流式细胞仪简介
流式细胞仪
流式细胞仪什么是流式细胞仪？流式细胞仪（Flow cytometry）是一种广泛应用于生命科学领域的实验技术，它能够实现单细胞的快速分析、分类以及划分。
流式细胞仪的原理流式细胞仪的基本结构包括激光源、光学系统、电子学系统和计算机系统。
在样本准备完成后，激光量子将对待检测的细胞进行激励，细胞中的荧光标记物或颜料受到光的激发会发生发射，发射的光传递到光学系统后进行过滤处理后再通过相应接收器接收，传输到电子学系统和计算机进行分析和记录。
流式细胞仪在生命科学领域应用免疫细胞学免疫细胞学是流式细胞仪最广泛的应用领域。
通过对细胞表面分子的特异性检测来实现不同免疫细胞的鉴定和分类。
基于荧光标记同种或异种抗体的原理，使得负责流式细胞仪的计算机可以在短时间内分析千万级别的细胞数。
活细胞筛选通过流式细胞仪可以对生长期的细胞进行筛选，对不同阶段的细胞群体进行分离，可以实现对细胞的遗传和基因表达水平的研究。
分子生物学领域流式细胞仪在分子生物学领域中也起到关键的作用，它能够进行 DNA 浓度分析、测定蛋白质的表达量、检测RNA的表现等。
神经科学领域流式细胞仪还可以在神经科学领域发挥一定的作用，可以检测神经细胞在形态、力学、电生理性质等方面的变化。
流式细胞仪存在的不足流式细胞仪的存在也面临一些问题，例如因为激光的存在会对样本造成一定的损伤，需要非常小心地处理样本。
此外，部分实验者对于样本的操作技能要求较高，需要一定的专业知识和严格的操作规程。
总结流式细胞仪是一种非常有用的生命科学实验技术，主要应用于免疫细胞学、活细胞筛选、分子生物学以及神经科学领域等科学研究。
然而，由于激光的存在，样本操作技能的要求较高，需要仔细对待和操作。
流式细胞仪
基本认知
• 流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。 • 它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分 散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面 的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定 的细胞亚群从中分选出来。 • 多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能 测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标， 而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的 多少。也就是说，它的细节分辨率为零。
仪器组成
流式细胞仪主要由四部分组成。 (1)流动室和液流系统； (2)激光源和光学系统； (3)光电管和检测系统； (4)计算机和分析系统。
工作原理
1.首先，机器吸取细胞混悬液，射入由鞘液（一般都是磷 酸盐缓冲液）。由于鞘液的流速大，所以细胞混悬液通过 轴流的形式在中央，一般是单个细胞排队的形式。 2.然后细胞通过检测窗口。有激光束照射。一般细胞都经 过荧光染色，被激光照射后，会有不同波长的激发光产生。 机器设有检测器来探测激发光的强弱 3.根据激发光的强弱，来判断细胞和染色物质的结合情况， 从而得到要检测的结果（比如抗原量，DNA量，等等）
罗丹明123
罗丹明123（Rhodamine 123）是一 种可透过细胞膜的阳离子荧光染料， 是一种线粒体跨膜电位的指示剂。 其在正常细胞中能够依赖线粒体跨 膜电位进入线粒体基质,荧光强度 减弱或消失。
• 而在凋亡发生时，线粒体膜完整性破坏， 线粒体膜通透性转运孔开放，引起线粒体 跨膜电位(ΔΨm) 的崩溃, Rh123 重新释 放出线粒体, 从而发出强黄绿色荧光，可 用荧光显微镜、荧光光度计或流式细胞仪 检测，通过荧光信号的强弱来检测线粒体 膜电位的变化和凋亡的发生，可用于培养 的细胞或从组织中提取出的线粒体的膜电 位检测。
ห้องสมุดไป่ตู้
流式细胞仪(FlowCytometer)基本原理汇总.
散射光的作用
实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。
1、流式细胞术简介
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的 理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。
流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、 流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光 化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。
FL1
5% 默认阈值
32% 升高阈值后
荧光素和荧光信号
荧光： 荧光素的电子吸收光的能量由低能态转变为高能态， 再回到低能态时释放出的光。
＜ 激发波长
Excitation wavelength
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
常用荧光素
<499nm ：蓝色荧光（Blue）；
流式细胞术的特点
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
2、流式细胞术光信号检测
光信号的类型 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。 前向散射光(forward scatter, FSC)； 侧向散射光(side scatter, SSC)。
流式细胞仪
Th1细胞主要是CD4+细胞分泌IL-2、IL-12、IFN-g和TNFb/a等，主要介导细胞免疫应答。
Th2细胞主要是CD4+细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等， 主要介导体液免疫应答。
Tc1细胞主要是CD8+细胞分泌IFN-g、 IL-2、 IL-6和IL-10 等。
Tc2细胞主要是CD8+细胞分泌IL-2、 IL-4、IL-5、 IL-6和 IL-10等。
工作原理
•将经特异性荧光染料染色后的细胞放入样品管中， 细胞在气体的压力下进入充满鞘液的流动室, 在鞘 液的约束下细胞排成单列，并由流动室的喷嘴喷 出，形成细胞柱，通过激光器的照射激发出散射 光信号和荧光信号, 再由各自的激光检测器收集信 号, 经光电倍增管(PMT) 将信号放大, 转变为电信 号后由计算机系统进行分析.
