偏肺病毒逆转录实时荧光定量PCR的建立及应用(新)
实时荧光定量PCR的研究进展及其应用
实时荧光定量PCR的研究进展及其应用一、本文概述实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在分子生物学领域广泛应用的分子生物学技术，它能够在PCR 扩增过程中实时监测反应产物的积累，从而精确地定量目标DNA或RNA的初始浓度。
自20世纪90年代诞生以来，qPCR技术以其高灵敏度、高特异性、快速性和定量准确等优点，在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等多个领域发挥了重要作用。
随着技术的不断发展和完善，实时荧光定量PCR已成为现代生物学研究中不可或缺的工具。
本文旨在全面综述实时荧光定量PCR技术的最新研究进展，包括其原理、方法、技术优化、应用领域的拓展以及面临的挑战等。
文章首先简要介绍qPCR技术的基本原理和常用方法，然后重点论述近年来在技术优化、多重PCR、数字化PCR等方向上的进展。
接着，本文详细探讨实时荧光定量PCR在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等领域的应用案例和前景。
文章还将讨论实时荧光定量PCR面临的挑战，如引物设计、数据分析等问题，并提出相应的解决方案。
通过本文的综述，读者可以对实时荧光定量PCR技术的最新进展和应用有一个全面的了解，为相关研究提供参考和借鉴。
二、实时荧光定量PCR的基本原理与技术特点实时荧光定量PCR（Real-time Fluorescent Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在PCR扩增过程中，通过对荧光信号的实时检测，对特定DNA片段进行定量分析的技术。
其基本原理是利用荧光染料或荧光标记的特异性探针，在PCR反应过程中实时检测PCR产物量的变化，从而得到DNA模板的初始浓度。
实时性：通过荧光信号的实时检测，可以实时了解PCR产物的生成情况，无需PCR结束后进行电泳等后续操作，大大缩短了实验时间。
定量性：通过标准曲线的建立，可以准确地计算出DNA模板的初始浓度，实现了PCR的定量分析。
实时荧光定量PCR的原理操作及其应用
实时荧光定量PCR的原理操作及其应用实时qPCR的基本原理是利用DNA模板进行PCR扩增，并通过特定荧光探针或抑制剂标记扩增产物，荧光信号的强度与目标模板数量成正比。
PCR扩增过程中，荧光信号逐渐累积，通过荧光检测系统实时监测荧光的强度变化，可以获取PCR扩增曲线，并通过比较样品的荧光信号与标准曲线建立一个浓度与荧光信号的转换关系，从而确定样品中目标物质的数量。
实时qPCR的操作过程通常包括以下几个步骤：1.准备反应体系：根据所需扩增物质选择合适的引物和探针，并根据样品数量和扩增条件计算所需反应体系的配方。
反应体系中通常包括DNA模板、引物、探针、dNTPs、缓冲液和DNA聚合酶等。
2.设定PCR程序：根据不同引物的特性和样品的要求，设置PCR程序。
PCR程序通常包括一个初始变性步骤，多个循环变性/退火/延伸步骤和一个终止步骤。
循环变性/退火/延伸步骤的温度和时间通常根据引物的需求进行设定。
3.反应体系装填：将反应体系装入PCR管或耐热反应板中，确保样品和反应物均匀分布。
4.实时监测：将PCR反应体系置于实时荧光PCR仪中，根据设定的PCR程序进行扩增，并实时监测荧光信号的累积变化。
5.数据分析：根据荧光信号的变化情况，可以绘制PCR扩增曲线，并通过计算荧光信号的阈值周期数（Ct值）来确定样品中目标物质的相对数量。
比较不同样品的Ct值，可以进行定量分析。
实时qPCR具有广泛的应用。
1.基因表达分析：可以通过实时qPCR检测特定基因在不同组织或样品中的表达水平，从而研究基因在生理和病理过程中的作用。
2.病原体检测：实时qPCR可以用于快速、准确地检测和鉴定病原体，如细菌、病毒和寄生虫等，对于临床诊断和流行病学研究具有重要意义。
3.检测基因突变：实时qPCR可以用于检测个体中基因突变的存在与否，并进行基因型分析，从而研究与疾病相关的突变和遗传变异。
4.微生物学研究：可以通过实时qPCR检测微生物的数量和动态变化，了解其在环境中的分布和生物地理学特征，以及其在食品安全、环境保护等方面的应用。
实时荧光定量PCR技术的研究进展与应用
实时荧光定量PCR技术的研究进展与应用实时荧光定量PCR技术的研究进展与应用引言实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative polymerase chain reaction）是一种基于PCR技术的分子生物学方法，可用于精确测量目标DNA或RNA的数量。
该技术在许多领域得到了广泛的应用，如医学诊断、基因表达分析、病原体检测以及环境监测等。
一、实时荧光定量PCR技术的原理实时荧光定量PCR技术基于PCR反应过程中，目标DNA（或RNA）序列的指数级扩增特性。
该方法需要引物与目标序列相互结合，合成适量的荧光探针用于监测PCR过程中目标序列的扩增程度。
其中，引物是起始特异性扩增的核酸片段，荧光探针含有荧光染料和荧光阻断剂。
当探针结合至目标序列时，就会被5'→3'外切酶降解，并释放荧光信号，实时监测PCR反应进程。
二、实时荧光定量PCR技术的优势1. 高灵敏度和高精确度：实时荧光定量PCR技术通过荧光信号的动态监测，可准确测量目标序列的扩增数量。
其灵敏度能够达到单个拷贝级别，且可靠性高，消除了传统PCR中间断性的'瓶颈'效应。
2. 快速和高通量：相比传统PCR技术，实时荧光定量PCR所需的时间更短，反应速度快。
通过多重PCR反应孔，可以同时测定多个样品，提高了检测效率。
3. 广泛的应用范围：实时荧光定量PCR技术不仅适用于基因表达、基因突变和SNP（单核苷酸多态性）的检测，还可用于病原体的检测和定量，如病毒感染、细菌感染等。
4. 可靠的检测结果验证：通过内参基因和集成阳性对照，可以消除检测结果偏差，确保检测结果的准确性和可靠性。
三、实时荧光定量PCR技术的应用1. 医学诊断：实时荧光定量PCR技术在临床医学诊断中具有很大的潜力，可用于早期肿瘤标志物、病原体和遗传疾病的检测与定量。
例如，可通过检测突变基因来判断特定癌症患者对某些药物的敏感性，从而为精准化治疗提供依据。
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR，Real-time qPCR）是一种通过荧光信号实时测量PCR产物累积量的技术，可以在PCR反应过程中实时监测PCR 产物的数量。
