气含量等条件应该根据不同的菌株和实验目的进行调整。
3. 需要注意的是,大肠杆菌感受态细胞的制备需要进行诱导,诱导剂
类型、浓度和时间等参数也需要进行优化。
五、质量检测
1. 感受态细胞的制备应该进行一系列质量检测,包括蛋白质表达水平、纯度和活性等方面。
2. 蛋白质表达水平可以通过Western blot或SDS-PAGE等方法进行
检测。
3. 纯度可以通过蛋白质纯化和质谱分析等方法进行检测。
4. 活性可以通过生物活性实验或酶活性分析等方法进行检测。
六、其他注意事项
1. 实验过程中要保持细心、耐心和严谨,避免操作失误影响实验结果。
2. 实验数据应该记录详细并及时处理,避免数据丢失或混乱。
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化
一、目的
1.了解感受态细胞生理特性及制备条件,掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法,了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理
〔一〕大肠杆菌感受态细胞制备的原理
所谓感受态,是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物,只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体,能承受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后,细胞生理状态会发生改变,出现各种蛋白质和酶,负责供体DNA 的结合和加工等。细胞外表正电荷增加,通透性增加,形成能承受外来的DNA 分子的受体位点等。本实验为了把外源DNA〔重组质粒〕引入大肠杆菌,就必须先制备能吸收外来DNA分子
的感受态细胞。在细菌中,能发生感受态细胞是占极少数。而且,细菌的感受态是在短暂时间发生。
目前对感受态细胞能承受外来DNA 分子的本质看法不一。主要有两种假说:
1、局部原生质体化假说――细胞外表的细胞壁构造发生变化,即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁,使DNA 分子能通过质膜进细胞。证据有:
〔1〕发芽的芽孢杆菌容易转化;
〔2〕大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染,却能受噬菌体DNA 转化;
〔3〕适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的外表形成一种能承受DNA 的酶位点,使DNA分子能进入细胞。证据是:〔1〕蛋白质合成的抑制剂如氯霉素,可以抑制转化作用;
〔2〕细胞分裂过程中,一直有局部原生质化,但感受态只在生长对数期的中早期出现;〔3〕别离到感受态因子,能使非感受态细胞转变为感受细胞。
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转化(transformation): 转化( ) 是将异源DNA分子引入一细胞株系, 使受体细 分子引入一细胞株系, 是将异源 分子引入一细胞株系 胞获得新的遗传性状的一种手段, 胞获得新的遗传性状的一种手段 , 是基因工程 等研究领域的基本实验技术。 等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达,才能实现 分子通过复制表达, 进入细胞的 分子通过复制表达 遗传信息的转移, 遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性 转化过程所用的受体细胞一般是限制- 状。转化过程所用的受体细胞一般是限制-修 饰系统缺陷的变异株, 饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和 甲基化酶的突变株。 甲基化酶的突变株。
3) 平板培养(有时需要稀释) 平板培养(有时需要稀释)
(1)取各样品培养液 取各样品培养液0.1ml,分别接种于 取各样品培养液 , 含抗菌素LB 平板培养基上 , 涂匀 含抗菌素 如果用玻璃棒涂抹, ( 如果ຫໍສະໝຸດ Baidu玻璃棒涂抹 , 酒精灯烧过 后稍微凉一下再用,不要过烫) 后稍微凉一下再用,不要过烫)。
2)细胞转化 )
(1) 分别取3个100µl感受态细胞悬液 如是冷 分别取 个 感受态细胞悬液(如是冷 感受态细胞悬液 冻保存液, 冻保存液,则需化冻后马上进行下面的操 重组质粒DNA(体 作),第一组,加入 µl重组质粒 ,第一组,加入10 重组质粒 体 积不超过10µl)+ 100µl感受态细胞,此管为 感受态细胞, 积不超过 感受态细胞 转化实验组。第二组,插入DNA片段对照 转化实验组。第二组,插入 片段对照 组,即酶切后DNA片段 即酶切后 片段25ng+100µl感受态 感受态 片段 细胞悬液;第三组,质粒DNA对照组,即 对照组, 细胞悬液;第三组,质粒 对照组 1ng 未酶切 未酶切pBluescript 质粒 质粒DNA十100µl感 十 感 受态细胞悬液。 受态细胞悬液。
由互补产生的β 半乳糖苷酶( Z)能够作 由互补产生的β-半乳糖苷酶(LacZ)能够作 用于生色底物5 吲哚- 用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β- 半乳糖苷(X gal)而产生蓝色的菌落 (X而产生蓝色的菌落, D-半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落,所 以利用这个特点, 以利用这个特点,在载体的该基因编码序列 之间人工放入一个多克隆位点, 之间人工放入一个多克隆位点,当插入一个 外源DNA片段时, DNA片段时 Z(α 基因的失活, 外源DNA片段时,会造成LacZ(α)基因的失活, 破坏α 互补作用 就不能产生具有活性的酶。 互补作用, 破坏α-互补作用,就不能产生具有活性的酶。 所以,有重组质粒的菌落为白色, 所以,有重组质粒的菌落为白色,而没有重 组质粒的菌落为蓝色。 组质粒的菌落为蓝色。
