常用Q-PCR方法比较
Q-PCR实验技术
体系1
体系2
保证引物终浓度是0.1-0.5uM.
实验步骤——点样
GAPDH-Con GAPDH-Con GAPDH-Con GAPDH-Con GAPDH-si-A GAPDH-si-A GAPDH-si-A GAPDH-si-A GeneA-Con GeneA-Con GeneA-Con GeneA-Con GeneA-si-A GeneA-si-A GeneA-si-A GeneA-si-A
谢谢观看
Thank you
简介
它是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程， 使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA) 的起始浓度进行定量。 在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为扩增指数增长期测量值与特异DNA （RNA）起始量存在相关性，从而实现定量检测。 Q-PCR的仪器由实时定量 PCR 仪、实时荧光定量试剂、通用电脑和自动分析软件 几部分组成。
体积
4ul 1ul 试剂1 试剂2
备注
试剂2最后加入oligo T primer (50nm×1)
random 6:mers (100nm×1) trizol RNA
1ul
1ul Xul
试剂3
试剂4
Rnase free H2O
13-Xul
试剂5
实验步骤——样品准备
Q-PCR： 逆转录结束后，将引物、SYGreen、DEPC放于冰盒中。 配置体系： SYGreen 5ul E1(引物R) 0.3ul E2(引物F) 0.3ul 模板 0.6ul DEPC水 3.8ul
Part.2
实验原理
实验原理
定量原理 :实时荧光定量 PCR 是在反应体系中加入荧光基团 ,使产物 的数量与检测到的荧光强度成线性关系 ,从而得出产物的扩增曲线。
10种常用的PCR方法，您都熟悉吗？
10种常用的PCR方法，您都熟悉吗？之前介绍了PCR相关的一些基础知识，今天我们继续，综合整理了10种常用的PCR方法。
小编整理下来的感受是，PCR绝不是想象的那么简单。
此文是长文，您准备好了么？▼热启动PCR（Hot Start PCR）热启动PCR常用于增强PCR扩增的特异性。
热启动PCR主要借助一种酶的修饰物（如抗体、亲和配体、适体或化学修饰物）来抑制常温下DNA聚合酶的活性。
这种修饰使得在PCR反应体系配制阶段引物与模板、引物与引物之间的结合能力降低，从而避免了非特异性扩增。
由于DNA聚合酶在常温下的活性被抑制，热启动技术为在常温下配制多个PCR反应体系提供了极大的便利，而无需牺牲PCR反应的特异性。
当反应体系配制好后，在反应初始加热步骤，酶修饰物在高温下（通常高于90 ℃）被释放，使得DNA聚合酶被激活（图1）。
激活时间和温度根据DNA聚合酶及热启动修饰物的不同而有所差别。
对于某些聚合酶，激活和预变性合并成了一步。
图1. 基于抗体热启动技术的DNA聚合酶降落PCR（Touchdown PCR）另一种提升PCR反应特异性的方法是调整PCR循环的参数。
在降落PCR中，前几个循环的退火温度设定为比引物的最高退火温度（Tm）再高几度[1,2]。
较高的温度有助于避免产生引物二聚体及非特异性引物与模板形成的复合物，因此可以减少不希望出现的扩增。
就这一点来说，较高的退火温度可减少非特异性PCR产物，在PCR起始阶段促进特异性的扩增。
虽然较高的退火温度可阻止引物二聚体形成和非特异性引物结合，但同时较高的退火温度会加剧引物与目标序列的分离，导致PCR的产量降低。
为了克服这个问题，在开始的几个循环中，退火温度通常设置为每个循环降低1℃，以获得足量的预期扩增子。
当退火温度降低到最佳温度时（通常比最低的引物Tm低3-5℃），剩余的循环都维持此退火温度。
通过这种方法，在PCR过程中，所期望的PCR产物得到有选择性的增加，而几乎不会出现非特异性的产物（图2）。
[整理]q-pcr结果分析
![[整理]q-pcr结果分析](https://img.taocdn.com/s3/m/6a355291bdeb19e8b8f67c1cfad6195f312be8aa.png)
摘要：现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。
绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。
2－△△CT方法是实时定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。
本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。
另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量PCR 数据分析中可能会被用到。