BrdU细胞增殖检测
BrdU是胸腺嘧啶的衍生物，常用于标记活 细胞中新合成的DNA，可代替胸腺嘧啶选 择性整合到复制细胞中新合成的DNA中 （细胞周期S期）。这种掺入可以稳定存 在，随DNA复制进入子细胞中。BrdU 特 异性抗体可以用于检测BrdU的掺入，从而 判断细胞的增殖能力。
树突状细胞检测:
自然杀伤细胞 （NK细胞）
淋巴细胞免疫表型分析
• 根据淋巴细胞的功能及膜表面标记，主要分 为T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞三个亚 群，但三者在普通光学显微镜下不能区分， 血细胞分析仪也无法鉴别，只有用流式细胞 仪结合单克隆抗体技术才能准确分类计数淋 巴细胞亚群。
经常测定的淋巴细胞免疫标记包括： T淋巴细胞 ：CD3、CD4、CD8,
ELISA一次反应只检测一个指标。而CBA一次可 同时检测6-7个指标。
• CBA （Cytometric Bead Array)是利用一系 列荧光强度不同的微球，同时分析样本中 多种可溶成分的流式检测方法。
流式细胞仪
1、流式细胞术(英文flow cytometry)是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。
这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。
目录* 1 原理* 2 流式细胞仪(flow cytometer)* 3 应用* 4 参见原理一束单色光（通常是激光）照到流体力学聚焦的一股流体上。
若干个检测器瞄向流束和激光相交的这个点，其中一个和激光在同一直在线（称作前散射(FSC)），其它几个和激光垂直（旁散射(SSC)和一个或几个荧光监测器）。
当每个悬浮颗粒通过光束时会按某种方式把光散射，同时所带有的荧光化合物被激发并发射出频率低于激发光的荧光。
这些散射光和荧光的组合数据被检测器记录，根据各检测器亮度的波动（每个细胞会显出一个散射或荧光的峰）就能够推算出每个颗粒的物理和化学性质。
前散射与细胞体积相关，而旁散射取决于颗粒的内部复杂程度（比如核的形状、胞质内颗粒的种类或者末的粗糙程度）。
可以检测的参数有：细胞的体积和形态复杂程度、细胞中的色素、DNA（细胞周期分析、细胞动力学、细胞增殖等）、RNA 染色体分析和分选（文库构建、染色体涂染）、蛋白质、细胞表面抗原（CD标记）、胞内抗原（各种细胞因子(cytokine)、次级媒介等）、核抗原、酶活性、pH，胞内离子化的钙、镁，膜电势、膜流动性细胞凋亡(apoptosis)（定量检测DNA降解、线粒体膜电位、通透性变化）、细胞存活能力、监测细胞电通透性、氧爆作用(oxidative burst) 、研究癌细胞中的多重耐药性(multi-drug resistance, MDR) 、谷胱甘肽、各种组合（DNA/表面抗原等等）流式细胞仪(flow cytometer)流式细胞仪又称荧光激活细胞分选器、荧光活化细胞分类计（FACS，Fluorescence Activated Cell Sorter）。
现代的流式细胞仪每秒可以实时检测几千个颗粒，并且可以主动分离具有不同特性的颗粒。
流式细胞仪(Flow_Cytometer)基础简介
●
FCM的定义
流式细胞仪是指，使细胞（或其 他粒子）以单个方式依次高速通过激 发光束，采集细胞被光照时产生的各 种信号，对信号进行处理，幵对各参 数进行关联分析的一种仪器。
对比
流式细胞仪是一种特殊的显微镜
流式细胞仪
流动的细胞
数量大 高速分选
显微镜
静止的细胞样本
数量少 样本难以再利用
细胞群体特征量分布
流式细胞仪（Flow Cytometer) 基础简介
中科院生物物理研究所 中国科学院蛋白质科学研究平台 2005年3月 刘春春
Hale Waihona Puke 主要内容
流式细胞仪概要 流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪测量的对象
什么是流式细胞仪
●
流式细胞仪实物
BD-Calibur
BD FACSVantage
流式细胞仪基本结构
非荧光信号
颗粒度
细胞大小
散射光信号区分裂解后的外周血细胞群
荧光信号
荧光染料被激发而发射的光信号。 定量染色 荧光信号大小 被标记组分含量的定量
多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量
PI＋Annexin－V细胞凋亡检测
DNA 含 量 -PI Annexin-V
PE＋FITC荧光标记检测外周 血裂解后细胞群
光信号收集
光信号分离，导向，各探测通道PMT 接收幵转化为电信号。
激光束
侧向散射 光，荧光
1
二色镜 2
3
细胞
前向 散射 光
收集透镜
带通滤波片 光电倍增管
数据处理
光信号
FSC SSC FL1 FL2 FL3
电信号
对数 线性 线性 线性 对数
流式细胞仪分类
流式细胞仪分类1. 简介流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种常用的生物学实验仪器，用于对细胞进行分类和分析。
它通过将细胞悬浮液注入仪器中，利用激光束照射细胞，测量细胞在不同参数上的散射和荧光信号，从而对细胞进行分类和计数。
流式细胞仪广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。
2. 流式细胞仪的分类方式根据不同的参数和功能，流式细胞仪可以分为以下几种类型：2.1. 基础型流式细胞仪基础型流式细胞仪是最常见的类型，它可以测量细胞在不同波长的激光照射下的散射和荧光信号。
基础型流式细胞仪通常具有多个激光器和多个探测器，可以同时测量多个参数。
常见的参数包括细胞大小、形态、颜色、荧光标记物等。
2.2. 高通量流式细胞仪高通量流式细胞仪是一种能够快速处理大量样本的流式细胞仪。