这种技术结合了常规PCR技术的放大特异性和荧光标记探针的特异性探测，使得PCR分析更加准确、精确。
实时荧光定量PCR技术广泛应用于基因表达分析、病原体检测、细胞检测、突变分析等领域。
下面将分别介绍该技术在不同领域的应用研究进展。
在基因表达分析中，实时荧光定量PCR可用于测量特定基因在不同组织或不同发育阶段中的表达量。
该技术的灵敏度高、动态范围广，并可同时分析多个基因。
通过实时监测PCR产物的累积，可以获得准确的基因表达水平。
实时荧光定量PCR还可以用于研究非编码RNA的表达，如长非编码RNA（lncRNA）和微小RNA（miRNA）。
在病原体检测中，实时荧光定量PCR可用于快速、准确地鉴定和定量各类病原体。
各类病毒、细菌、真菌等的快速检测和定量分析。
由于实时荧光定量PCR具有高灵敏度和高特异性，能够在短时间内完成大量样本的分析，广泛应用于临床诊断和食品安全领域。
在细胞检测中，实时荧光定量PCR被用于检测细胞中的特定基因表达水平，并研究基因在细胞中的调控机制。
通过测量细胞内转录因子基因的表达变化，可以了解基因调控网络的变化情况。
在突变分析中，实时荧光定量PCR可用于检测某一基因的突变频率，如药物抗性相关基因的突变频率。
通过实时监测突变型和野生型基因的相对数量，可以计算出突变频率，为个性化药物治疗提供参考。
实时荧光定量PCR技术具有高灵敏度、高特异性、高准确度和高通量性等优点，在生命科学研究和临床应用中发挥着重要作用。
随着技术的不断进步和应用领域的不断拓展，实时荧光定量PCR技术在分子生物学领域的应用前景将更加广阔。
实时荧光定量PCR技术的原理及应用
实时荧光定量PCR技术的原理及应用在PCR扩增反应结束之后，可对扩增产物进行定性和定量的分析。
但是无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。
但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR扩增之前的起始模板量。
例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。
在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，实现了PCR从定性到定量的飞跃。
1.实时荧光定量PCR技术的基本原理在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
所谓实时荧光定量PCR技术，是指通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。
一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段, 荧光信号指数扩增阶段和平台期。
在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。
而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA 拷贝数。
只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。
在扩增曲线中：荧光阈值(threshold)是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光本底信号(baseline)标准差的10倍；Ct值的含义是指在PCR循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数,也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环次数；Rn+表示每点测量的荧光强度,代表反应管含有模板DNA ;Rn-表示荧光基线强度,代表反应管不含有模板DNA,其在理想情况下是一条平线,只具有背景荧光数值;ΔRn表示PCR过程中,探针降解的量,也即PCR产物的量；基线( baseline)是背景曲线的一段,范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定,到所有反应管的荧光都将要但是还未超出背景。
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展实时荧光定量PCR (qPCR) 技术是一种快速检测DNA或RNA的工具，它以实时监测荧光信号的增长来定量PCR产物。
qPCR技术可以广泛应用于医学、生物学、环境科学和工业等领域，是研究基因表达、突变、多样性和病原体检测的常用方法之一。
近年来，qPCR技术取得了很多进展。
其中一个重要的进展是新型荧光探针的发展。
新型荧光探针不仅可以更快地生成荧光信号，而且还可以改善信噪比和基线噪音。
例如，使用SYBR Green和TaqMan探针等新型探针的qPCR技术可以快速准确地检测DNA、RNA和病原体，并且能够检测到非常低的样本浓度。
另一个重要的进展是高通量qPCR技术。
高通量qPCR技术可以在更短的时间内处理更多的样本，并且能够实现高度精确的定量。
在生物学研究中，高通量qPCR技术已被广泛应用于基因表达分析、SNP分型和基因组分析等领域。
此外，qPCR技术的自动化和微型化也是一个重要的进展，使得qPCR技术更快、更简单、更安全和更可靠。
自动化和微型化的qPCR技术可以大大提高生产效率，减少操作和重复步骤，同时也能够减少样本使用量和技术偏差。
qPCR技术在医学、生物学、环境科学和工业等领域中有着广泛应用。
其中，在医学领域，qPCR技术已被广泛应用于病原体检测、基因表达分析和诊断等方面。
在生物学研究中，qPCR技术已被广泛应用于基因表达分析、SNP分型和基因组分析等领域。
在环境科学中，qPCR技术能够检测自然环境中的微生物、重金属和有机物污染物等。
在工业领域，qPCR技术也被应用于食品安全检测和基因工程产品检测等方面。
总的来说，qPCR技术在科学研究和实际应用中具有广阔的前景。
随着新技术和新应用的出现，我们相信qPCR技术将在未来得到更广泛的应用。
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展
一、实时荧光定量PCR技术原理及方法
实时荧光定量PCR技术是一种结合了PCR和荧光信号检测的新型分析技术。
