牛多杀性巴氏杆菌和牛支原体双重PCR检测方法的建立及应用
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（ Ａ Ｆ １ ３ ０ １ １ ９），设计 两对 引物 ，在 建立 两种 细菌单 项Ｐ Ｃ Ｒ检测方 法的基础 上 ，优化 双重Ｐ Ｃ Ｒ反应条件 ，建立
了两种细 菌的双重Ｐ Ｃ Ｒ检测 方法 ，用这 两对 引物对 同一样 品 中的牛 多杀性 巴氏杆 菌 、牛 支原体核 酸为模板进 行 双重Ｐ Ｃ Ｒ扩 增 ，结 果可 同时扩增牛 多杀性 巴氏杆 菌和牛支原体 ￣２ ６ ５ ｂ ｐ 和４ ３ ９ ｂ ｐ ￣特 异性片段 ，而对其他４ 种 牛病 原菌的扩增 结果均 为阴性 。敏感性测定结果表 明，对牛 多杀性 巴氏杆 菌和牛 支原体的最低核 酸检 出限均为 ｌ ｐ ｇ 。通过 对３ ０ 份 临床病料检 测 ，将 建立的双重Ｐ Ｃ Ｒ技术和单 项Ｐ Ｃ Ｒ方法进行 对比验证 ，结果显示 ，两者 的总
主要 从事 动物 传染 病诊 断技 术研 究工 作。
取试剂盒均购 自北京百泰克生物技术有限公司。
田 Ｂ 中 Ｉ 圈 ｏ 娇 Ｔ 斗 Ｅ ２ Ｃ ０ １ Ｈ ５ Ｎ ・ １ ｏ ４ Ｉ ｏ Ｇ Ｙ
１ ． ３ Ｐ Ｃ Ｒ引物 设计 与合 成
分 别提 取 牛 多杀性 巴氏杆 菌 、牛 支原 体 的 Ｄ Ｎ Ａ 进 行 用Ｐ ｒ ｉ ｍｅ ｒ Ｐ ｒ ｅ ｍｉ ｅ ｒ ５ ． ０ 软 件 ， 参 照 Ｇｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ 定 量 ，然 后 分 别作 １ ０ 倍 梯 度 稀释 ，每个 稀 释 度取 １ ｕ Ｌ 为 中登 录 的牛 多 杀性 巴 氏杆菌 ｋ ｍ ｔ １基 因 序 列 模板 ，采 用 已优 化 的双 重 Ｐ Ｃ Ｒ 反 应 条件 分 别对 上 述不 同
序列 （ ＡＦ １ ３ ０ １ １ ９），设 计 两 对 特 异性 引物 ，建立 了可
ＣＲ 方 法 ，为 这 两 种 细 牛 支原 体 （ Ｍ ｙ ｃ ｏ ｐ ／ ａ ｓ ｍ． ｂ ｏ ｖ ｉ ｓ ，Ｍ． ｂ ｏ ｖ ｉ ｓ ） 可 引起 牛 的 肺 同 时 检 测 这 两 种 细 菌 病 的双 重 Ｐ 炎 、关 节炎 、角膜 结 膜炎 、耳炎 、生殖 道 炎 ，甚 至 流产 菌病 的临床快速检测 和流行病学调查提供 了有效的技
中图分类号 ：Ｓ ８ ５ ８ ． ２ ３ 文献标识码 ：Ａ 文章编号 ：１ ０ ０ ４ — ４ ２ ６ ４（ ２ ０ １ ５）１ ４ — ０ ０ １ ９ － ０ ４
摘 要 ：参 照 Ｇｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ 中牛 多杀 性 巴 氏杆 菌 ｋ ｍｔ １ 基 因序 列 （ ＡＦ Ｏ １ ６ ２ ５ ９）和 牛 支原 体 ｏ ｐ ｐ Ｄ／ Ｆ 基 因序 列
失 ，影响和 制约着各 国养牛业的发展 【 ６ 胡 Ｊ 。该两种疾病