大肠杆菌感受态细胞的制备、 大肠杆菌感受态细胞的制备、 重组DNA的转化、克隆筛选 的转化、 重组 的转化
1. 实验目的和要求
通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆 菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受 菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受 体菌细胞的技术以及筛选转化体的技 术。了解细胞转化的概念及其在分子 生物学研究中的意义。 生物学研究中的意义。
转入2ml离心管 ( 2)每组取培养液 个 2ml转入 ) 每组取培养液3个 转入 离心管 在冰上冷却20-30min, 于 4℃ , 4000r 中 , 在冰上冷却 , ℃ 离心10min(从这一步开始 , 所有操 / min离心 离心 ( 从这一步开始, 作均在冰上进行,速度尽量快而稳) 作均在冰上进行,速度尽量快而稳); (3)倒净上清培养液,用1ml冰冷的 0.1mo1/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰浴; 溶液轻轻悬浮细胞,冰浴; / 离心10min; (4)0~4℃,4000r/min离心 ) ~ ℃ / 离心 ; (5)弃去上清液,加入500µl冰冷的 0.1mo1/ L CaCl2溶液 , 小心悬浮细胞 。 溶液, / 溶液 小心悬浮细胞。 0~4℃,4000r/min离心 离心10min; ~ ℃ / 离心 ;
(2) 菌液完全被培养基吸收后,倒置培养皿, 菌液完全被培养基吸收后,倒置培养皿, 小时), 于37℃恒温培养箱内培养过夜 ℃恒温培养箱内培养过夜(12-16小时 , 小时 待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养, 待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养, 对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说, 对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说,此 时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。 时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。 法制备的感受态细胞, 用 CaCl2法制备的感受态细胞,可使每微克 产生5× 超螺旋质粒 DNA产生 ×106-2×107个转化菌 产生 × 在实际工作中,每微克有10 落。在实际工作中,每微克有 5以上的转 化菌落足以满足一般的克隆实验。 化菌落足以满足一般的克隆实验。
4.操作步骤 .
1)大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法) )大肠杆菌感受态细胞的制备
( 1)从新活化的 ) 从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取 菌平板上挑取 一单菌落,接种于3~ 液体培养中, 一单菌落 , 接种于 ~ 5ml LB液体培养中, 液体培养中 37℃ 振荡培养12h左右 , 直至对数生长期。 ℃ 振荡培养 左右, 直至对数生长期 。 左右 将该菌悬液以1:100~1:50转接于 转接于100ml LB液 将该菌悬液以 ~ 转接于 液 体培养基中, ℃ 振荡扩大培养, 体培养基中 , 37℃振荡扩大培养 , 当培养液 隔20 开始出 现混浊 后 , 每 隔 ~ 30min 测 一次 OD600nm,至OD600nm≤0.5时停止培养; 时停止培养; , 时停止培养
转化的方法: 转化的方法: 1. 化学的方法 热击法);使用化学试剂(如 化学的方法(热击法 ;使用化学试剂( 热击法 CaCl)制备的感受态细胞,通过热击处 )制备的感受态细胞, 理将载体DNA分子导入受体细胞; 分子导入受体细胞; 理将载体 分子导入受体细胞 2. 电转化法:使用低盐缓冲液或水洗制备的 电转化法: 感受态细胞, 感受态细胞,通过高压脉冲的作用将载体 DNA分子导入受体细胞。 分子导入受体细胞。 分子导入受体细胞
重组DNA转化细菌过 重组DNA转化细菌过 DNA 程示意图
3.仪器、材料和试剂 .仪器、
无菌超净台,电热恒温水浴,分光光度计, 无菌超净台,电热恒温水浴,分光光度计,离心 移液器,微型离心管等; 机,移液器,微型离心管等; 菌株: DH5 菌株:E.coli DH5α 质粒: 质粒:pBluscript KS+DNA 片段的重组质粒以 空质粒; 及pBluscript KS 空质粒; LB培养基;含抗菌素的LB平板培养基 LB培养基;含抗菌素的LB平板培养基(氨苄青霉 培养基 LB平板培养基( 浓度50 100µg mL, 5020- 48µg/ml, 素 , 浓度 50 - 100 g / mL , X - gal 20 - 48 g/ml, g/ml。 IPTG 100 µg/ml。一般将抗生素、X-gal和IPTG g/ml 一般将抗生素、 gal和 配制成1000 储备液, 1000× 配制成 1000 × 储备液 , 用时按培养基的量再加 入); 预冷CaCl 溶液( mol/ 预冷CaCl2溶液(0.1mol/L)
