第5章 中药制剂中各类化学成分分析

2、高效液相色谱法：生物碱类成分进行高效液相 色谱分析时，可采用正相、反相和离子对色谱， 其中以反相高效液相色谱应用较多。在反相高效 液相色谱中为了克服游离硅醇基的影响，采取了 以下的措施： (1)流动相方面的改进： A、加入硅醇基抑制剂，最常用的硅醇基抑制剂是 三乙胺; B、在流动相中加入离子对试剂,掩蔽生物碱类成 分的碱性基团; C、在流动相中加入季铵盐试剂，例如在水-甲醇 流动相中加入0.01mol／L的溴化四甲基胺。
2、纸色谱法：
①可用于生物碱盐或游离碱的鉴别。 ②主要是以水为固定相的正相纸色谱法，分离效果常 取决于流动相的性质。 ③利用纸色谱来快速鉴别乌头中双酯类生物碱和醇胺 类生物碱有其独到之处。 ④所用显色剂基本和薄层色谱法相同，但含硫酸的试 剂不适用。
3、高效液相色谱法： ①适合结构十分相似的生物碱的鉴别。 ②在恒定的高效液相色谱条件下，各种生物碱都具有一定 的保留时间，保留时间可作为定性鉴别的参数。用供试品 与对照品相应的保留时间进行比较来鉴别。 ③若色谱条件不能恒定，将已知对照品加入供试品中，利 用峰面积或峰高加大法进行检识。 ④为保护色谱柱，供试品要经滤膜过滤后再进样，色谱柱 前也要使用保护柱。 4、气相色谱法：适用于具挥发性且加热不分解的生物碱 的分离和鉴定。
酚类和羧酸类有苦味酸、苯甲酸等。
无机离子有Cl-﹑Br-等。
①酸性染料比色法：
特点：在一定pH介质中，生物碱盐阳离子与一些酸性染料 阴离子定量地结合为有色离子对，此离子对可定量溶于某 些有机溶剂，然后在一定波长下测定此有机溶剂的吸收度 ，即可按分光光度法计算生物碱的含量。 BH++In(BH+In-) BH+·In-
N
异喹啉
N H
吲哚
（二）理化性质：
1、物理性状：多数为无色或白色结晶性固体，小分子 生物碱有挥发性。个别具有升华性。有的有荧光，多数 味苦。
2、旋光性：大多数生物碱有旋光性，多呈左旋。旋光 性与生理活动密切相关。一般左旋体生理活性强。
3、溶解性： ①大多数生物碱难溶于水，易溶于苯、乙醚、氯仿等亲 脂性有机溶剂。 ②与酸结合生成盐后水溶性增加，但在水中的溶解度有 差异。一般无机酸盐的水溶性大于有机酸盐；无机酸盐 中含氧酸盐的溶解度大于卤代酸盐。小分子有机酸盐大 于大分子有机酸盐。 ③季铵型生物碱、具有半极性的N、O配位键的生物碱、 酰胺碱易溶于水。 ④某些小分子或液体生物碱既可溶于水也可溶于亲脂性 有机溶剂。 ⑤含有酸性官能团或酯键的生物碱还可溶于一些碱液或 热苛性碱液。
2、生物体内普遍存在的含氮有机化合物，氨基酸、蛋白 质、核酸及某些含氮维生素除外。
3、植物里存在的生物碱的含量差别较大，但生物碱大多 有明显的生理活性，故常用该成分作定性定量依据。在 植物体中，生物碱往往和有机酸结合成盐的形式存在。 4、含生物碱的中药多分布在防己科、罂粟科、毛茛科、 豆科、小檗科等双子叶植物中，具体药材和相应成分见 书P96～97.
第五章
本章重点：
中药制剂中各类化学成分分析
1 、掌握中药制剂中生物碱、黄酮、三萜皂苷、 醌类成分的定性、定量原理与方法。 2 、熟悉中药制剂中挥发性成分的定性、定量原 理与方法。
第一节
生物碱类成分分析
一、概述： 1、生物碱：是指来源于生物界（主要是植物界）的一类 含氮有机化合物。大多数有较复杂的环状结构，氮原子 结合在环内；因结构中有未共用电子对而多数具有碱性， 可以和酸成盐；大都具有特殊而显著的生理活性。
a将沉淀分离洗净，溶于丙酮（或甲醇），于520～ 526nm（溶于甲醇，λ max为427nm）波长处用分光光度 仪测定吸收度，换算生物碱的含量。雷氏盐在丙酮中的 摩尔吸收系数为106.5(单盐，即雷氏盐与1分子生物碱 结合生成的盐)或213.0(双盐)。故可根据其吸收值A按 下式直接计算样品量而不需绘制标准曲线。 W =（ A/ε）×M×V
1、薄层色谱（扫描）法：薄层色谱技术对生物碱类成分分 离和测定需要结合生物碱的特性提取和纯化，后使用碱性展 开剂或在碱性环境中展开。在薄层扫描定量时，须首先作一 工作曲线，目的是考察工作曲线是否通过原点，其次需要找 出线性范围，以便摸索样品点样量。此外薄层扫描定量还需 要采用随行点样法，以便尽量减小误差. 注意：①选用吸附剂、展开剂及显色方法与薄层鉴别相似， 但更严格。 ②显色剂常用改良碘化铋钾，挥干展开剂后喷洒，显色要均 匀.