牛 多 杀 性 巴 氏杆 菌 、牛 支 原 体 、 牛 大 肠 杆 菌 、 牛 传统 的诊 断方 法 主要 有 细菌 学 检测 、生化 试验 、动 物 回 金 黄 色 葡萄 球 菌 、牛 沙 门 氏菌 、牛 丝状 支 原体 丝 状 亚种
符合 率为１ ０ ０ ％。结果表 明，建立 的双重Ｐ Ｃ Ｒ检 测方法具有特异 、快速 、准确的特 点 ，可用于对牛 多杀性 巴氏杆
菌和 牛支原体的 同时检 测和鉴 别诊断。 关键 词 ：牛 多杀性 巴氏杆 菌 ；牛支原体 ；双重 Ｐ ＣＲ；检测
牛 巴 氏杆 菌 病 是 由 牛 多杀 性 巴 氏杆 菌（ Ｐ ａ ｓ ｔ ｅ ｕ ｒ ｅ ｌ ｌ ａ
中 圈 奶 冲２ ０ １ ５ ・ １ ４
Ｂ１ ０Ｔ ＥＣＨ Ｎ ＯＩ ０ ＧＹ
圈
牛多杀性 巴氏杆菌和 牛支原体 双重 Ｐ Ｃ Ｒ 检测
方 法 的建 立及 应 用
于新友’ ，李天芝’ ，王金 良 ，沈 志强
（ １ ． 山东绿都生物科技有限公 司 ，滨州 ２ ５ ６ ６ ０ ０ ；２ ． 山东省 滨州畜牧兽医研 究院，滨州 ２ ５ ６ ６ ０ ０ ）
与不 孕等 多种疾病 ， 。１ ９ ６ １ 年 ，美国首次在乳房炎患 术 支 持 。 牛 的乳 汁 中分 离 出牛 支 原体 】 。２ ０ ０ ８ 年 ，我 国从 患 有坏
死性肺炎的 肉牛中分离 出支原体＿ ５ 】 。这两种疾病常混合
１ 材料 与方 法
． １ 菌株 与病 料 感 染 引起 牛 呼 吸 道 疾 病 ，给 养 牛业 造 成 严 重 的经 济 损 １
笔者参照Ｇｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ 上 已发表 的牛 多杀性 巴氏杆菌
ｍｔ ｌ 基 因序列 （ ＡＦ ０１ ６ ２ ５ ９）、牛 支原 体 ｏ ｐ ｐ Ｄ ／ Ｆ 基 因 ｍｕ ｌ ｔ ｏ ｃ ｉ ｄ ａ ，Ｐ ｍ） 引起 的一种 急 性 、热性 传 染病 ，多 以高 ｋ
烧 、肺 炎 、急性 胃肠炎 以及 内脏器Biblioteka 官广泛 出血 为特征 Ｌ １ ＿ 。
Ｃ 型 由本实验室保存。３ Ｏ 份牛病料于２ ０ １ ３ 年１ 月～ ２ ０ １ ５ 归试验等 ，但时间长 、操作繁琐、准确性低 ，很难适应 Ｓ
月 采 自全 国各 地 不 同牛场 。 临床快速诊断的需要。因此 ，建立一种快速 、准确检测 年 １
这两 种疾 病 的Ｐ ＣＲ方法 十分 必 要 。
（ Ｓ Ｄ Ａ Ｉ Ｔ 一 １ ２ 一 Ｏ １ １ —１ ２ ） 。 作 者 简介 ： 于 新友 （ １ ９ ８ ３ 一 ） ，男 ，汉族 ，山东 菏泽 人 ， 助 理研 究 员 ， 硕士，
自宝生物工程 （ 大连 ） 有限公司 ；多功能Ｄ Ｎ Ａ 纯化回收
试 剂盒 、高 纯质 粒 小量 制备 试 剂盒 、细菌 基 因组 Ｄ Ｎ Ａ 提
收稿 日期 ： ２ ０ １ ５ － ０ ３ — ０ ２
１ ． ２ 工 具酶及 试 剂盒
ｐ ＭＤ １ ８ － Ｔ 载 体 、Ｐ ｒ ｅ ｍｉ ｘ Ｔ ａ ｑ 、Ｄ Ｌ ２ ０ ０ ０ Ｍａ ｒ ｋ ｅ ｒ 购