它通常具有多个样本载体和多个样本接口，可以同时处理多个样本，提高实验效率。
高通量流式细胞仪广泛应用于大规模细胞筛选、细胞库构建和高通量药物筛选等领域。
2.3. 分选型流式细胞仪分选型流式细胞仪是一种能够根据细胞的特定特征进行分选的流式细胞仪。
它通常具有一个或多个分选器，可以根据预设的分选条件将特定类型的细胞分选出来。
分选型流式细胞仪广泛应用于细胞克隆、单细胞测序和细胞治疗等领域。
2.4. 成像型流式细胞仪成像型流式细胞仪是一种能够对细胞进行高分辨率成像的流式细胞仪。
它通常具有高倍率物镜和高灵敏度的相机，可以对细胞进行三维成像和时间序列成像。
成像型流式细胞仪广泛应用于细胞动力学研究、细胞迁移和细胞内信号传导等领域。
3. 流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理包括激光照射、散射信号检测和荧光信号检测三个步骤。
3.1. 激光照射流式细胞仪通过激光器产生高能量的激光束，将激光束聚焦到细胞悬浮液中的单个细胞上。
激光束的波长和功率可以根据需要进行选择，常用的波长包括488nm、532nm和633nm等。
3.2. 散射信号检测当激光束照射到细胞上时，细胞会发生散射现象。
简介流式细胞仪
一、简介流式细胞仪（一）流式细胞仪概念流式细胞术（Flow Cytometry ，FCM）是一种对处在液流中的细胞或其它生物微粒（如细菌）逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术。
简言之，流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质，如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等进行快速测量并可分类收集的高技术，FCM以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特色，广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等，在各学科领域发挥着重要的作用。
（二）原理待测样本的细胞悬液，在鞘液的包围和约束下，细胞排成单列高速由流动室喷嘴喷出，形成细胞液柱。
当液柱通过检测区，在入射的激光束照射下产生前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC），它们分别反映细胞大小和颗粒度，根据这些特性可以将细胞分类。
经一种或几种特殊荧光标记的样本，在激光束的激发下所产生的特定荧光，可被光学系统检测并输送到计算机进行分析，得到细胞相应的各种特性。
（三）流式细胞仪检测的细胞特性细胞结构组成 细胞功能大小 细胞表面、胞浆、核特异性抗原粒度 细胞活性DNA、RNA含量 胞内细胞因子蛋白质含量 激素结合位点钙离子、pH值、膜电位 酶活性二、流式细胞仪的临床检验项目目前在国内最常见的临床应用有两大类：一为肿瘤细胞的DNA含量析； 另一为细胞表面的表型测定，包括淋巴细胞亚型分析、免疫功能监测、白血病和淋巴瘤免疫分型、残余白血病检测、以及HLA-B27组织抗原检测等等。
1、淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析可以通过相对计数、绝对计数与率的变化监控疾病状态下的免疫状况（如肿瘤、感染性疾病、免疫性疾病等），以此辅助诊断、追踪病情发展及决定用药时机。
检测原理：利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面的抗原结合，再配合多色荧光染料，即可以把各种不同功能的淋巴亚群区分开来，进而得到各亚群的相对比例。
流式细胞仪FlowCytometerFCMorFACS是一项集激光技术
流式细胞仪的主要技术指标
1. 荧光测量灵敏度 2. 仪器的分辨率和准确度 3. 前向角散射光检测灵敏度 4. 检测速度以每秒可分析的细胞数来表示 5. FCM分选指标主要包括：分选速度、分选纯
度、分选后细胞的活性度及分选收获率。
流式细胞仪可测量的主要参数
细胞结构
细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量
胸片 右下肺斑片状密度增高影，右膈面 局限性膨升，脊柱侧弯。
副鼻窦CT示：双侧上颌窦、筛窦、蝶窦、 额窦腔内可见软组织密度填充影，部分 骨壁骨质增生硬化。
外周血涂片：成熟粒细胞占5%，成熟淋巴细胞 占95%，但淋巴细胞表面可见明显绒毛样突起， 血小板少。
骨髓细胞免疫分型与外周血免疫分型一致。 骨髓
双 参 数 图
外周全血细胞散射光双参数点图 （红细胞溶解后）
双参数可在二维散点图中同时显示，X 轴显示通道 1（FL1）， Y 轴显 示通道 2（FL2）。
3-D Histograms
（假）三维图由X、Y、Z三个数轴组成，X 轴显示通道 1信号 （FL1）， Y 轴显示通道 2信号（FL2），Z轴显示通道3信号（FL3） 或其他两个通道的细胞数量。
追溯病史：患者有发热、盗汗。
查体：慢性病容，双侧颈部、腋下及腹股沟 可扪及多个肿大淋巴结，0.5cm~2cm大小不等， 质地中等，活动尚可，无触痛。双眼内皉可 见脓点，耳、鼻、口腔无异常分泌物，鼻窦 区无压痛，心肺正常，腹软，肝肋下未及， 脾大约肋下两指。
一般实验室检查：血常规示：WBC 36.2x109/L， Lym 78%, Hb 78g/L, Plt 120x109/L,肝功能： ALB 23.9g/L, GLB 74g/L, ALT, AST及肾功能正 常。ESR: 142mm/L，IgG 57.41g/L, IgA 7.52g/L, IgM 1.91g/L。β 2-MG 14.8mg/L, LDH 正常，尿κ 251mg/L, 尿λ 95.4mg/L, 血 κ 13.5g/L, 血λ 6.72g/L。
1流式细胞仪基础知识介绍