③异羟肟酸铁反应：
特点：含酯键的生物碱在碱性介质中加热，酯键水解后 产生的羧基与羟胺反应生成异羟肟酸，异羟肟酸再与 Fe3+生成紫红色的异羟肟酸铁，在一定浓度符合郎伯比 尔定律，可用分光光度法进行含量测定。 注意事项：适用于含酯键的生物碱的含量测定，但供试 品溶液中不能含有其他酯类或羧酸类成分。
（二）单体生物碱含量测定：多用色谱法。
2、分光光度法：多采用单波长光度法测定中药制剂中总 生物碱成分的含量。测定波长可以是被测生物碱本身的 吸收波长，也可是加入试剂显色后的波长。供试品要经 过分离净化才可测定。 (1)直接测定： ①原理：不经过化学反应，利用生物碱自身的光吸收直 接进行分光光度法测定的方法。 ②特点：不加试剂。 ③适用范围：一般用于药味较少、干扰不大的中药制剂 中总生物碱的含量测定。注意溶液中有其他有色物质或 有紫外吸收、荧光吸收的物质时要先排除。
三、定性鉴别： （一）一般理化鉴别：主要应用生物碱沉淀反应 (1)生物碱的酸性水溶液或稀醇溶液中，滴加硅钨酸生成淡黄 色或灰白色沉淀。 (2)生物碱的酸性水溶液或稀醇溶液中，滴加碘-碘化钾试剂 数滴，产生棕色或褐色沉淀。 BH+ + I2-K+I- → BI2HI（棕、褐色） + K+ (3)生物碱的酸性水溶液或稀醇溶液中，滴加碘化铋钾、碘化 汞钾试剂数滴，产生红棕色沉淀、类白色沉淀。 BH+ + BiI3KI → BBiI3HI（红棕色） + K+ BH+ + HgI2KI → BHgI22HI（类白色） + K+ （4）生物碱的水溶液在中性条件下加苦味酸生成黄色沉淀。 （5）雷氏铵盐与季铵碱生成红色沉淀。
②结构中含有酯键的生物碱可与异羟肟酸铁试剂反应 产生紫红色。
6、碱性：
①氮原子的杂化方式（最主要因素）SP3>SP2>SP；
②碱性集团：胍基 > 季铵碱 > N-烷杂环 > 脂肪胺 > 芳胺类（芳杂环）> 酰胺
7、紫外光谱特征：
①结构中有共轭体系的生物碱均有紫外吸收。 ②结构中的氮原子与发色团直接连接或参与发色团的生 物碱，其吸收峰位置与测定时溶剂的pH值有关。
第二节
一、概述：
黄酮类成分分析
1、黄酮：以前黄酮类化合物主要是指基本母核为2-苯 基色原酮类的化合物，现在则是泛指两个苯环（A与B 环）通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物。 是一类重要的天然色素，也是中药中一类重要的有效 成分。 O O
8
1
2
8
1
2'
3'
7 6
2
7 6
1' 3 5 4 6' 5'
式中， W：生物碱雷氏盐沉淀的重量（mg）； M：生 物碱雷氏盐沉淀的分子量; A：吸收度；ε：硫氰酸铬 铵摩尔吸收系数；V：丙酮液毫升数。 本方法不需要标准品，但需注意生物碱雷氏盐沉淀 是生成单盐还是双盐，并要注意样品的净化。
b也可以精密加入过量雷氏盐试剂，滤除生成的生物碱 雷氏盐沉淀，之后用分光光度法测定滤液中过量雷氏 盐的含量，间接计算生物碱的含量。 注意事项： A雷氏盐使用前新鲜配制，沉淀反应需在低温下进行。 B供试品为稀的水溶液，沉淀前应浓缩。溶液中有干扰 物质时，应事先经过纯化处理。 C雷氏盐的丙酮或丙酮-水溶液的吸收值随时间而变化 ，故应尽快测定。
（6）酸水浸出液中的蛋白质、多肽、鞣质等也可以与 沉淀试剂发生反应，造成假阳性结果。所以进行沉淀 反应前，要净化除去干扰成分。
（7）中药制剂中有两种以上中药含有生物碱成分，沉 淀反应定性鉴别就难以说明问题。
（二）色谱鉴别：
1、薄层色谱法：首先用适当的溶剂提取生物碱，提取液 经浓缩后直接或经过必要的净化后，点在薄层板上，层 析后喷洒生物碱显色剂，再根据生物碱的特性，选择特 异的颜色反应或荧光波长进行观察，并应用纯品对照或 标准药材对照，有时须作阴性对照后才能确定成分。 ①吸附剂：硅胶、氧化铝。 ②展开剂：多用氯仿、苯等低极性溶剂，可加入其他溶 剂调整展开剂的极性。 ③因硅胶显弱酸性，强碱性的生物碱在硅胶板上成盐， 易形成复斑，故用硅胶为吸附剂时，一般应用碱性系统 展开剂或使薄层分离在碱性环境下进行。 ④显色剂：常用改良碘化铋钾试剂，有时喷碘化铋钾之 后再喷硝酸钠试剂，可使样本斑点更加清晰。 ⑤也可用碘蒸气，硫酸铈等试剂显色。
（2）离子对萃取比色法：用于中药制剂中微量生物碱 类成分的含量测定。
原理：生物碱在一定pH介质中，与一些试剂定量地结合 为有色离子对，此离子对可定量转溶于某些有机溶剂， 然后在一定波长下测定有机溶剂的吸收度，即可按分光 光度法计算生物碱的含量。
常用做离子对配位体的酸性染料有甲基橙、溴麝香草酚 蓝（BTB）等.