其原理是通过引入一种荧光探针或染料，使PCR反应进行过程中产生的DNA片段或RNA片段能够发出荧光信号，从而实现对PCR产物的实时监测和定量分析。
在实时PCR过程中，荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，因此可以通过测定荧光信号的强度来定量PCR产物的数量。
实时荧光定量PCR技术的方法包括SYBR Green I法和探针法两种。
SYBR Green I法是利用SYBR Green I染料与DNA双链结合时发出荧光的特性，实现对PCR产物的定量分析。
探针法则是引入一种特定的探针分子，当探针与PCR产物结合时，荧光信号会产生变化，从而进行定量分析。
两种方法各有优缺点，研究者可根据具体实验需求选择合适的方法进行实时PCR分析。
实时荧光定量PCR技术在医学诊断中具有重要的应用价值。
它可以用于病原体检测，如病毒、细菌等的快速定量分析。
通过设计特异性的引物和探针，可以实现对病原体的快速检测和定量分析，为临床诊断提供重要的依据。
实时荧光定量PCR技术还可以用于基因突变的检测，如常见的遗传病突变、肿瘤基因突变等。
通过对基因突变的定量分析，可以为临床诊断和治疗提供重要的信息。
实时荧光定量PCR技术还可以用于药物代谢酶基因的表达分析，从而指导个体化药物治疗。
实时荧光定量PCR技术在医学诊断中有着广泛的应用前景，有望成为未来医学诊断的重要手段。
实时荧光定量pcr的原理及应用
实时荧光定量PCR的原理及应用1. 简介实时荧光定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction，简称qPCR）是一种强大的分子生物学技术，能够在同一反应体系中完成DNA扩增和定量，具有高灵敏度、高特异性和高精确性的优势。
本文将介绍实时荧光定量PCR 的原理和应用。
2. 原理实时荧光定量PCR基于传统PCR技术的基础上，引入荧光染料或探针来实时监测PCR反应过程中产生的增量扩增DNA量。
其原理如下：1.DNA模板的变性：通过加热将DNA模板的双链DNA变性成两个单链。
2.引物结合：待扩增的特定DNA序列的引物（Forward primer和Reverse primer）与模板DNA的互补序列结合。
3.DNA聚合酶扩增：DNA聚合酶沿着模板DNA链酶解附近的单链DNA，并将新的DNA链合成。
4.荧光信号监测：引入特定的荧光染料（如SYBR Green）或探针（如TaqMan探针），实时监测PCR反应体系中DNA扩增量的变化。
5.数据分析：使用特定的PCR仪器记录和分析荧光信号，根据荧光信号的变化量确定目标DNA序列的起始量。
3. 应用实时荧光定量PCR技术在许多领域中有广泛的应用，主要包括以下方面：3.1 疾病诊断与检测实时荧光定量PCR可以用于快速检测和诊断各种疾病，例如：•新型冠状病毒（COVID-19）检测•癌症标志物的检测•细菌和病毒感染的检测•遗传性疾病的检测3.2 基因表达分析实时荧光定量PCR可以用于研究基因的表达水平，包括：•基因表达差异分析•基因调控网络的研究•基因表达谱的分析•转录因子的研究3.3 环境监测实时荧光定量PCR可以应用于环境监测领域，用于检测和量化环境中的微生物和污染物，例如：•水质监测中细菌和病毒的检测•土壤中污染物降解菌的鉴定和定量•空气中微生物的检测3.4 遗传学研究实时荧光定量PCR在遗传学研究中也有广泛的应用，包括：•DNA定量和质量检测•突变检测和鉴定•群体遗传学分析•基因组学研究4. 总结实时荧光定量PCR技术是一种准确、高效、灵敏的分子生物学技术，广泛应用于医学、生物学、环境科学和农业等领域。
实时荧光定量PCR技术在病毒载量监测中的应用
实时荧光定量PCR技术在病毒载量监测中的应用实时荧光定量PCR技术（Real-time PCR，RT-PCR）是一种快速、灵敏、特异的分子生物学检测技术，已经在病毒载量监测中得到广泛应用。
本文将介绍RT-PCR技术的原理和特点，以及其在病毒载量监测中的应用。
一、RT-PCR技术原理及特点RT-PCR技术是一种基于PCR技术的升级版，可以实时监测PCR 反应过程中产生的DNA量。
其原理主要包括三个步骤：逆转录、扩增和检测。
首先，逆转录过程将RNA模板转录成互补的DNA（cDNA）。
逆转录酶会在反应体系中将RNA作为模板合成相应的cDNA，从而方便后续的扩增反应。
然后，在扩增步骤中，特定引物与模板DNA结合，并以DNA聚合酶为媒介，在不断提高的温度下，进行多轮循环扩增，产生指数级增加的DNA拷贝数。
最后，通过使用特异性荧光探针或SYBR Green等荧光染料进行检测，可实时监测PCR反应体系中的DNA数量。
荧光信号与PCR反应的进程成正比，从而实现定量测量。
RT-PCR技术具有高度的灵敏度和特异性，可以在短时间内全面检测病毒载量。
此外，RT-PCR技术还具有高通量、高自动化和高精确性的特点，能够满足大规模病毒监测的需求。
二、RT-PCR技术在病毒载量监测中的应用1. 临床诊断RT-PCR技术可用于临床中的病毒性疾病的早期诊断。
例如，在新型冠状病毒（COVID-19）疫情期间，RT-PCR技术被广泛用于检测感染者的样本，快速准确地筛查出阳性患者，为及时隔离和治疗提供了重要依据。
2. 疫苗研发在疫苗的研发过程中，RT-PCR技术也扮演了重要角色。
通过检测动物试验阶段的病毒载量，研究人员可以评估候选疫苗的效果，为下一步研发提供依据。
此外，RT-PCR技术还可以对疫苗生产过程中的原材料和成品进行监测，确保疫苗质量。
3. 病毒追踪在流行病学调查和疫情溯源中，RT-PCR技术可以追踪病毒的传播路径和变异情况。
通过对不同地区、不同时期样本的病毒载量进行监测，可以及时发现病毒的变异和不同毒株的传播情况，为疫情防控提供指导。
实时荧光定量PCR的原理操作及其应用
实时荧光定量PCR的原理操作及其应用实时荧光定量PCR的基本原理是在PCR反应体系中添加一种或多种荧光标记的探针，它与目标序列的特定区域互补，当探针与目标序列结合时，荧光信号被激发，产生荧光发射。
随着PCR反应的进行，目标序列的数量增加，荧光信号也随之增强。
通过实时监测PCR扩增过程中的荧光信号强度的变化，可以推断出起始模板的数量。
操作上，实时荧光定量PCR主要分为两个步骤：反转录和PCR。
首先，反转录将RNA逆转录合成cDNA，得到DNA模板。
然后，在PCR反应中，将DNA模板与荧光标记的探针、引物和核酸酶混合，开始PCR扩增。
PCR反应体系中的荧光探针在PCR扩增过程中的特定温度下与目标序列结合，产生荧光信号。