基 金 项 目 ：山 东 省 现 代 产 业 技 术 体 系 牛 创 新 团 队 项 目
了两种细 菌的双重Ｐ Ｃ Ｒ检测 方法 ，用这 两对 引物对 同一样 品 中的牛 多杀性 巴氏杆 菌 、牛 支原体核 酸为模板进 行 双重Ｐ Ｃ Ｒ扩 增 ，结 果可 同时扩增牛 多杀性 巴氏杆 菌和牛支原体 ￣２ ６ ５ ｂ ｐ 和４ ３ ９ ｂ ｐ ￣特 异性片段 ，而对其他４ 种 牛病 原菌的扩增 结果均 为阴性 。敏感性测定结果表 明，对牛 多杀性 巴氏杆 菌和牛 支原体的最低核 酸检 出限均为 ｌ ｐ ｇ 。通过 对３ ０ 份 临床病料检 测 ，将 建立的双重Ｐ Ｃ Ｒ技术和单 项Ｐ Ｃ Ｒ方法进行 对比验证 ，结果显示 ，两者 的总
主要 从事 动物 传染 病诊 断技 术研 究工 作。
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田 Ｂ 中 Ｉ 圈 ｏ 娇 Ｔ 斗 Ｅ ２ Ｃ ０ １ Ｈ ５ Ｎ ・ １ ｏ ４ Ｉ ｏ Ｇ Ｙ
１ ． ３ Ｐ Ｃ Ｒ引物 设计 与合 成
分 别提 取 牛 多杀性 巴氏杆 菌 、牛 支原 体 的 Ｄ Ｎ Ａ 进 行 用Ｐ ｒ ｉ ｍｅ ｒ Ｐ ｒ ｅ ｍｉ ｅ ｒ ５ ． ０ 软 件 ， 参 照 Ｇｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ 定 量 ，然 后 分 别作 １ ０ 倍 梯 度 稀释 ，每个 稀 释 度取 １ ｕ Ｌ 为 中登 录 的牛 多 杀性 巴 氏杆菌 ｋ ｍ ｔ １基 因 序 列 模板 ，采 用 已优 化 的双 重 Ｐ Ｃ Ｒ 反 应 条件 分 别对 上 述不 同
序列 （ ＡＦ １ ３ ０ １ １ ９），设 计 两 对 特 异性 引物 ，建立 了可
ＣＲ 方 法 ，为 这 两 种 细 牛 支原 体 （ Ｍ ｙ ｃ ｏ ｐ ／ ａ ｓ ｍ． ｂ ｏ ｖ ｉ ｓ ，Ｍ． ｂ ｏ ｖ ｉ ｓ ） 可 引起 牛 的 肺 同 时 检 测 这 两 种 细 菌 病 的双 重 Ｐ 炎 、关 节炎 、角膜 结 膜炎 、耳炎 、生殖 道 炎 ，甚 至 流产 菌病 的临床快速检测 和流行病学调查提供 了有效的技
中图分类号 ：Ｓ ８ ５ ８ ． ２ ３ 文献标识码 ：Ａ 文章编号 ：１ ０ ０ ４ — ４ ２ ６ ４（ ２ ０ １ ５）１ ４ — ０ ０ １ ９ － ０ ４
摘 要 ：参 照 Ｇｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ 中牛 多杀 性 巴 氏杆 菌 ｋ ｍｔ １ 基 因序 列 （ ＡＦ Ｏ １ ６ ２ ５ ９）和 牛 支原 体 ｏ ｐ ｐ Ｄ／ Ｆ 基 因序 列
失 ，影响和 制约着各 国养牛业的发展 【 ６ 胡 Ｊ 。该两种疾病
牛 多 杀 性 巴 氏杆 菌 、牛 支 原 体 、 牛 大 肠 杆 菌 、 牛 传统 的诊 断方 法 主要 有 细菌 学 检测 、生化 试验 、动 物 回 金 黄 色 葡萄 球 菌 、牛 沙 门 氏菌 、牛 丝状 支 原体 丝 状 亚种