关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman反转录PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。
实时PCR 技术和RT -PCR 的结合产生了反转录定量PCR 技术（4 ,5 ）。
实时定量PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。
绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。
绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。
通过实时PCR 进行绝对定量已有多篇报道（6 - 9 ），包括已发表的两篇研究论文（10,11 ）。
在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。
显然，我们说X 基因在经过某种处理後表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从1000 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。
用实时PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。
2－△△CT 方法可用于定量PCR 实验来计算基因表达的相对变化：2－△△CT公式的推导，以及实验设计，有效性评估在Applied Biosystems User Bulletin No.2（P/N4303859）中有介绍。
用2－△△CT方法分析基因表达数据在文献中也有报道（5,6）。
常用Q-PCR方法比较
SYBR@Green 法
原理：利用SYBR@Green I 的吸 收波长，加入过量SYBR@Green 荧光染料，SYBR@Green 荧光染 料特异性地掺入DNA双链后，发 射荧光信号，而不掺入链中的染 料分子不会发射任何荧光信号。
LUX@Primers法
原理：目标特异的引物对中的一 个引物3’端用荧光报告基团标记。 在没有单链模板的情况下，该引 物自身配对，形成发夹结构，荧 光淬灭。反之引物与模板配对， 发夹结构打开，产生特异的荧光 信号。
Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设
定阈值时所经历的循环数
计算起始模板公式： Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)
2 特点
只需一台仪器 时间：45分钟~1小 时10分钟
操作简单
结果精确
分类
Taqman@探 针法
分子信标法
SYBR@Green 法
LUX@Primers 法
常用Q-PCR方法比较
简 介
分 类
比 较
目录 CONTENTS
简介
Q-PCR也称 Real-time PCR
Q-PCR
实时荧光定量核酸扩增检测系统 Real-time Quantitative PCR Detecting System
1 要素 Q-PCR标准曲线
Q-PCR以荧光信号做标 记，分析Ct值和标准曲 线，得出起始模板数量。
Taqman@探针法
原理：探针5’端标记报告荧光基 团，3’端标记淬灭荧光基团。利 用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性 切断探针，产生荧光信号。
分子信标法
原理：自由状态时，分子信标呈 发卡式结构，荧光基团和淬灭基 团相距较近，荧光极低。当分子 信标与靶分子结合时，两基团距 离加大，荧光恢复近100%。
q-PCR的原理及应用
q-PCR的原理及应用1. q-PCR的基本原理q-PCR（quantitative polymerase chain reaction）是一种高效、快速、精确测量DNA或RNA的方法。
它是PCR技术的一种变种，通过在PCR反应过程中引入荧光探针，可以实现对目标序列的定量分析。
q-PCR基于PCR的原理，利用DNA或RNA的特异性扩增来准确检测和定量靶序列。
它的基本原理包括以下几个步骤：1.目标序列的反转录：如果目标是RNA，首先需要将RNA逆转录成cDNA。
2.PCR扩增：使用特异性引物将目标序列的复制数扩增。
3.目标序列与荧光探针的结合：引入荧光探针，与目标序列特异性结合，生成荧光信号。
4.信号检测和数据分析：使用荧光探测系统检测荧光信号，并根据荧光信号的强度和阈值周期数来计算目标序列的起始数量。
2. q-PCR的应用领域q-PCR技术在生物医学研究和临床诊断中被广泛应用。
以下列举了一些主要的应用领域：2.1. 基因表达分析q-PCR可以测量目标基因在不同条件下的表达水平，用于研究基因调控和信号转导路径。
通过比较不同样本中目标基因的表达量，可以揭示基因在生物学过程中的功能和调控机制。
