体外抗氧化实验方案教学提纲

一、DPPH自由基清除法

[原理] DPPH（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。分子中，由于存在多个吸电子的-NO2和苯环的大π键，所以，氮自由基能稳定存在。

O2N

NO2

N N

O2N

当DPPH自由基被清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小。DPPH这种稳定的自由基为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。

[实验步骤]

1.1 DPPH测试液的配制 6.25ｘ10ˉ5M

取DPPH 0.0246g溶于约100mL溶剂甲醇中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。取1mL 该DPPH溶液，在519nm处测A值，使A＝1.2-1.3之间最佳。该DPPH溶液最好避光保存，3.5小时内用完。

1.2 样品液的配制Vc溶液（0.25mg/ml）

称取Vc 0.01125g 溶于45mL乙醇溶液

1.3 预试

取DPPH溶液2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色m情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。

此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。

【如】在预试过程中，发现加样到200μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则200μL为该样品液的最大用量。其用量梯度宜设为40、80、120 、160、200μL。浓度梯度mg/ml为

0.0025、0.0050、0.0100、0.0200、0.0400

μg/ml 2.5、5、10、20、40

1.4测量

A0值的测量：取DPPH溶液2 mL加入到小试管（或玻璃瓶）中，加95甲醇1mL，充分混合，测A 值（517nm），此A值为A0（A0多在0.7-0.9之间）。

A值的测量：

取DPPH溶液2mL加入到小试管（或玻璃瓶）中，加样品液xμL （x是根据1.3 预试结果确定样品液的用量），再加（1000 -x）μL 甲醇，混合，静置30分钟后，测A值（517nm）。加样表如下：

表1 加样表

1.5 正式测量

方法大致与1.4相同，只不过，每测一个用量需要测三个平行数据。而且在每测一个用量的三个平行数据后，都要重测一次A0.

[实验结果]

清除率（抑制率）的计算公式：

-⨯00

% =

100%A A

Inhibition A

二、FRAP 法分析维生素C 抗氧化作用

实验原理：

参照Benzie 与Strain 的方法，原理为Fe 3+-三吡啶三吖嗪（TPTZ ）可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现出蓝色3并于593nm 处具有最大光吸收，根据吸光度大小计算样品抗氧化活性的强弱。

实验试剂

醋酸钠（三水），冰醋酸，TPTZ ，FeCl 3•6H 2O ，FeSO 4•6H 2O

不同梯度FeSO 4溶液配制：称取695mgFeSO 4•6H 2O ，定容至25ml ，即100mM ，按梯度配制成10、25、100、150、200、400、500μM 溶液 TPTZ 工作液配制：

(1)称取1.02g 乙酸钠（三水），加4ml 冰醋酸，定容至25ml （调整pH=3.6）

(2)称取TPTZ 粉末 7.8mg （小心腐蚀皮肤），溶于2.5ml 40mM HCl 溶液中，溶液澄清透明。 (3)称取1.35g FeCl 3•6H 2O 溶于25ml 水中，取2.5ml 溶液定容至25ml ，即20mM 的FeCl 3溶液。混匀三种溶液（10:1:1）制成TPTZ 工作液，现配现用。 不同梯度Vc 溶液配制：

取Vc 溶于水，配成含Vc5、10、20、30、40、50μg/ml 溶液（预实验）

实验步骤

(1)标准曲线的测定：按10:1:1比例，精确量取醋酸钠溶液，TPTZ 溶液和不同梯度FeSO 4溶

液，混匀后于37℃反应10min ，测定593nm 处吸光度，以醋酸钠溶液调零。以FeSO 4浓度为纵坐标（表示为FRAP 值），吸光度为横坐标，绘制FRAP 标准曲线。

(2) 取100μL 不同浓度的Vc 溶液，加入1.9mlTPTZ 工作液混匀后37℃反应30min ，测定593nm

处吸光度，以醋酸钠溶液调零，样品抗氧化活性（FPAP value）以达到同样吸光度所需的FeSO4毫摩尔数表示。进行平行实验。