荧光信号被特定的光学设备检测和记录，得出PCR产物的数量。
实时荧光定量PCR具有广泛的应用领域。
在基因表达分析方面，qPCR可以用来定量测量特定基因的转录水平，研究基因的表达模式和差异。
在病原微生物检测方面，qPCR可以快速、准确地检测和鉴定细菌、病毒和寄生虫等病原体。
在遗传疾病诊断和监测方面，qPCR可以检测一些突变、插入或缺失等遗传变异，并进行遗传病的筛查与诊断。
此外，qPCR还可以用于检测和定量分析环境样品中的微生物、植物和动物等生物种群，了解物种多样性、群落结构和生态系统功能。
实时荧光定量PCR的优点包括高灵敏度、高特异性、高准确性和高重复性。
与传统PCR方法相比，qPCR不需要进行凝胶电泳分析，减少了实验操作的时间和手动操作的误差。
另外，荧光定量PCR还可以采用多通道检测不同靶标，提高实验的高通量性。
然而，实时荧光定量PCR也有一些局限性。
首先，荧光标记的探针需要根据目标序列的特点设计，设计不当可能会导致假阳性或假阴性结果。
其次，荧光信号的准确性受到反应物质的浓度和质量的影响，需要进行严格的实验操作和数据分析。
此外，实时荧光定量PCR的设备和试剂比传统PCR更昂贵，需要专业的实验室设施和经验。
实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用
实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用随着分子生物学和遗传学的发展，实时荧光定量PCR技术（quantitative real-time PCR）在生物医学研究和医学检测中得到了广泛的应用。
实时荧光定量PCR技术是PCR技术的一种改良版，能够实时监测PCR反应的进程，实现对DNA或RNA的定量分析。
本文将综述实时荧光定量PCR技术的研究进展以及其在医学领域中的应用。
一、实时荧光定量PCR技术的原理及方法实时荧光定量PCR技术利用特定荧光探针以及相应的荧光探测系统，通过测量荧光信号的增加来定量分析PCR反应中基因的拷贝数。
具体步骤如下：首先，通过DNA提取或RNA提取获得待检测物质的样本。
接着，将获得的DNA或RNA经过逆转录反应合成cDNA，以备进行PCR扩增。
然后，在PCR反应混合液中加入特定引物和荧光探针。
引物是用于扩增待检基因的片段，而荧光探针则是用于实时监测扩增过程中产生的DNA量。
荧光探针通常由一个碱基特异的标记染料和一个荧光供体相连，当探针与待检基因的DNA结合时，标记染料和荧光供体的空间关系发生改变，导致荧光强度的变化。
接下来，在实时荧光定量PCR仪中进行PCR扩增。
仪器通过加热、冷却等步骤循环进行，同时测量荧光信号的强度。
实时荧光定量PCR技术能够在PCR反应过程中记录和监测荧光信号的增加，从而实现对样本中待检基因的定量分析。
最后，根据荧光信号的强度变化，通过标准曲线法或绝对定量法计算出待检基因在样本中的拷贝数。
标准曲线法通过制备一系列浓度已知的标准品，绘制标准曲线并求出待检样品中的基因拷贝数。
绝对定量法则是通过计算PCR反应的阈值周期数（Ct值）并结合样品的稀释倍数得出基因拷贝数。
二、实时荧光定量PCR技术的应用实时荧光定量PCR技术在医学领域中的应用广泛且多样，以下列举了其中几个典型应用：1. 疾病诊断实时荧光定量PCR技术能够定量检测体内的病原体，如病毒、细菌等，并帮助医生进行疾病的早期诊断。
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展实时荧光定量PCR技术是近年来迅速发展的一种生物技术手段，它具有快速、精准、高灵敏度和高特异性等特点，被广泛应用于基因表达分析、基因型鉴定、细菌和病毒等微生物检测、肿瘤标志物测定等多个领域。
本文将介绍实时荧光定量PCR技术的原理、方法及其在不同领域中的应用研究进展。
一、实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术是一种将PCR扩增与实时荧光检测相结合的技术，它可以同时进行DNA扩增和检测，实时监测扩增过程中荧光信号的强度，从而直接定量目标DNA的含量。
其原理主要包括引物设计、扩增反应、荧光探针和检测系统。
1. 引物设计实时荧光定量PCR技术需要使用两对引物，分别是特异性引物和荧光标记的引物。
特异性引物即PCR扩增所需的引物，而荧光标记的引物是一种能够与目标DNA结合并产生荧光信号的特殊引物。
2. 扩增反应扩增反应是实时荧光定量PCR的核心部分，它通过多轮循环反应使目标DNA序列不断扩增，同时释放出荧光信号。
荧光信号的强度与目标DNA的数量成正比，可以实时监测扩增过程。
3. 荧光探针在扩增反应中加入荧光标记的探针，这种探针通常由一个荧光素和一个受体组成，当探针与目标DNA结合时，荧光素就会释放出荧光信号。
4. 检测系统实时荧光定量PCR技术需要使用专门的实时荧光PCR仪来检测荧光信号，不同的仪器有不同的检测系统，但原理基本相同，即通过检测荧光信号的强度来定量目标DNA的含量。
实时荧光定量PCR技术主要包括SYBR Green I法和探针法两种方法。
1. SYBR Green I法SYBR Green I是一种DNA结合染料，可以与PCR扩增产物结合并产生强烈的荧光信号。
使用SYBR Green I法时，需要同时使用特异性引物和SYBR Green I染料，PCR扩增产物会结合SYBR Green I染料产生荧光信号，实时检测扩增过程中的荧光强度。
2. 探针法探针法是另一种实时荧光定量PCR技术，它需要使用荧光标记的探针来与目标DNA结合产生荧光信号。
实时荧光定量pcr技术原理与应用
实时荧光定量pcr技术原理与应用实时荧光定量PCR技术原理与应用一、引言实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative PCR，qPCR）是一种基于荧光信号的PCR方法，可以实时监测PCR反应的进程。
相比传统的末端定量PCR方法，qPCR具有更高的灵敏性、准确性和可靠性。
本文将介绍qPCR的原理和应用。
二、原理qPCR利用荧光探针在PCR过程中发出的荧光信号来定量PCR产物的数量。
其原理基于PCR技术，但在反应过程中引入了荧光探针。
在PCR反应的扩增过程中，荧光探针与靶DNA序列特异性结合，通过荧光信号的增强来检测靶DNA的数量。
qPCR的主要荧光探针有两种：TaqMan探针和SYBR Green探针。
TaqMan探针是一种双标记探针，它包含一个荧光染料和一个荧光淬灭剂。
