(6)植物激素测定法

（一）原 理
动物体对进入其血液中的外来物质具有免疫性。 将含激素的抗原导入兔子等动物血液中后，动物天然的保卫 机制便产生了专一的抗体蛋白质，即该激素的专一抗体。抗体是 免疫球蛋白，存在于血液的血清部分，只要在注射了抗原几十天 后，把血液进行离心，即可得到抗体部分。抗血清中含有许多球 蛋白（抗体），但只有一种对注射的抗原起反应。
冷冻 干燥
-60℃
低温 保存
（三 ）植物激素的提取
样品 称重
80%甲醇 4℃
匀 浆
0.1M NH4Ac
pH9.0
浸提过夜 4℃
离 心
去残渣 上清液
27000g× 20min
真空冷冻 离心浓缩 上清液
复 溶
超声波 洗脱
离 心
(4℃保存 )
（四）植物激素的纯化和分离
上 清 液
碱性(CKs) 激素 PVPP 柱 DEAE 柱 C18Sep-pak 柱
(IAA 酸性 激素 GAs ABA)
（五）植物激素的定量测定
HPLC测定法：
P 色谱仪：岛津LC-9A型高效液相色谱分析仪 SPD-6AV紫外检测器 Waters C18反相柱（4.6×250mm,5μm） P 色谱条件：柱温40℃ 流动相40%甲醇 (pH3.4) 进样15μl 流速 0.5ml.min- 1 UV254nm 紫外检测 外标法定量, 并测定回收率
大都是基于不同物质在不同介质中有不同的分配系 数，生长素测定用这样的方法灵敏度可达到10-12g的水平， 相当于一个豌豆茎切段或一个玉米谷粒中的生长素含量。
三、免疫分析法
放射免疫检测法 (radioimmunoassay， RIA) 酶联免疫吸附检测法 (enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)
植物激素测定法
（measurement of plant hormones）
一、生物测定法
生物测定法是通过激素作用于植株或离体器官后 所产生的生理生化效应的强度，从而间接测定植物激 素含量的一种常用的方法。如生长素的生物测定，可 用小麦胚芽鞘切段伸长法，即将小麦胚芽鞘对生长素 敏感的部分切成一定长度的小段，漂浮在含有生长素 的溶液中，这些切段在生长素溶液中伸长。在一定浓 度范围内，芽鞘切段的伸长与生长素浓度的对数成正 比，因而把芽鞘切段在样品提取液中的伸长与标准液 中的切段伸长相比，即可测到样品中的生长素含量。
二、物理和化学方法
薄层层析法（thin layer chromatography，TLC） 气相色谱（gas chromatography ，GC） 高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC） 质谱法（mass spectrography，MS）
样品中IAA
3H-IAA-Antibody
less tracer more tracer
放射性比活度测定
IAA-Antibody
more sample IAA Less sample IAA
样品IAA浓度与3H的比活度的负半对数成线性相关
（二）植物样品的采取和预处理
新鲜植 物材料
蒸馏水冲洗
液氮 处理
当抗体和抗原相互接触时产生沉淀，可用不同的已知浓度的 抗原对抗原抗体沉淀量作图得出标准曲线，如用放射性抗原，可 测定放射性来定量，常用的有3H，125I 等。
IAA + BSA
injection
Rabbit
3H-IAA
植物样品
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ提取纯化
甲酰化
Serum
标准 3H-IAA-Met
Antibody
免疫反应； （NH4）2SO4沉降
植物激素标准样品色谱图：
待测样品中植物激素色谱图：
回收率测定：
将配制的混合标准植物激素样品(含 IAA +ABA+ZT) 经过与待测植物样品同步的提取、纯化和分离程序后测
定回收率,以回收率对植物样品测定结果进行校正。
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