1流式细胞仪基础知识介绍流式细胞仪（Flow Cytometry）是一种通过流式技术对细胞进行快速分析和计数的仪器。
它结合了光学、电子和计算机技术，可以对单个细胞进行高效的多参数分析，可广泛应用于生命科学研究、临床诊断、药物研发等领域。
流式细胞仪的基本原理是通过激光束照射样本中的细胞，并利用光学系统收集和分析由细胞散射、荧光等产生的光信号。
其主要组成部分包括激光器、光学系统、流体系统和电子计算机系统。
激光器是流式细胞仪的光源，产生高强度的单色激光束。
常用的激光器有氩离子激光器、固态激光器和半导体激光器等，不同波长的激光器可用于激发不同荧光染料。
光学系统包括一系列透镜和滤光片，用于聚焦和收集激光束，并选择感兴趣的荧光信号进行检测。
透镜系统可以调整激光束的聚焦位置和扩展角度，使样品中的细胞逐个通过激光束。
流体系统通过将样品溶液注入流式细胞仪的流体管道中，使细胞以单个细胞的形式通过激光束，避免了背景信号的干扰。
流体系统还可以调节细胞的流速，以控制细胞之间的间隔，避免细胞重叠。
电子计算机系统是流式细胞仪的核心部分，用于控制仪器的运行和获得并分析光信号。
通过相应的软件，可以对细胞进行多参数分析，如细胞大小、形态、DNA含量、荧光标记等。
在流式细胞仪中，细胞通过激光束照射后，会产生散射光和荧光光信号。
散射光主要分为正向散射光（Forward Scatter，FSC）和侧向散射光（Side Scatter，SSC）。
FSC信号反映细胞的大小和复杂度，SSC信号反映细胞内部的结构和颗粒物质。
这些散射光信号可以提供有关细胞的一些形态信息。
荧光染料是流式细胞仪中常用的标记物质，通过与细胞中的特定成分结合，可以用来标记不同的细胞类型、活性分子和细胞内的蛋白质等。
荧光染料在激发后发出特定的荧光信号，可以通过滤光片选择性地收集和检测。
通过同时使用多种荧光染料，可以对不同的生物学参数进行同时分析。
流式细胞仪的数据分析可以通过绘制细胞密度分布曲线、细胞聚类分析、细胞亚群分析等方法进行。
流式细胞仪简介
流式细胞仪简介▲流式细胞仪主要由五部分组成1.流动室和液流系统；2.激光源和光学系统；3.光电管和检测系统；4.计算机和分析系统；5.细胞分选系统1.流动室的基本结构流动室是仪器的核心部件，被测样品在此与激光相交，得到准确的细胞荧光信息。
2.激光源和光学系统通常以激光作为发光源（氩离子气体激光器和小功率半导体激光器）。
被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
3.光电管和检测系统：通过光电转换器转变成电信号而进行测量。
▲二种探测器和二类放大器▲二种探测器:光电二极管和光电倍增管。
光电二极管对光的敏感度低于光电倍增管,用于探测FSC, 因FSC是强信号。
光电倍增管（PMTs）用于探测SSC,FL1,FL2,FL3,因为它们是弱信号。
两类放大器:线性放大器：输出信号辐度与输入信号成线性关系。
对数放大器：输出信号和输入信号之间成常用对数关系。
放大器的作用:可对信号进行微调。
对FSC,SSC,FL1,FL2,FL3可设置放大模式和放大增益。
4.计算机和分析系统经放大后的电信号被送往计算机分析器。
荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后转换为电信号，再通过模／数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
▲流式细胞仪系统流程：标本→激光系统→流动系统→信号处理系统→放大系统→计算机系统→结果打印▲流式细胞仪有关的测量参数及数据处理▲测量参数：检测数据的显示视测量参数的不同有多种形式可供选择。
第一激光（488nm）激发出的FL1,FL2,FL3,第二激光（635nm）激发出的FL4。
▲数据处理：主要包括数据的显示和分析。
流式数据一般用一维直方图、二维散点图来表示。
▲激发光光源波长488nm的示意图▲测量参数：1.散射光信号：前向角散射和侧向角散射（细胞的物理[固有]参数）(1)前向角散射，即FSC与细胞的大小（直径的平方）相关，我们平时上机的时候，有时用FSC做阈值，排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。
流式细胞仪(FlowCytometer)基本原理汇总.
Counts
Event #
FL1 FITC
1
10
2 700
3 720
4
15
……
0…………10…………100…………1000 FITC荧光强度
直方图 Histogram
横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。
DNA倍体分析
抗原表达分析
Overlay图
散点图 Dot Plot
散点图中每个点代表一个细胞，X轴与Y轴分别代表一种参 数，优点是比直方图直观。
FL-2(-)
FITC 单标
PE 单标
FL-2(PE)
FL2 - %FL1 FL-1(FITC)
FL1 - %FL2 FL-1(ion
FL-1(FITC)
After Compensation
FL-1(FITC)
什么样的补偿最合适？
单染管的阴性群体和阳性群体在所需调节通道的荧光Median 值相等时为最合适的补偿。
Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方 式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分 析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈 橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
5% 默认阈值
32% 升高阈值后
荧光素和荧光信号
荧光： 荧光素的电子吸收光的能量由低能态转变为高能态， 再回到低能态时释放出的光。