在PCR反应中，TaqMan探针与靶DNA序列结合后，酶的活性将荧光染料释放出来，产生荧光信号。
SYBR Green探针是一种非特异性结合荧光染料，其荧光信号与PCR产物的数量成正比。
三、应用1. 基因表达分析qPCR广泛应用于基因表达分析。
通过检测靶基因的mRNA水平，可以评估基因的表达情况。
qPCR可以检测低表达基因和高表达基因之间的差异，并对基因调控进行定量研究。
这对于研究基因功能、诊断疾病以及药物开发具有重要意义。
2. 病原体检测qPCR在病原体的检测和诊断中起着重要作用。
通过设计特异性引物和荧光探针，可以快速、准确地检测病原体的DNA或RNA。
例如，在临床诊断中，qPCR被广泛用于检测病毒、细菌、真菌等致病微生物。
3. 遗传疾病筛查qPCR也被用于遗传疾病的筛查。
通过检测患者的DNA样本，可以准确判断某些遗传疾病的患病风险。
例如，qPCR可以检测染色体异常、突变等遗传变异，为遗传咨询和疾病预防提供重要依据。
4. 肿瘤标记物检测qPCR在肿瘤标记物检测中也有广泛应用。
通过检测肿瘤相关基因的表达水平，可以评估肿瘤的发生和发展情况。
实时荧光定量PCR技术在临床中的应用
实时荧光定量PCR技术在临床中的应用实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种分子生物学技术，通过检测目标DNA片段的数量，能够实时定量分析DNA，具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点。
这使得实时荧光定量PCR技术在临床领域具有广泛的应用。
本文将从病毒感染、癌症检测、遗传疾病筛查以及微生物检测等方面，详细探讨实时荧光定量PCR技术在临床中的应用。
一、病毒感染的检测实时荧光定量PCR技术在病毒感染的检测中起到了关键作用。
例如，对于新型冠状病毒（COVID-19）的检测，实时荧光定量PCR技术能够快速准确地检测患者样本中是否存在病毒的核酸，实现对病毒感染的早期筛查和追踪。
此外，对于其他病毒感染，如流感病毒、乙肝病毒等，实时荧光定量PCR技术也能够高效地检测病毒的存在，帮助医生作出正确的诊断并进行相应的治疗。
二、癌症检测与监测实时荧光定量PCR技术在癌症的早期检测和监测中具有重要作用。
通过检测癌细胞DNA中特定基因的突变或染色体异常，实时荧光定量PCR技术能够帮助医生确定肿瘤的类型、分级和预后，并指导后续的治疗方案。
此外，通过监测治疗过程中肿瘤DNA的变化，实时荧光定量PCR技术还可以评估治疗效果和判断肿瘤的复发情况，为精准医学提供了重要的实验依据。
三、遗传疾病筛查与诊断实时荧光定量PCR技术在遗传疾病筛查与诊断中起到了至关重要的作用。
对于染色体异常、基因突变等遗传因素引起的疾病，实时荧光定量PCR技术能够准确检测遗传物质中的异常，帮助医生进行早期筛查与诊断。
例如，对于唐氏综合症的筛查，通过检测特定基因的拷贝数变异，实时荧光定量PCR技术能够判断胎儿是否存在唐氏综合症的风险。
四、微生物检测与定量实时荧光定量PCR技术在微生物检测与定量中也有重要的应用。
通过检测特定微生物的DNA或RNA，实时荧光定量PCR技术可以对微生物的存在与数量进行定量分析。
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展一、引言实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种基于PCR原理的新型分子生物学技术，其通过检测实时PCR产物的多个周期的荧光信号强度来定量分析扩增产物的含量，并具有灵敏度高、精确度高和快速性等优势。
自从20世纪90年代起，随着qPCR技术的不断发展，它已成为研究生物学、医学以及环境等领域中重要的应用工具之一。
二、qPCR技术原理qPCR技术是在普通PCR技术的基础上进一步发展和改进而来的，其基本步骤包括：DNA的模板和引物混合，在通过PCR扩增过程中，荧光标记的探针与靶DNA序列特异性结合，发出荧光信号。
qPCR技术通过检测不同周期中荧光信号的变化来获取DNA的数量信息，并可以实时监测PCR反应的进程。
三、qPCR技术的优点1. 高灵敏度和特异性：qPCR技术可以将PCR过程与荧光信号实时检测相结合，能够在扩增过程中及时监测目标物的降解和杂交情况。
2. 准确性高：qPCR技术可以定量分析扩增产物的含量，可以检测区分活动与非活动DNA，避免传统PCR技术的假阳性结果。
3. 高速性：普通PCR技术需要通过凝胶电泳等手段来检测扩增产物，而qPCR技术可以实时监测PCR反应进程，大大缩短了实验时间。
四、qPCR技术在医学研究中的应用1. 基因表达定量：qPCR技术可以通过检测RNA的表达水平来研究基因的表达变化，广泛应用于肿瘤研究、癌症诊断和治疗等领域。
2. 检测病原体：qPCR技术可以对病原体的核酸进行定量检测，快速、准确地判断感染情况，对于临床诊断和预后评估具有重要意义。
3. 个体化治疗：qPCR技术可以通过检测靶基因的表达变化来指导临床用药选择，对于个体化治疗具有指导意义。
五、qPCR技术在环境研究中的应用1. 水质监测：qPCR技术可以通过检测水中特定微生物的数量变化来评估水质的好坏，对于水污染的追踪与监测具有重要作用。
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative PCR，简称qPCR）是一种基于PCR反应的技术，可以实时监测PCR反应产物的累积量。
与传统的定性PCR技术相比，qPCR技术具有更高的灵敏度、准确性和可靠性，已广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因突变分析等领域。
实时荧光定量PCR技术的原理是在PCR反应中加入可与PCR产物结合并发出荧光信号的荧光探针（probe）。
当PCR反应开始时，荧光探针与基因靶标序列的互补区域结合，导致荧光信号增加。
通过监测荧光信号的增加速率，可以实时测定PCR产物的累积量，并根据模板DNA的初始浓度计算出准确的基因拷贝数。
实时荧光定量PCR技术具有许多优点。
由于可以实时监测PCR产物的累积量，所以qPCR技术能够在PCR反应达到平台期之前确定PCR反应的指数增长阶段，从而提高PCR反应的灵敏度。
qPCR技术使用荧光探针作为检测信号，相对于传统的PCR技术，可以提供更为准确的定量结果。
由于qPCR技术使用了全自动化的仪器设备，可以大大提高实验的高通量性和重复性。
实时荧光定量PCR技术已在许多领域得到广泛应用。