2.2. 肿瘤检测和诊断q-PCR可以检测肿瘤相关基因的异常表达，帮助早期发现和诊断多种肿瘤。
例如，在肿瘤标记物的测定中，q-PCR可以精确定量某些基因的表达，并辅助肿瘤的诊断和治疗决策。
2.3. 微生物检测q-PCR在微生物检测中具有很高的敏感性和特异性。
可以用于检测食品、环境及临床样本中的病原微生物，快速准确地确定其种类和数量。
2.4. 体外诊断q-PCR在临床体外诊断中的应用包括病毒、细菌和基因突变等检测。
例如，可以使用q-PCR技术检测乙型肝炎病毒、艾滋病病毒等病毒的感染情况。
此外，q-PCR还可以用于检测遗传疾病的基因突变，帮助早期诊断和治疗。
2.5. 药物研发和评价q-PCR可以用于药物的研发和评价。
QPCR定量简介
荧光定量PCR一、原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。
原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
优点：重复性好，特异性高，灵敏性高，可多重PCR；缺点：只适合特定目标，价格较贵，本底信号较高。
2）SYBR荧光染料：SYBR荧光染料是一种可以结合在DNA双螺旋小沟区域具有绿色激发波长的燃料。
在PCR 反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
优点：引物设计方便，价格优势；缺点：特异性差，引物要求高，灵敏度差，不能进行多重定量。
二、内标在传统定量中的意义1．几种传统定量PCR方法简介：1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。
上游引物用荧光标记，下游引物不标记。
在模板扩增的同时，内标也被扩增。
在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。
2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。
在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。
QPCR
自动化 无PCR后续操作步骤，降低产物污染的风险性。
Real-Time Quantitative PCR是指在PCR反应体系中加入荧 光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最 后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实 时荧光定量PCR技术的发展过程中，两个重要的发现推 动了荧光定量技术的大力发展：在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异 性荧光标记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可 能；此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中 能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应 的仪器和试剂的商品化发展推动实时荧光定量PCR方法 在研究工作中的运用。
实时荧光定量PCR技术
荧光定量PCR与常规PCR的区别
• 常规PCR技术：
• 对PCR扩增反应的终产物进行定性及定量分析
• 荧光定量PCR技术： • 对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量分 析
实时荧光定量PCR的特点
•特异性 荧光定量PCR具有引物和探针的双重特异性，故与 传统的PCR相比，特异性大为提高。 •敏感性 荧光定量PCR的敏感度通常达102拷贝/ml，对数期 分析，线性范围很宽，为0-1011拷贝/ml。一般来讲临床标 本中病原体的数目为0-1010/拷贝，在此范围内荧光定量 PCR定量较为准确，标本不需稀释。 •重复性 荧光定量PCR结果相当稳定，因为域值设置在指数 扩增期.在此阶段，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用， CT与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比CT值能更 稳定，更精确地反映起始模板的拷贝数。
2. 标准曲线法的相对定量 ，由于在此方法中对目的基因的是相对于 某个参照物的量而言的，因此相对定量的标准曲线就比较容易制备， 对于所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中样本的 靶序列的量来自于标准曲线，最终必须除以参照物的量。在实验中为 了标准化加入反应体系的RNA或DNA的量，往往在反应中同时扩增一内 源控制物，如在基因表达研究中，内源控制物常为一些看家基因（如
Q-PCR讲解..