＜ 激发波长
Excitation wavelength
流式细胞仪名词解释
流式细胞仪名词解释
流式细胞仪是一种用于检测和分离细胞类型的高精度仪器,通过利用液滴的运动方式来检测和测量细胞的类型和数量。
以下是流式细胞仪的一些常见名词解释:
1. 液滴:流式细胞仪中用来检测和测量细胞类型的流动装置,通常由一个光源和一个接收器组成,通过光源将光信号转化为电信号,接收器则将电信号转换为细胞类型的标志。
2. 表面活性剂:流式细胞仪中使用的表面活性剂可以增强细胞表面的黏附性和细胞黏附蛋白的表达,从而更好地分离不同类型的细胞。
3. 细胞模板:流式细胞仪中使用的模板用于固定和标记细胞,以便更好地进行分离和分析。
模板可以是固定化的DNA片段、蛋白质片段或细胞黏附蛋白片段等。
4. 细胞筛选器:流式细胞仪中的筛选器用于筛选特定的细胞类型或细胞系,例如通过选择特定的细胞模板或表面活性剂来分离不同类型的细胞。
5. 细胞分离液:流式细胞仪中使用的分离液用于将不同类型的细胞分离开来,通常包括一些表面活性剂、染料或其他添加剂,以便更好地区分不同类型的细胞。
6. 细胞计数器:流式细胞仪中用于测量细胞数量的工具,通常是一个微流控芯片,可以实时监测液滴的运动,并将运动信号转换为数字信号,从而进行细胞计数。
流式细胞仪是一种高精度、高效率的仪器,可以用于检测和分离各种类型的细胞,有助于医学研究和细胞生物学研究等领域的发展。
随着技术的不断发展,
流式细胞仪的应用范围也在不断扩大。
流式细胞仪
H L
A
D
r
CD117
CD38
CD117 CD117
5
Side Scatter
Forward Scatter
DNA Analysis
Forward Scatter Fluorescence
Forward Scatter
FALS
Fluorescence
FLUORESCENCE
Side Scatter
散射光 信号
侧向角散 射(SSC)
不依赖任何细 胞样品的制备 技术
对细胞膜、细胞质、核膜 的折射率敏感，可提供细 胞内精细结构和颗粒性质 的信息
z 信号检测与存贮、显示、分析系统
荧光信号
依赖细胞样品 的制备技术
细胞自发荧光： 细胞自身发出的微弱荧 光信号
细胞标记荧光： 经过特异荧光标记物标 记，受激发照射得到的 荧光信号，对其进行检 测和定量分析可对样品 细胞进行定性、定量分 析。
流式细胞仪（Flow Cytometer)
流式细胞仪是一种新型高科技仪器，涉及的技术有： 激光技术、流体力学技术、电子物理技术、光电测量 技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗 体技术等。
应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞 或生物颗粒进行快速的、多参数的定量分析和分选的 技术称为流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）。
荧光信号的面积：采用对荧光光通量进行积分测量， 主要用于对DNA倍体测量。
z 荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映 DNA的含量。
z 当形状差异较大，而DNA含量相等的两个细胞得 到的荧光脉冲高度不等时，对荧光信号积分后， 所得到的信号值相等。
荧光信号的宽度：用于区分双连体细胞。
流式细胞仪简介
Confidential
12
分选系统
Confidential
13
Confidential
14
Confidential
2
液流系统 光学系统 电子控制系统 数据分析系统 分选系统
Confidential
3
液流系统
Confidential
光学系统
Confidential
Confidential
8
Confidential源自9Wavelengths
LONG (700nm)
Short Pass Pass Through Filters
电子控制系统
光电二极管
线性放大
模拟数字转换器 电脑储存
光电倍增管
对数放大
Confidential
11
数据分析系统
数据显示: 峰图 ( Histogram ) 点图(Dot Plot) 等高线图(Contour Plot) 密度图 (Density)
横坐标代表荧光信号或散射光 信号相对强度，单位是道数， 可以是线性或对数坐标。 纵坐标一般是细胞数。 横坐标为该细胞一参数相 对含量，纵坐标为该细胞 另一参数的含量，可以将 细胞亚群分开。
Transmitted Blocked
LONG (700nm)
Dichroic Filters
SHORT (500nm)
650 Short Pass (600SP) <650 nm >650 nm
Confidential
550 Long Pass (650LP) >550 nm <550 nm
Transmitted Diflected 90
流式细胞仪
血液科医生常说的“流式”,你知道是什么吗？
血液科医生常说的“流式”，你知道是什么吗？在血液科的诊断和治疗中，流式细胞仪是一种常见的检测工具。
在医生和患者的日常交流中，常会听到血液科医生提到“流式”，那么，究竟流式是什么，它在临床中有怎样的作用呢？接下来，让我们详细了解一下。
什么是流式细胞仪？流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种用于分析细胞数量、表面标记、细胞大小和形状等信息的仪器。
它利用细胞标记荧光染料与细胞中的不同成分结合，通过检测这些荧光标记或物理性质的差异来对不同类型的细胞进行鉴定和分类。
流式细胞仪的原理流式细胞仪的基本原理是使用激光器产生的激光束照射通过悬液中的细胞，激光光束照射到细胞上后，细胞中的荧光标记物会发出荧光信号，这些信号会被探测器捕获并转换为电信号。