在基因表达分析中，qPCR技术可以快速、准确地测定不同基因在细胞或组织中的表达水平，从而揭示基因调控的机制。
在病原体检测中，qPCR技术可以快速、敏感地检测病原体的核酸序列，用于临床诊断和流行病学调查。
在基因突变分析中，qPCR技术可以检测基因序列的差异，用于寻找与疾病发生发展相关的突变位点。
尽管实时荧光定量PCR技术在基因表达分析、病原体检测、疾病诊断等方面具有广泛的应用前景，但也存在一定的局限性。
qPCR技术对样本中存在的PCR抑制剂非常敏感，可能导致结果误差。
qPCR技术需要建立标准曲线来推演目标基因的拷贝数，这个过程需要额外的实验操作和标准样本，增加了实验的复杂性和时间成本。
qPCR技术对PCR反应中的温度控制要求较高，仪器设备的投资也较高。
实时荧光定量PCR原理操作及其应用
实时荧光定量PCR原理操作及其应用实时荧光定量PCR的原理是通过PCR反应循环进行DNA扩增，同时使用特定的荧光探针进行反应监测。
通常使用SYBR Green I染料或荧光探针（例如TaqMan探针或Molecular Beacons）来标记扩增的目标序列。
SYBR Green I染料可以与双链DNA结合，并产生荧光信号，使荧光信号量和PCR产物量成正比。
而荧光探针则与靶标区域特异性杂交，并在PCR 反应中产生荧光信号。
1.DNA/RNA提取：从样品中提取目标DNA或RNA，确保提取的质量和纯度满足后续PCR反应的需求。
2.引物设计：设计和合成适当的引物，用于扩增目标序列。
引物应该具有高特异性，确保只扩增目标序列，而不出现非特异性扩增。
3.qPCR反应体系：配置PCR反应体系，包括引物、模板DNA/RNA，核酸酶、聚合酶、缓冲液和荧光探针（如果使用）。
4.PCR反应程序：设置PCR反应程序，通常包括初步变性、扩增和检测阶段。
PCR循环次数根据目标序列的丰度和检测灵敏度来确定。
5.监测荧光信号：在PCR反应过程中实时监测荧光信号的强度。
根据荧光信号大小可以计算目标序列的拷贝数。
1.基因表达分析：通过qPCR可以定量检测和分析基因在不同生物样品（如组织、细胞）中的表达水平。
2.病原体检测：qPCR可以快速检测和定量病原微生物（如细菌、病毒、真菌）的DNA或RNA，用于临床诊断和流行病学调查。
3.突变分析：qPCR可以检测和定量基因突变，用于遗传病的诊断和研究。
4.体外诊断：qPCR可以用于检测和定量很多疾病相关的生物标志物，如肿瘤标志物、心脏病标志物等，用于疾病的早期诊断和疗效评估。
5.生物学研究：qPCR可以用于研究和分析基因调控、DNA修复、细胞周期等生物过程，以及研究新的基因和基因功能。
总之，实时荧光定量PCR技术可以实时、准确和敏感地定量检测并扩增DNA或RNA的特定序列，具有广泛的应用前景，对于许多研究和诊断领域都具有重要意义。
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative PCR，qPCR）是一种快速、精确、灵敏、特异的基因检测技本，广泛应用于医学、生物学、农业和环境学等领域。
本文将介绍实时荧光定量PCR技术及其原理、应用研究进展。
一、实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术是通过荧光探针标记的PCR产物进行实时监测，利用荧光信号的强度反映靶基因的数量。
其基本原理是将荧光信号的增加与反应过程中的PCR产物数量成正比。
实时PCR技术相比于传统PCR技术具有以下优势：1. 高灵敏度：实时PCR技术可以检测到非常低浓度的DNA或RNA，通常可以达到几十个分子的水平。
2. 高特异性：通过设计特异性的引物和探针，可以避免非特异性扩增产生。
3. 快速性：实时PCR技术可以在几小时内完成PCR反应，相比于传统PCR技术更快速。
4. 定量性：实时PCR技术可以准确地测量靶基因的数量，比较不同样本中的基因表达量或拷贝数。
二、实时荧光定量PCR技术应用研究进展1. 医学领域在医学领域，实时PCR技术被广泛应用于病原微生物的检测与鉴定，包括细菌、病毒、真菌等。
利用实时PCR技术可以快速准确地检测到呼吸道病毒、肠道病毒、HIV等病原微生物，为临床诊断和治疗提供了重要依据。
实时PCR技术还可以用于检测肿瘤标志物、基因突变和表达水平的变化，为肿瘤的早期诊断和预后评估提供了重要手段。
2. 生物学领域在生物学领域，实时PCR技术被广泛应用于基因表达分析、基因型分析、基因突变检测等研究。
利用实时PCR技术可以快速准确地测量基因的表达水平，在研究基因调控、信号转导、分子途径等方面发挥了重要作用。
实时PCR技术还可以进行单细胞PCR分析，研究细胞在不同状态下基因表达的动态变化。
实时荧光定量PCR技术具有快速、精确、灵敏、特异的特点，广泛应用于医学、生物学、农业和环境学等领域。
随着PCR技术的不断发展和改进，相信实时PCR技术在基因检测领域将发挥越来越重要的作用，为人类健康、生物科学研究和环境保护等方面做出更大的贡献。
实时荧光定量PCR技术的研究与应用
文献综述实时荧光定量PCR技术的研究与应用1引言实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术，它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域[1]。
2实时荧光定量PCR技术的原理FQ-PCR是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板的定量及定性分析。
在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
一般而言，荧光扩增曲线可分为3个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。
在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖,无法判断产物量的变化。
而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。
PCR的终产物量与起始模板量之间无线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA 拷贝数。
只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。
与传统PCR技术相比，它具有特异性强、重复性好、定量准确、PCR污染少、自动化程度高等优点。