(2) 将以上各样品轻轻摇匀 , 冰上放置 将以上各样品轻轻摇匀, 冰上放置2030min, 于 42℃ 水浴中保温 - 2min, 然后 , ℃ 水浴中保温1- , 迅速冰上冷却2min 迅速冰上冷却 (3) 立即向上述管中分别加入 立即向上述管中分别加入0.4ml LB液体 液体 培养基( 不需在冰上操作) 培养基 ( 不需在冰上操作 ) , 使总体积到 0.5ml, 该溶液称为转化反应原液 , 摇匀后 , 该溶液称为转化反应原液, 于37℃振荡培养约 ℃振荡培养约45-60min ,使受体菌恢复 正常生长状态,并使转化体表达抗生素基因 正常生长状态, 产物(Ampr)。 产物 。
4) 检出转化体和计算转化率
统计每个培养皿中的菌落数, 统计每个培养皿中的菌落数,各实验组 培养皿内菌落生长状况应如表所示: 培养皿内菌落生长状况应如表所示
各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析
组 转化实验组 含抗菌素的平板 白色菌落和少量 蓝色菌落 无菌落或极少量 白色菌落 蓝色菌落 结果说明 说明有重组质粒导入细 胞中( 胞中(有时还需要酶切 进一步鉴定〕 进一步鉴定〕 说明插入片段比较纯或 有少量模板DNA存在 有少量模板DNA存在 可以判断感受态细胞的 效率
互补现象: α-互补现象: 互补现象
因为有些载体都带有一个LacZ基因的调控序 列和头146个氨基酸的编码信息,编码α 146个氨基酸的编码信息 列和头146个氨基酸的编码信息,编码α-互补 该肽段能与宿主编码的缺陷型β 肽,该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖 苷酶实现基因内互补( 互补)。当这种载 互补)。 苷酶实现基因内互补( α-互补)。当这种载 体转入可编码β 半乳糖苷酶C 体转入可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的 宿主细胞中时,在异丙基宿主细胞中时,在异丙基-β-D硫代半乳糖苷 IPTG)的诱导下, (IPTG)的诱导下,宿主可同时合成这两种 肽段,虽然它们各自都没有酶活性, 肽段,虽然它们各自都没有酶活性,但它们 可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。 可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所 互补现象。 以称这种现象为α-互补现象。
重组质粒克隆的鉴定
鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有α 鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有α互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、 进行酶切分析、 互补、小规模制备质粒 进行酶切分析 插入失活、 以及杂交筛选的方法。 插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。最 以及杂交筛选的方法 常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶 常用的方法是小规模制备质粒 进行酶 切分析,对于带有LacZ基因的载体还可以 切分析,对于带有 基因的载体还可以 结合α 互补现象来筛选 互补现象来筛选。 结合α-互补现象来筛选。
冰冷的0.1mo1/ (6)弃去上清液,加入 )弃去上清液,加入100µl冰冷的 冰冷的 / L CaCl2溶液 , 小心悬浮细胞 , 冰上放置片刻 溶液,小心悬浮细胞, 即制成了感受态细胞悬液; 后,即制成了感受态细胞悬液; ( 7) 制备好的感受态细胞悬液可直接用于转 ) 化实验,也可加入占总体积15% 化实验,也可加入占总体积 %左右高压灭菌 过的甘油, 混匀后分装于1.5ml离心管中 , 置 离心管中, 过的甘油 , 混匀后分装于 离心管中 于-70℃条件下,可保存半年至一年。 ℃条件下,可保存半年至一年。
克隆的筛选: 克隆的筛选:
主要用不同抗生素基因筛选。 主要用不同抗生素基因筛选。常用的 抗生素有:氨苄青霉素、卡那霉素、 抗生素有:氨苄青霉素、卡那霉素、 氯霉素、四环素、链霉素等; 氯霉素、四环素、链霉素等;
将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养 基中培养,才能较容易地筛选出转化体, 基中培养,才能较容易地筛选出转化体, 即带有异源DNA分子的受体细胞。否则, 分子的受体细胞。 即带有异源 分子的受体细胞 否则, 如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素 的培养基平板上, 的培养基平板上,会出现成千上万的细菌 菌落,将难以确认哪一个克隆含有转化的 菌落, 质粒。 质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细 菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖, 菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖, 但对于连接混合物而言, 但对于连接混合物而言,此时并不能确定 哪个克隆含有插入片段。 哪个克隆含有插入片段。
2. 相关知识及原理
感受态细胞(Competent cells): 感受态细胞 受体细胞经过一些特殊方法( 受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl, , RuCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的 等化学试剂法) 等化学试剂法 的处理后, 通透性发生变化 , 成为能容许多有外源 DNA的载体分子通过的感受态细胞 (competent cell) 。