符合 率为１ ０ ０ ％。结果表 明，建立 的双重Ｐ Ｃ Ｒ检 测方法具有特异 、快速 、准确的特 点 ，可用于对牛 多杀性 巴氏杆
菌和 牛支原体的 同时检 测和鉴 别诊断。 关键 词 ：牛 多杀性 巴氏杆 菌 ；牛支原体 ；双重 Ｐ ＣＲ；检测
牛 巴 氏杆 菌 病 是 由 牛 多杀 性 巴 氏杆 菌（ Ｐ ａ ｓ ｔ ｅ ｕ ｒ ｅ ｌ ｌ ａ
中 圈 奶 冲２ ０ １ ５ ・ １ ４
Ｂ１ ０Ｔ ＥＣＨ Ｎ ＯＩ ０ ＧＹ
圈
牛多杀性 巴氏杆菌和 牛支原体 双重 Ｐ Ｃ Ｒ 检测
方 法 的建 立及 应 用
于新友’ ，李天芝’ ，王金 良 ，沈 志强
（ １ ． 山东绿都生物科技有限公 司 ，滨州 ２ ５ ６ ６ ０ ０ ；２ ． 山东省 滨州畜牧兽医研 究院，滨州 ２ ５ ６ ６ ０ ０ ）
与不 孕等 多种疾病 ， 。１ ９ ６ １ 年 ，美国首次在乳房炎患 术 支 持 。 牛 的乳 汁 中分 离 出牛 支 原体 】 。２ ０ ０ ８ 年 ，我 国从 患 有坏
死性肺炎的 肉牛中分离 出支原体＿ ５ 】 。这两种疾病常混合
１ 材料 与方 法
． １ 菌株 与病 料 感 染 引起 牛 呼 吸 道 疾 病 ，给 养 牛业 造 成 严 重 的经 济 损 １
笔者参照Ｇｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ 上 已发表 的牛 多杀性 巴氏杆菌
ｍｔ ｌ 基 因序列 （ ＡＦ ０１ ６ ２ ５ ９）、牛 支原 体 ｏ ｐ ｐ Ｄ ／ Ｆ 基 因 ｍｕ ｌ ｔ ｏ ｃ ｉ ｄ ａ ，Ｐ ｍ） 引起 的一种 急 性 、热性 传 染病 ，多 以高 ｋ
烧 、肺 炎 、急性 胃肠炎 以及 内脏器Biblioteka 官广泛 出血 为特征 Ｌ １ ＿ 。
Ｃ 型 由本实验室保存。３ Ｏ 份牛病料于２ ０ １ ３ 年１ 月～ ２ ０ １ ５ 归试验等 ，但时间长 、操作繁琐、准确性低 ，很难适应 Ｓ
月 采 自全 国各 地 不 同牛场 。 临床快速诊断的需要。因此 ，建立一种快速 、准确检测 年 １
这两 种疾 病 的Ｐ ＣＲ方法 十分 必 要 。
（ Ｓ Ｄ Ａ Ｉ Ｔ 一 １ ２ 一 Ｏ １ １ —１ ２ ） 。 作 者 简介 ： 于 新友 （ １ ９ ８ ３ 一 ） ，男 ，汉族 ，山东 菏泽 人 ， 助 理研 究 员 ， 硕士，
自宝生物工程 （ 大连 ） 有限公司 ；多功能Ｄ Ｎ Ａ 纯化回收
试 剂盒 、高 纯质 粒 小量 制备 试 剂盒 、细菌 基 因组 Ｄ Ｎ Ａ 提
收稿 日期 ： ２ ０ １ ５ － ０ ３ — ０ ２
１ ． ２ 工 具酶及 试 剂盒
ｐ ＭＤ １ ８ － Ｔ 载 体 、Ｐ ｒ ｅ ｍｉ ｘ Ｔ ａ ｑ 、Ｄ Ｌ ２ ０ ０ ０ Ｍａ ｒ ｋ ｅ ｒ 购
基 金 项 目 ：山 东 省 现 代 产 业 技 术 体 系 牛 创 新 团 队 项 目