4'
3 5 4
O
色原酮
8
O 2－ 苯 基 色 原 酮
四、含量测定： （一）总生物碱含量测定： 1、化学反应法：使用此法，要求样品供试液中总生物碱成 分纯度高。常用于处方药味少，内含成分简单的制剂。包括 重量分析法和容量分析法（滴定分析法），其中酸碱滴定法 最常用。 酸碱滴定法：①游离生物碱不溶于水，可先将生物碱溶于过 量标准酸溶液中，再用标准碱溶液回滴。 ②生物碱盐在水或乙醇介质中用强碱溶液滴定。一般使其溶 于90％乙醇溶液中（因在70%～90%乙醇介质中终点比在水中 明显），可用标准碱乙醇液滴定，用酚酞作指示剂。 ③若选择的溶剂及指示终点方法合适，还可用非水滴定法。
二、结构特征及理化性质：
（一）结构特征：生物碱大多由C、H、N、O元素组成， 结构复杂，种类多。通常根据氮杂环的结构特点不同将 生物碱分为多种结构类型，常见的有吡咯类、蒎啶类、 吲哚里西啶类、莨菪烷类、喹啉类、异喹啉类 、吲哚 类等。
N H
吡咯
N H
N
吲哚里西啶
蒎啶
N CH3 H
N
喹啉
莨菪烷
c选择适宜的酸性染料是本法关键之三：最好用溴麝香草 酚蓝（BTB）。 d应防止操作时混入水分。有机溶剂提取液可加入脱水剂 （如无水硫酸钠）或经滤纸滤过除去微量水分。
②雷氏盐比色法： 特点：雷氏盐(NH4〔Cr(NH3)2(SCN)4〕·H2O)在 酸性介质中可与生物碱类成分定量地生成难溶于 水的生物碱雷氏盐沉淀，此沉淀易溶于丙酮，其 丙酮溶液所呈现的吸收特征，是由于分子结构中 的硫氰酸铬铵部分，而不是结合的生物碱部分， 其吸收值与生物碱样品本身或溶剂无关。因此， 有两种方法计算样品中生物碱的含量：
注意事项： a选择适宜的pH值是本法关键之一：pH值低生物碱呈阳离 子而酸性染料为游离状态。 pH值高则酸性染料呈阴离子 但生物碱为游离状态。两情况阴阳离子均不能定量结合。 pH值的选择根据染料性质和生物碱碱性确定。
b选择适宜的有机溶剂是本法关键之二：要求对离子对溶 解度好且无水，常用氯仿、二氯甲烷等。
4、沉淀反应：
①大多数生物碱在酸性水溶液中可以与某些试剂生成 不溶于水的复盐或分子复合物。 沉淀试剂多为分子量 较大的碘化物复盐，重金属盐，大分子酸类等。常用 的有：碘化铋钾、碘-碘化钾等。
②注意假阳性的干扰。它们是酸水浸出液中的蛋白质 、多肽、鞣质。所以进行沉淀反应前，要净化。
5、显色反应：
①生物碱在一定pH条件下可与一些酸性染料生成有色 络合物，可被氯仿等有机溶剂定量提出。
(2)固定相方面的改进：选择碳链较短的键合相硅 胶填料，例如用C8比C18好。 含量测定操作基本流程： 样品供试液制备：样品根据生物碱通性提取、净 化、定容制备供试液。 标准液配制：先配成标准储备液，再配制成系列 标准液。 测试条件选择： 色谱柱（多用C18）、流动相(多 用甲醇-水或乙腈-水)、流速（多用1ml/min）、 检测器(多用紫外检测器)、测试波长（多为被测 物最大吸收波长）。 选择定量方式，之后进样、检测、计算含量。 3、气相色谱法：气相色谱法适用于有挥发性的， 遇热不分解的单体生物碱的含量测定。