3实时荧光PCR的分类实时荧光PCR是在扩增产物聚集的过程中连续检测，即实时检测，根据在指数扩增期的产物量来推算初始模板的拷贝数[2]。
实时荧光定量PCR包括探针类和染料类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。
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ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ—ｉｎｆｅｃｔｅｄ
ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ—ＰＣＲ），ｄｅｔｅｃｔ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ
ｄｅｓｉｇｎｅｄ．ＲＮＡ ｓｔａｎｄａｒｄｓ
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万方数据
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ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｓｅｒｉｏｕｓｌｙ．
曼！！！！！！！曼！Ｐ垦！！！！！竺！！垒西！！Ｑ！！！！！！：！！！堕！：！
量ＰＣＲ的敏感性和特异性分别是１００％和９６．１７％。偏肺病毒检出２２例（９．４６％），其中男童１３例
（５．８６％），女童８例（３．６０％）。春、夏、秋、冬的检出率分别是１５．７１％、ｏ％、５．０８％、１１．１１％。偏肺 病毒载量与混合感染、疾病种类、临床症状差异均无统计学意义。结论
该方法是检测偏肺病毒灵
敏度、特异性和重复性均较好的方法；偏肺病毒在兰州地区儿童呼吸道感染中占有重要地位，长期系
统的监测具有重要意义。
【主题词】
逆转录实时荧光定量ＰＣＲ；偏肺病毒
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
Ｚｈｏｕ
Ｊｉｅｙｉｎｇ，Ｌｉｎ Ｙｉｎｇｂｉａｏ，Ｃａｏ Ｙｏｕｄｅ，Ｄｕａｎ Ｚｈａｏｊｕｎ
Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｐｅｏｐｌｅ’Ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｃｈｅｎｚｈｏｕ，Ｃｈｅｎｚｈｏｕ ４２３０００，Ｃｈｉｎａ（Ｚｈｏｕ ＪＹ，Ｌｉｎ ＹＢ）；Ｈｕｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｆ Ｐｅｏｐｌｅ’Ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０００５，Ｃｈｉｎａ（Ｃａｏ ＹＤ）；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｖｉｒａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ
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ｔｘｍｏｌ／Ｌ）０．４ ＩＬｌ，探针（１０ ｔｘｍｏｌ／Ｌ）０．４斗ｌ，模板４．４
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ａｎｄ
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ｗａｓ
ａｎ
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自２０１０年１２月至２０１１年１１月兰州地区急性呼吸道疾病患儿的２２２份下呼吸道临床标本进行偏肺 病毒筛查，同时对阳性标本进行常见呼吸道病毒的共感染筛查，并对偏肺病毒进行相关流行病学分 析。结果方法线性检测范围是１０．１０８拷贝／ｐ，１，最低检测限是１０拷贝／ｐＡ，曲线相关系数是１，扩增 效率是９１．６２％，Ｄ值组内ＣＶ值小于２％。以传统ＰＣＲ产物的测序结果为参照，逆转录实时荧光定
ＧＡ［２｜，扩增
逆转录实时荧光定量方法与鼻病毒、呼吸道合胞病
万方数据
主堡塞堕塑些盎塞壹堂苤查！！！！生！旦箜ｉ！鲞整！塑
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ
ｗｅｒｅ
ＲＴ—ＰＣＲ １３
ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ
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ｗｅｒｅ
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ＭｅｔａｐｎｅｕｍｏＶｉｒｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
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（５．８６％），８
ｃａｓｅ
ｇｉｒｌｓ（３．６０％）．Ｔｈｅ
ｗｅｒｅ
ｒａｔｅ
ｏｆ ｓｐｒｉｎｇ，ｓｕｍｍｅｒ，ａｕｔｕｍｎ
２．２
引物和探针
引物及探针序列：ＨＭＰＶＦ：ＣＡＡ
ＧＴＧ ＴＧＡ ＣＡＴ ＴＧＣ ＴＧＡ ＹＣＴ ＲＡＡ；ＨＭＰＶＲ：ＡＣＴ ＧＣＣ ＧＣＡ ＣＡＡ ＣＡＴ ＴＴＡ ＧＲＡ Ａ：ＨＭＰＶＰｂ：ＴＧＧ
荧光ＲＴ・ＰＣＲ特异性分析
建立的偏肺病毒
ＣＹＧ ＴＹＡ ＧＣＴ ＴＣＡ ＧＴＣ ＡＡＴ ＴＣＡ ＡＣＡ
Ｚｈａｏｊｕｎ，Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｏｊｕｎｄ＠
１２６．ｃｏｒｎ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
ｃｈａｉｎ
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ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｅ
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ＭｅｔａＰｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ
ｒｅｖｅｒｓｅ
用Ｍｅｇａ Ｓｒｉｐｔ
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ｔｒａｎｓｒｉｐｔｉｏｎ及Ｍｅｇａ
Ｃｌｅａｒ ｋｉｔ
试剂盒，纯化后的ＲＮＡ使用核酸蛋白测定仪测定吸 光度值，纯度Ａ：。。／Ａ：。。比值在１．８－２．０间符合要求的 ＲＮＡ作为偏肺病毒ＲＮＡ标准品。
１．６
临床评价和流行病学分析
传统ＰＣＲ产物的
测序结果证实为目的基因的即为阳性，否则为阴性， 以此为标准，对实时荧光定量逆转录ＰＣＲ结果进行 灵敏度和特异度分析。结合病例资料对偏肺病毒的 流行病学进行相关统计学分析。 １．７统计学方法 处理分析。
ａｒｅａ
ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｉｎ Ｌａｎｚｈｏｕ
ｗｉｔｈ
ＡＲＩ．Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｃｏ—ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｖｉｒｕｓｅｓ ｗｅｒｅ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ
ｗａｓ
ｄｅｔｅｃｔｅｄ
ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ；ｆｕｒｔｈｅｒ Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ
ｒｅｌａｔｅｄ
ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
１．３
标准品进行１０倍稀释，在病毒载量１０～１０８拷贝／仙１ 内进行荧光定量ＰＣＲ反应，构建标准曲线，曲线相 关系数是１，扩增效率是９１．６２％，说明本方法在１０ ～１０８拷贝／Ｉｚｌ浓度范围内有很好的线性相关性。 偏肺病毒线性范围检测下限是１０拷贝／斗ｌ。更低的 浓度（１０“拷贝／Ｉｚｌ）能够被检测到，但并不是所有 的重复（６次）都能够被检测到，所以不能认为１０。１ 拷贝／ＩＬｌ是最低的检测限”。。
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００３・９２７９．２０１６．０２．０２６
【摘要】
目的建立偏肺病毒逆转录实时荧光定量聚合酶链反应（ＲＴ—ＰＣＲ），并检测临床样本，
针对保守基因Ｆ合成引物和探针，制备偏肺病
了解偏肺病毒感染患儿的临床流行病学特点。方法
毒转录ＲＮＡ标准品并建立标准曲线，检测线性范围、最低检测限、重复性、灵敏度和特异性。对采集
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】
Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ
ｒｅｖｅｒｓｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ；Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ
人偏肺病毒（ＨＭＶ），２００１年由荷兰学者
Ｖａｎｄｅｎ
目的片段长７８ ｂｐ，位于人偏肺病毒Ｆ基因段。 １．４偏肺病毒反应体系及条件 反应体系：１０斗ｌ
Ｈｏｏｇｅｎ等‘１１首次从儿童呼吸道感染标本中
ｔｈｅ
ｃｌｉｎｉｃａｌ
ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｐｒｏｂｅｓ ｗｈｉｃｈ
ａ
ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｇｅｎｅｓ Ｆ
ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ
ｗｅｒｅ
ｐｒｅｐａｒｅｄ
ｔｏ
ｅｓｔａｂｌｉｓｈ
ｓｔａｎｄａｒｄ
ｃｕｒＶｅ，
ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｔｅｓｔｅｄ．２２２ ｌｏｗｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｗｅｒｅ
２
采用ＳＰＳＳｌ６．０软件进行统计学
结果
２．１
荧光ＲＴ－ＰＣＲ灵敏度分析将偏肺病毒ＲＮＡ
控制中心惠赠；ＤＨ５ ｃｔ感受态细胞购于日本ＴａＫａＲａ 公司，Ｔ４ ＤＮＡ连接酶、限制性内切酶购自美国ＮＥＢ 公司；体外转录和ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒购自美国Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司；ＰＣＲ产物纯化、质粒提取及核酸双 提试剂盒购自德国Ｑｉａｇｅｎ公司。美国Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司的Ｓｔｅｐｏｎｅ ｐｌｕｓ扩增仪。
分离，对所有年龄阶段的个体均易感，能够引起发 烧、咳嗽、喘息、气促、气喘和寒颤旧１等症状，尤其在 幼儿、老年人、免疫功能缺陷和器官移植患者中可以 引起严重的呼吸道感染性疾病。人偏肺病毒属于副 粘病毒科肺病毒亚科偏肺病毒属，是具有包膜包裹 的ＲＮＡ病毒，病毒基因组长１３ｋｂ，包含有９个开放 阅读框架和８个基因，编码９个蛋白质，分别为：Ｐ 蛋白，Ｎ蛋白，Ｍ蛋白，Ｆ蛋白，Ｇ蛋白，Ｌ蛋白，Ｍ２． １，Ｍ２．２，ＳＨ蛋白＂’４。。近些年来，逆转录实时荧光 ＰＣＲ已经成功运用于实验室偏肺病毒检测中，显著 提高了偏肺病毒的检测效率。本研究以兰州１２岁 以下急性呼吸道感染住院患儿为研究对象，应用逆 转录实时荧光ＰＣＲ检测偏肺病毒并进行相关流行 病学统计学分析，这对偏肺病毒的检测和控制具有 科研和监测的双重意义。 １材料与方法 １．１标本来源样本来自２０１０年１２月至２０１ １年 １１月甘肃兰州某医院２２２份急性呼吸道疾病患儿 的下呼吸道ｌ临床标本。患者年龄从１天至１２岁，男 性１３３例，女性８９例。临床诊断包括：急性支气管 肺炎９８例，急性喘息性支气管肺炎８５例，急性上呼 吸道感染９例，新生儿肺炎９例，大叶性肺炎７例， 哮喘３例，急性化脓性扁桃体炎２例，迁徙行支气管 炎２例，支气管哮喘２例，急性疱疹性咽峡炎２例， 迁延性支气管炎１例，多脏器功能竭１例，重症肺炎 １例。 １．２试剂及仪器 偏肺病毒阳性标本由中国疾病