• 相对定量
• • ∆∆CT Method：使用内参基因定量所研究样品和参照样品的目的基因； 参照样品基因与目的基因可以同时反应，也可以单独反应；
•
双标准曲线法：对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出 每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公 式来求出目的基因的差异表达；
• 可进行PCR或qPCR • 需要基因特异性引物 • 高通量 •先进行cDNA合成再进行 cDNA PCR •高效的第一链合成 •可为下游实验提供cDNA •适合从少量的RNA样本中得 Amplicon Amplicon 到大量基因（数目）的信息
• 使用同类的RNA(i.e. single
cell) • 适合从大量的RNA样本中
确认反应特异性，增加数据可信度
qPCR的数学原理
• 理想的PCR反应： Xn=X0×2n • 非理想的PCR反应： Xn=X0(1+Ex)n • 方程式两边同时取对数得: log Xn=log (X0 (1+Ex)n)
n：扩增反应的循环次数 Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
相对定量方法
– 基因表达差异 – 目的基因，内参基因
• ∆∆Ct
– – – – – – – – – – 只依靠Ct值 用于大通量（很多基因，如芯片结果） 计算简单 估计性的结果 要求目的基因和内参基因扩增效率都比较好 结果精确 对扩增效率要求不高 构建目的基因与内参基因的标准品 相当于两个绝对定量 每次反应都要作标准曲线
唯我所欲、精准溯源
—qPCR实验解析
北京全式金生物技术有限公司
概述
样品准备 实验设计 数据分析
• qPCR技术 •绝对定量VS相对定量 •一步法VS两步法 qRT-PCR •核酸提取 • cDNA 合成(两步法 qRT-PCR) •引物设计方法和原则 •必要的对照、内参、标准 •选择相应的荧光检测方法 •试剂选择 •分析扩增曲线、溶解曲线和标准曲线带有PCR扩增子的合成的RNA或cDNA寡核苷酸； 质粒DNA；克
Q-PCR技术
使用竞争性内标准的定量PCR方法
“竞争性”内标：人为构建的可与原始靶核酸竞争 酶、核苷酸和引物分子的核酸标准，其特点是， 与靶核酸具有相同的引物结合位点、但引物之间 的顺序需加以修饰，使得扩增产物在检测时能够 很容易地通过诸如凝胶电泳、探针杂交或高效液 相层析等方法区分。
测定方法极为关键。合适的非竞争性内标应为在 整个细胞周期中均匀表达的基因核酸，而竞争性 内标则应尽可能近似原始待测模板。 4.定量测定应在扩增的指数期进行，因此，更重要 的是要使涉及整个扩增过程的每个参数都理想化， 以便控制整个扩增，避开扩增“平台期” 。
总结
5.由样本制备（核酸提取）方法所引起的定 量测定的差异应仔细研究加以避免。
高浓度/高效率 高浓度/低效率 低浓度/高效率
N : 扩增分子的数 目
n : 扩增循环的次 数
n
定量PCR与定性PCR测定的最根本的区别
定量PCR测定的测定点为PCR扩增的指 数扩增期;而定性PCR测定的测定点则多为 PCR扩增的平台期。
定量PCR的方法
定量PCR方法可归为三大类，即外标方法、 动力学方法和内标共扩增方法
PCR及有关技术的发展历史（3）
1987 当年7月Cetus 公司在美国获得PCR基本技术
专利批准。 成立于1985年底的Perkin-Elmer Cetus仪器公
司 （ PECI ） 于这一年的11月推出了第一 个PCR 试剂产品及第一台热循环仪。
1989 Science 报道了耐热性DNA多聚酶 Taq 酶的 发现,预示着分子时代的到来。12月《Science》杂 志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年 度分子”。 Hoffmann-La Roche 公司和Cetus 开 始合作将 PCR应用于临床诊断 。
RT-PCR和Q-PCR及数据处理
RT-PCR和Q-PCR及数据处理RT-PCR和Q-PCR1、细菌总RNA反转录（RT-PCR）1.在冰上融化RNA模板。
在室温(15-25℃)下解冻gDNA Wipeout Buffer,Quantiscript逆转录酶,Quantiscript RT Buffer,RT Primer Mix, RNase-free water。
将每份溶液震荡混合于管中。
离心机短暂离心并收集管中残余液体,然后放置于冰上。
2.根据表2-2，在冰上准备基因组DNA消除反应。
混合。
注意:如果设置多个反应,准备一个主要的混合gDNA Wipeout Buffer和RNase-free water体积大于10%,所需反应的总数。
适当分配主要混合液于几个管,然后向单管中加入RNA样本。
注意:这份成分表适用的RNA量是10pg至1μg。
如果使用>1μg 的RNA,则反应规模成线性增长。
例如,如果使用2μg RNA，则每个成分变成双倍，最后总体积成28μl。