根据细胞荧光信号的强度、颜色和形状，流式细胞仪可以对细胞进行定量和定性的分析。
流式细胞仪在临床中的应用流式细胞仪在临床诊断中有着广泛的应用，特别是在血液科领域。
以下是一些流式细胞仪在临床中的主要应用场景：1.白血病鉴定与分类：流式细胞仪可以通过检测白血病细胞表面的不同分子标记来帮助医生对白血病进行鉴定和分类，从而指导治疗方案的制定。
2.免疫功能评估：流式细胞仪可以帮助医生评估患者的免疫功能，检测免疫细胞的种类和数量，从而指导治疗和预后的评估。
3.感染性疾病诊断：流式细胞仪可以通过检测免疫细胞中的感染标记物来帮助诊断感染性疾病，如艾滋病、肝炎等。
4.骨髓移植前后监测：流式细胞仪可以在骨髓移植前后对患者的免疫系统进行监测，评估移植效果和患者的免疫排斥反应。
5.自身免疫性疾病诊断：流式细胞仪可以帮助诊断和监测自身免疫疾病，如风湿性关节炎、红斑狼疮等。
流式细胞仪的优势与传统的显微镜观察细胞相比，流式细胞仪具有以下一些明显的优势：•高通量性：流式细胞仪可以快速分析大批样本，提高检测效率。
•多参数性：流式细胞仪可以同时检测多个参数，如细胞大小、形状、表面标记等，提供更全面的信息。
流式细胞仪概述
由右图可知，空气泵 产生压缩空气，通过鞘 流压力调节器加在鞘液 上一恒定的压力，这样 鞘液以匀速运动流过流 动室，在整个系统运行 中流速是不变的。
（二）激光光源与光束成形系统 激光是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定
（三）光学系统 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片和小孔组成。 滤光片主要分为： 1.长通滤光片 长通滤光片使特定波长以上的光通过。 2.短通滤光片 特定波长以下的光通过。 3.带通滤光片 带通滤光片允许一定波长范围内的光通过
（四）信号检测与分析 当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射区时，细胞内
二、流式细胞仪细胞分选原理
在压电晶体上加上频率为30kHz的信号，使液柱断裂成一连串 均匀的液滴。当某类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流 式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴 充以特定的电荷，带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电 场时，依所带电荷的符号分别向左偏转或向右偏转，落入指 定的收集器内，从而达到细胞分类收集的目的。
二、常用的荧光染料与标记染色
散射光信号是激光照在细胞上所产生的前向光和侧向光 信号。荧光信号来自于细胞的自发荧光或被分析细胞经特 异性荧光标记染色后通过激光束激发后所产生的。 因此，被分析细胞在制备成单细胞悬液后，经过与荧光染 料染色后才能上机进行检测。
焦宁Y与异硫氰酸荧光素（FITC，530nm）分别是RNA与 蛋白质的特异性染料；
（五）细胞分选器
1．小水滴的形成 压电晶体带动流动室振动，液流形成水滴。
喷嘴的振动频率即每秒钟产生水滴的数目。当喷嘴直径 为50μm时，信号频率为40kHz，则每秒钟产生4万个水滴。 若每秒钟流出的细胞是1000个，则平均每40个水滴中只有一 个水滴是有细胞的，其他皆为空白。
流式细胞仪的概念及其发展历史
1 流式细胞仪的概念及其发展历史1．1 流式细胞仪的基本概念流式细胞仪（flow cytonletry，FCM）是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。
流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。
流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。
其特点是：测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量，且在统计学上有效。
1．2 流式细胞仪的发展简史最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年，Moldavan 提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置测量的设想。
1953年Crosland-Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。
其后又经过Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不断改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用。
近20年来，随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作，以扩大FCM的应用领域和使用效果。
宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。
这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等，例举了其在医学和生物工程中的应用，非常适合从事此方面专业研究的人。
由于这本书是13年前出版的，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。
此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说，这本书太复杂太深奥。
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流式细胞仪一、结构技术特点（4个方面）：（1）流动室和液流系统（2）激光源和光路系统（3）光电管和信号测量及计算机分析系统（4）细胞分选系统流式细胞计是对细胞进行自动分析和分选的装置。
