qPCR操作流程

qPCR操作流程
1.将文库进行2100，计算得到文库片段大小
2.计算文库摩尔浓度
摩尔浓度（nmol/L）=文库片段大小*106/660/片段大小
3.样本的稀释：依次以5nmol—0.2nmol—4pmol浓度逐级稀释
5nmol稀释（用水稀释）：原样样本体积=5ul
补水体积=摩尔浓度-5，混匀。

0.2nmol稀释（用dilution buffer稀释）：即25倍稀释，取4ul稀释至5nmol的样本，加
96ul dilution buffer，vortex 混匀。

若5nmol的样本体积较小，可将0.2nmol的体积减半即加入2ul 5nmol样本，加入48ul dilution Buffer，vortex 混匀。

4pmol稀释（用dilution buffer稀释）：即50倍稀释，取2ul稀释至0.2nmol的样本，加
入98ul dilution buffer，vortex 混匀。

4.标准品和标准曲线的稀释
标准品：选取之前上机过，且数据量正常的文库作为标准品，稀释至4pmol备用。

标准曲线：标准曲线一共有5个，依次浓度为20pmol—2pmol—0.2pmol—0.02pmol—
0.002pmol。

按照浓度将标准品依次稀释。

5.qPCR
根据样本数量配置qPCR反应mix
qPCR反应体系：
混合液的准备（15ul/rxn）
5uM qPCR primer0.9ul SYBR(2X)7.5ul
DdH2O 5.6ul 4pmol待检测样本1ul
标准品和标准曲线点2个重复，样本进行3个重复。

将15ul混合液依次点入48孔板内，用密封薄膜进行密封，使用刮板进行强化。

将48孔板离心，1000g，5min
离心后，放入eco机器中，在templates中选择SBS library quantification。

qPCR反应条件如下：
对48孔板进行设置，标记样本名字。

选中标准曲线对应的相应空位，设置为standard，依次设置标准曲线的浓度，分别为20pmol—2pmol—0.2pmol—0.02pmol—0.002pmol。

标准品和待检测样本都设置为unknown，标记相应的样本名称。

设置完成后，点击run 按钮，并保存。

6.样本上机量的计算
程序运行结束后，点击analyze data选项，将偏差较大的值去掉，得到待测样本的Mean q和标准品的Mean q值进行计算，计算公式如下：
样本上机量=标准品上机量*待测样本所需数据量*标准品的Mean q/标准品的实际数据量/待测样本的Mean q（其中标准品上机量和标准品的实际数据量均为已知）
确定同lane间的各个样本index没有重复后，按照上机量依次用5nmol稀释样本加样，若5umol稀释样本体积不够，可将所有样本体积均减半进行加样，混匀。

7.将混好的lane进行Qubit定量和2100质检，填写好样本信息单和index列表后，即可外
包。

Dilution buffer：500ul 1Mol Tris HCl，25ul 吐温20，补水至50ml，过滤使用。