表2-2.基因组DNA消除反应成分Tabel2-2Genomic DNA elimination reaction components成分体积/反应gDNA Wipeout Buffer模板的RNA（最高用量为1μg）RNase-free water总反应体积7×2μl适量(5μl)适量(7μl) 14μl*此数量包含所有RNA,包括任何rRNA,信使核糖核酸、病毒RNA,和载体RNA,无论使用的引物、cDNA分析。
3.在42℃孵化2分钟,然后立即放置于冰上。
注意:不要在42℃培养超过10分钟4.根据表2-2准备反转录混合液（the reverse-transcription master mix）于冰上。
混匀,然后保持在冰上。
反转录混合液包含所有合成第一条cDNA所需的成分，但除了模板RNA。
注意:如果设置多个反应,准备主混合10%的体积大于所需反应的总数。
Real-time PCR
实时PCR实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。
real time PCR 的定量使用荧光色素，目前有二种方法。
一种是在ds DNA中插入特异的荧光色素，例如SYBR Green荧光染料；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种荧光探针（probe），如Taqman 探针。
、两种方法原理不同。
SYBR Green荧光染料游离时不发光，当反应体系中存在双链DNA时，SYBR Green与双链DNA结合，此时才发光。
Taqman探针带有一个荧光基团和一个淬灭基团，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端。
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，此时荧光基团发出的荧光信号可以被检测到。
real time PCR 与 reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”反应体系oligo: 多聚体，相当于mRNA引物AMV RT：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶dNTPs：脱氧核苷酸RNase：RNA酶抑制剂PCR Buffer：RT-PCR缓冲液MgCl2：2价镁离注意事项：绝对定量：几种可能：1. 你的cDNA浓度是不是通过紫外分光测定的？紫外的干扰因素很多，只能作为浓度参考，也就是可能会导致你的内参Ct有差异，正常现象。
2. 反转录的效率，如果你的内参扩增产物在靠近mRNA的3'端影响不大，如果在里面或者5'端，Ct值存在差异正常。
Q-PCR讲解
– 基因表达差异 – 目的基因，内参基因
• ∆∆Ct
– – – – – – – – – – 只依靠Ct值 用于大通量（很多基因，如芯片结果） 计算简单 估计性的结果 要求目的基因和内参基因扩增效率都比较好 结果精确 对扩增效率要求不高 构建目的基因与内参基因的标准品 相当于两个绝对定量 每次反应都要作标准曲线
实验设计
数据分析
32
对照设置
33
对照设置
阴性对照
–Negative control: No template (NTC)
• Use: 检验是否有模板污染 –No reverse transcriptase (NRT): • Use: 检验RNA样品中是否有DNA污染 –No amplification control (NAC): • Use: 检验是否有聚合酶污染 –No probe control (NPC): • Use: 检验荧光污染 –Buffer: Only contains buffer • Use: 检验背景荧光
整理方程式得:
log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn • 将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得： log X0= (- log(1+Ex) ) ×C(t)+ log Xc(t)
初始浓度的对数与循环数呈线性关系
MIQE qPCR国际标准
1. 提出发表文章时所要求的最低限度的必要信息标准。
• 双标准曲线法
双标准曲线法 双标准曲线法
•
• •
用目的基因和内参基因的标准品分别获得标准曲线
处理与未处理样品同时扩增目的基因和内参基因，获得C(t)值 通过标准曲线计算目的基因和内参基因的绝对拷贝数
Q-PCR讲解解读
• 相对定量
• • ∆∆CT Method：使用内参基因定量所研究样品和参照样品的目的基因； 参照样品基因与目的基因可以同时反应，也可以单独反应；
•
双标准曲线法：对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出 每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公 式来求出目的基因的差异表达；
• • MGB EclipseTM Probes ScorpionsTM
• Others...