它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。
多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。
也就是说，它的细节分辨率为零。
流式细胞计的基本结构二、原理：1、将待测细胞染色后制成单细胞悬液。
2、用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
3、流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
4、这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。
5、光散射信号在前向小角度进行检测，光散射信号基本上反映了细胞体积的大小；6、荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，7、经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
8、计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
9、检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。
单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。
一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。
对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。
10、细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。
在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。
将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。
三、主要应用目前，广泛应用于个体发育、胞移植实验室，用于决定PBSC采集的时机及评价外周血采集液的收益。
其基本原理为荧光免疫分析，即根据外周血与骨髓中HPC表达同样的CD34抗原(CD34+)，并利用荧光标记CD34抗体与HPC膜表面CD34抗原结合，在特定波长的激光照射下，检测CD34+胞发出的荧光强度并结合其光学特性，即较低的侧向散射（SSC）和较高的前向散射（FSC），从而检测CD34+细胞。
CD34+细胞实际上包括所有的HPC，如CFU-GM，红细胞暴发形成单位(BFU-E),巨核细胞形成单位（CFU-Mk）,混合细胞集落形成单位（CFU-Mix）和原始细胞集落形成单位（CFU-Blast）。
后两种HPC明显具有许多干细胞的特征，如它们可以自我更新，也可定向分化为一定数目的造血细胞系。
体内试验也发现，经过致死剂量照射的狒狒移植足够数量的自体CD34+细胞，可以完全恢复其造血功能，同样的现象也可在经过骨髓、摧毁性治疗的病人中出现。
有人认为，CD34+细胞在功能上可根据是否表达CD33抗原而分为2个细胞群。
早期的HPC，如CFU-Blast和LTC-IC仅表达Q CD34抗原（CD34+/CD33-），而较为成熟的定向祖细胞可同时表达CD34和CD33抗原（CD34+/CD33+）。
还有人根据CD38抗原表达与否，将CD34+细胞分为CD34+/CD38-和CD34+/CD38+两个亚型，并且认为LTC-IC 主要分布于CD34+/CD38-亚型，而更为原始的ELTC-IC则仅分布于CD34+/CD28-细胞群，说明CD34+/CD38-亚型性质上更接近PBSC。
回顾性资料表面，移植经历了与移植物中不同分化程度的HPC有关的两个阶段。
起初，与早期造血恢复有关的是移植物中定向祖细胞（committed progenitor cell）；继之，持续性的移植相由多能造血干细胞产生。
因此，周血中不同分化程度的HPC，对指导干细胞采集及移植成功尤为必要。
目前多参数及双参数流式细胞低度均可通过CD34、CD33和CD38抗体等检测标本中不同CD34+细胞亚型，来决定采血的时机和预测移植效果。
Barnett等报道，采集液CD34+细胞数量与外周血中CD34+细胞百分率显著相关（r=0.71），并且认为准确计数循环中CD34+细胞，可更好地预测采集液中造血干/祖细胞含量。
Weaver等观察692例患者外周血祖细胞（PBPC）采集液中CD34+细胞、单个核细胞、集落形成单位的数量与移植动力学关系，认为PBPC采集液中CD34+细胞含量是预移植后中性粒细胞和血小板数量回升最有力的指标。
四、发展的关键流式细胞仪从细胞技术开始发展到今天，60年代至70年代是其飞速发展时期，激光技术、喷射技术以及计算机的应用使流式细胞仪在原理和结构上形成了固定的模式。
80年代则是流式细胞仪的商品化时期，这期间不断有新型号的仪器推出，在多参数检测技术上不断提高。
进入90年代，随着微电子技术特别是计算机技术的发展，计算能力不断提高，流式细胞仪的功能也越来越强大。
在数据管理、数据分析方面有了长足进步。
但是，在技术原理和设计方面并没有突破性的进展。
人们的注意力开始转向流式细胞仪的应用，新的荧光探针、新的荧光染料、新的染色方法不断推出，使流式细胞技术在新的细胞参数分析方面日益发展。
从新推出的仪器看，流式细胞仪会在硬件上不断更新，采用更新的器件（如半导体激光、大规模集成电路），以实现小型化；用数字电路取代模拟电路，充分发挥微处理器的功能以实现简单化；在软件上提高数据自动分析能力，充分发挥图形界面的优点，使操作更加简便。
五、更详细介绍（1）组成1、流动室和液流系统流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。
设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。
样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。
为了保证液流是稳液，一般限制液流速度υ<10m/s。
由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。
流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。
2、激光源和光学系统经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。
常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配和氪离子激光器或染料激光器。
光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。
汞灯是最常用的弧光灯，其发射光谱大部分集中于300～400nm，很适合需要用紫外光激发的场合。
氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强。
免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上，可使用染料激光器。
将有机染料做为激光器泵浦的一种成份，可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。
例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine6G水溶液的染料激光器,则可得到550～650nm连续可调的激光，尤在590nm处转换效率最高，约可占到一半。
为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。
因此需将激光光束经透镜会聚。
光斑直径d可由下式确定：d=4λf/πD。
λ为激光波长；f为透镜焦距；D为激光束直径。
色散棱镜用来选择激光的波长，调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长λ。
为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片。
带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。
例如使用525nm带通滤片只允许FITC（Fluoresceinisothiocyanate,异硫氰荧光素）发射的525nm 绿光通过。
长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。
在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。
3、光电管和检测系统经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。
光电倍增管（PMT）最为常用。
PMT的响应时间短，仅为ns数量级；光谱响应特性好，在200～900nm的光谱区，光量子产额都比较高。
光电倍增管的增益从10到10可连续调节，因此对弱光测量十分有利。
光电管运行时特别要注意稳定性问题，工作电压要十分稳定，工作电流及功率不能太大。
一般功耗低于0.5W；最大阳极电流在几个毫安。
此外要注意对光电管进行暗适应处理，并注意良好的磁屏蔽。
在使用中还要注意安装位置不同的PMT，因为光谱响应特性不同，不宜互换。
也有用硅光电二极管的，它在强光下稳定性比PMT好。
从PMT输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。
流式细胞计中一般备有两类放大器。
一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系，称为线性放大器。
线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例DNA测量等。
另一类是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常用对数关系。
在免疫学测量中常使用对数放大器。
因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群，它们的荧光强度相差1～2个数量级；而且在多色免疫荧光测量中，用对数放大器采集数据易于解释。
此外还有调节便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。
4、计算机和分析系统经放大后的电信号被送往计算机分析器。
多道的道数是和电信号的脉冲高度相对应的，也是和光信号的强弱相关的。
对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目。
多道分析器出来的信号再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件，或存贮于计算机的硬盘和软盘上，或存于仪器内以备调用。
计算机的存贮容量较大，可存贮同一细胞的6～8个参数。
存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现，进行数据处理和分析，最后给出结果。
除上述四个主要部分外，还备有电源及压缩气体等附加装置。
流式细胞计的工作原理（2）参数处理下面分别简要介绍流式细胞计有关的参数测量、样品分选及数据处理等工作原理。