qPCR 常用实验方法
简单 成本较低
适用于多重PCR 特异性较好
可进行SNP检测 特异性非常好
荧光标记方法选择
• 医疗检验 – TaqMan探针法
• 特异 • 准确
• 科研 – SYBR方法
2
qPCR基本概念
3
常规PCR与实时荧光定量PCR
• 常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定 性分析 • 实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测 PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终对起 始模板进行精确的定量分析
4
荧光定量PCR仪器工作原理
• 激发光发射源
2. 对qPCR的术语；概念；研究与临床应用；样本的采集、处理和制
备；核酸的质量控制；反转录；qPCR过程；数据分析等方面的操 作标准和规范都做了详尽的阐述。
9
qPCR常用定量方式
10
qPCR 常用实验方法
• TaqMan® / TaqMan-MGB®
• Molecular Beacon
• SYBR Green I
得到少量基因（数目）的
信息
根据试验情况进行选择
概述 样品准备
• qPCR技术 • 绝对定量VS相对定量 • 一步法VS两步法 qRT-PCR • 核酸提取 • cDNA 合成(两步法 qRT-PCR) • 引物设计方法和原则 •必要的对照、内参、标准 •选择相应的荧光检测方法 •试剂选择 •分析扩增曲线、溶解曲线和标准曲线 •实验常见问题分析
rt q pcr过程当中要进行五模板对照
rt q pcr过程当中要进行五模板对照
1. 逆转录酶
目前市场上有两种不同的逆转录酶，一种来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒(AMV) ，由两条肽链组成，具有聚合酶活性和很强的RNA酶H 活性，它最适温度是42 ℃，最适pH 8.3。
但是高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA产生也限制其长度。
另一种来源于鼠白血病病毒(Mo-MLV) 的逆转录酶，是单肽链的，有RNA 聚合酶活性和相对较弱的RNA酶H活性，最适温度37 ℃，最适pH 7.6，较弱的RNA酶H活性，可扩增2-3 kb的cDNA。
2. 单价阳离子
离子条件基本上影响各种模板的转录效率。
K +的转录产物⽐Na +较长。
对于cDNA 长度的最适K+浓度为140-150 mM 。
3. 二价阳离子
对于反转录酶活性来说，二价阳离子也是必需的。
产生全长cDNA 产物的最适浓度是6-10 mM。
4.dNTP
四种脱氧核苷三磷酸(dNTP) 的浓度，对于有效合成cDNA是至关重要的。
如果其中只有一种的浓度⽐于10-50 µM，cDNA的产量将明显下降。
常用的dNTP的浓度为200-500 µM 。
5. 引物的选择
逆转录引物一般包含三种：oligo dT，Random Primer Mix和特异性引物。
客户可以根据个人需求进行选择。
q pcr原理
q pcr原理
PCR(聚合酶链反应)是一种体外人工复制DNA的方法，它通过在反应体系中增加适量的模板DNA、DNA聚合酶、引物和核苷酸，通过一系列的循环反应反复复制目标DNA序列。
PCR主要包括三个步骤：变性、引物结合和延伸。
在PCR反应开始时，DNA模板被变性酶热稳定的聚合酶解开形成两条互补链。
接下来，在变性条件下，引物与目标序列的互补区域结合，形成稳定的引物-目标DNA复合物。
引物是通过DNA序列设计来配对目标DNA序列的两个末端，并决定了所复制的DNA序列的起点和终点。
在PCR反应的延伸步骤中，加入了有机磷酸酯型DNA聚合酶（如Taq聚合酶），该聚合酶具有较高的热稳定性，在高温条件下仍能保持良好的酶活性。
延伸步骤开始时，温度降低，使得引物能够结合到目标DNA上，并引起DNA的延伸。
在模板DNA的两条链上的每一条上进行反应，形成两条长度相等的DNA生成。
PCR反应中的循环步骤是由PCR仪器自动控制的，它在一个PCR周期内循环进行反应：变性、引物结合、延伸。
每一个PCR周期被称为一个循环，在每个循环中，目标DNA序列的数量会倍增。
通过多次循环反应，目标DNA序列的数量呈指数级增加，从而实现DNA的大量复制。
PCR反应在基因工程、基因克隆、疾病诊断等领域有着广泛的应用。
它不仅能够在短时间内大量复制DNA，还能够扩增
低浓度的DNA样品，使其可以进行进一步的检测和分析。
PCR的高效性和特异性使其成为现代生命科学研究中一个非常重要的实验技术。
拍胸脯！Q-PCR计算看这一篇就够了丨实验时间
拍胸脯！Q-PCR计算看这⼀篇就够了⼁实验时间
上次看了「⼀⽂教你看懂 PCR 结果图」的童鞋是不是迫不及待得等待后续的更新呢？哈哈，别
急，这次我就跟⼤家详细介绍 Q-PCR 的计算原理及过程。
绝对⼲货哦！
PCR 扩增的速率⼤家都知道，就是简单的指数增长，也就是 1 变 2，2 变 4，4 变 8 以此扩增。
数学形式就是 2 的 ct 次⽅，但是实际过程中的增量应该是（1+e）的 ct 次⽅，e 是扩增效率也
称扩增系数。
⼀般我们都假设 e 为 1。
正常的 Q-PCR 我们都会有⼀个阈值，也就是我们平常说
的平台期。
简单的说在平台期的所有基因扩增的数⽬是⼀致的。
⽽唯⼀有区别的则是 ct 值的不同。
Ct 值的
含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 (cycle)。
所以不难推断出
ct 值越⼩，反应扩增到达平台期所需循环数越少，⽬的基因起始含量越⾼。
下⾯我们⽤⼀个公
式进⾏推导过程：（敲⿊板，重点！）。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Taqman@探针法
原理：探针5’端标记报告荧光基 团，3’端标记淬灭荧光基团。利 用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性 切断探针，产生荧光信号。
分子信标法
原理：自由状态时，分子信标呈 发卡式结构，荧光基团和淬灭基 团相距较近，荧光极低。当分子 信标与靶分子结合时，两基团距 离加大，荧光恢复近100%。
分子信标法
荧光基团和淬灭基 团之间的距离是影 响分子信标的最主 要因素
温度
在较低温度下，分 子信标才可以保持 发卡结构，较高温 pH值过高，分子 信标的发卡结构可 能被破坏，出现假 阳性。
纯度
pH值过高，分子 信标的发卡结构可 能被破坏，出现假 阳性。
基团距离
度可能造成假阴性。
pH
结果：检测到的荧光强度与溶液中靶标量成正比
常用Q-PCR方法比较
简 介
分 类
比 较
目录 CONTENTS
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 简介
Q-PCR也称 Real-time PCR
Q-PCR
实时荧光定量核酸扩增检测系统 Real-time Quantitative PCR Detecting System
1 要素 Q-PCR标准曲线
Q-PCR以荧光信号做标 记，分析Ct值和标准曲 线，得出起始模板数量。
比较
四大方法各自的特点
Taqman@探针法
保守 长度 温度 位置 结果
探针要绝对的保守，最多选取有一个碱基不同的片段。两端最好为A或T。5’端为
G时可能出现假阴性。 Taqman探针长度最好在25-32bp之间。 Tm值最好为70℃。 Taqman探针应靠近上游引物，保证Taqman探针的5’端离上游引物的5’端至少 有4bp。 探针与模板是特异性结合，荧光信号的强弱代表了模板的数量。
SYBR@Green 法
01 在稀释、贮存、染色等使用过程中用聚丙烯类容器
02 电泳时间不要超过2小时，否则SYBR GreenⅠ会从DNA上分离出来
03 对用该染液染过的胶进行Southern blots前在预杂化和杂化溶液中加入 0.1%- 0.3% 的SDS
LUX@Primers法
扩增的PCR产物的最佳长度是80-200bp
温 度
解链温度是60-80℃，最佳退火温度是55-64℃
命名
长 度
靶序列必须至少要比扩增子长10bp
长度
序列的命名必须符合IUPAC的字母缩写标准
感谢观看！
Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设
定阈值时所经历的循环数
计算起始模板公式： Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)
2 特点
只需一台仪器 时间：45分钟~1小 时10分钟
操作简单
结果精确
分类
Taqman@探 针法
分子信标法
SYBR@Green 法
LUX@Primers 法
SYBR@Green 法
原理：利用SYBR@Green I 的吸 收波长，加入过量SYBR@Green 荧光染料，SYBR@Green 荧光染 料特异性地掺入DNA双链后，发 射荧光信号，而不掺入链中的染 料分子不会发射任何荧光信号。
LUX@Primers法
原理：目标特异的引物对中的一 个引物3’端用荧光报告基团标记。 在没有单链模板的情况下，该引 物自身配对，形成发夹结构，荧 光淬灭。反之引物与模板配对， 发夹结构打开，产生特异的荧光 信号。