牛多杀性巴氏杆菌和牛支原体双重PCR检测方法的建立及应用

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( A F 1 3 0 1 1 9),设计 两对 引物 ,在 建立 两种 细菌单 项P C R检测方 法的基础 上 ,优化 双重P C R反应条件 ,建立
了两种细 菌的双重P C R检测 方法 ,用这 两对 引物对 同一样 品 中的牛 多杀性 巴氏杆 菌 、牛 支原体核 酸为模板进 行 双重P C R扩 增 ,结 果可 同时扩增牛 多杀性 巴氏杆 菌和牛支原体  ̄2 6 5 b p 和4 3 9 b p  ̄特 异性片段 ,而对其他4 种 牛病 原菌的扩增 结果均 为阴性 。敏感性测定结果表 明,对牛 多杀性 巴氏杆 菌和牛 支原体的最低核 酸检 出限均为 l p g 。通过 对3 0 份 临床病料检 测 ,将 建立的双重P C R技术和单 项P C R方法进行 对比验证 ,结果显示 ,两者 的总
主要 从事 动物 传染 病诊 断技 术研 究工 作。
取试剂盒均购 自北京百泰克生物技术有限公司。
田 B 中 I 圈 o 娇 T 斗 E 2 C 0 1 H 5 N ・ 1 o 4 I o G Y
1 . 3 P C R引物 设计 与合 成
分 别提 取 牛 多杀性 巴氏杆 菌 、牛 支原 体 的 D N A 进 行 用P r i me r P r e mi e r 5 . 0 软 件 , 参 照 Ge n B a n k 定 量 ,然 后 分 别作 1 0 倍 梯 度 稀释 ,每个 稀 释 度取 1 u L 为 中登 录 的牛 多 杀性 巴 氏杆菌 k m t 1基 因 序 列 模板 ,采 用 已优 化 的双 重 P C R 反 应 条件 分 别对 上 述不 同
序列 ( AF 1 3 0 1 1 9),设 计 两 对 特 异性 引物 ,建立 了可
CR 方 法 ,为 这 两 种 细 牛 支原 体 ( M y c o p / a s m. b o v i s ,M. b o v i s ) 可 引起 牛 的 肺 同 时 检 测 这 两 种 细 菌 病 的双 重 P 炎 、关 节炎 、角膜 结 膜炎 、耳炎 、生殖 道 炎 ,甚 至 流产 菌病 的临床快速检测 和流行病学调查提供 了有效的技
中图分类号 :S 8 5 8 . 2 3 文献标识码 :A 文章编号 :1 0 0 4 — 4 2 6 4( 2 0 1 5)1 4 — 0 0 1 9 - 0 4
摘 要 :参 照 Ge n B a n k 中牛 多杀 性 巴 氏杆 菌 k mt 1 基 因序 列 ( AF O 1 6 2 5 9)和 牛 支原 体 o p p D/ F 基 因序 列
失 ,影响和 制约着各 国养牛业的发展 【 6 胡 J 。该两种疾病
牛 多 杀 性 巴 氏杆 菌 、牛 支 原 体 、 牛 大 肠 杆 菌 、 牛 传统 的诊 断方 法 主要 有 细菌 学 检测 、生化 试验 、动 物 回 金 黄 色 葡萄 球 菌 、牛 沙 门 氏菌 、牛 丝状 支 原体 丝 状 亚种
符合 率为1 0 0 %。结果表 明,建立 的双重P C R检 测方法具有特异 、快速 、准确的特 点 ,可用于对牛 多杀性 巴氏杆
菌和 牛支原体的 同时检 测和鉴 别诊断。 关键 词 :牛 多杀性 巴氏杆 菌 ;牛支原体 ;双重 P CR;检测
牛 巴 氏杆 菌 病 是 由 牛 多杀 性 巴 氏杆 菌( P a s t e u r e l l a
中 圈 奶 冲2 0 1 5 ・ 1 4
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牛多杀性 巴氏杆菌和 牛支原体 双重 P C R 检测
方 法 的建 立及 应 用
于新友’ ,李天芝’ ,王金 良 ,沈 志强
( 1 . 山东绿都生物科技有限公 司 ,滨州 2 5 6 6 0 0 ;2 . 山东省 滨州畜牧兽医研 究院,滨州 2 5 6 6 0 0 )
与不 孕等 多种疾病 , 。1 9 6 1 年 ,美国首次在乳房炎患 术 支 持 。 牛 的乳 汁 中分 离 出牛 支 原体 】 。2 0 0 8 年 ,我 国从 患 有坏
死性肺炎的 肉牛中分离 出支原体_ 5 】 。这两种疾病常混合
1 材料 与方 法
. 1 菌株 与病 料 感 染 引起 牛 呼 吸 道 疾 病 ,给 养 牛业 造 成 严 重 的经 济 损 1
笔者参照Ge n B a n k 上 已发表 的牛 多杀性 巴氏杆菌
mt l 基 因序列 ( AF 01 6 2 5 9)、牛 支原 体 o p p D / F 基 因 mu l t o c i d a ,P m) 引起 的一种 急 性 、热性 传 染病 ,多 以高 k
烧 、肺 炎 、急性 胃肠炎 以及 内脏器Biblioteka 官广泛 出血 为特征 L 1 _ 。
C 型 由本实验室保存。3 O 份牛病料于2 0 1 3 年1 月~ 2 0 1 5 归试验等 ,但时间长 、操作繁琐、准确性低 ,很难适应 S
月 采 自全 国各 地 不 同牛场 。 临床快速诊断的需要。因此 ,建立一种快速 、准确检测 年 1
这两 种疾 病 的P CR方法 十分 必 要 。
( S D A I T 一 1 2 一 O 1 1 —1 2 ) 。 作 者 简介 : 于 新友 ( 1 9 8 3 一 ) ,男 ,汉族 ,山东 菏泽 人 , 助 理研 究 员 , 硕士,
自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ;多功能D N A 纯化回收
试 剂盒 、高 纯质 粒 小量 制备 试 剂盒 、细菌 基 因组 D N A 提
收稿 日期 : 2 0 1 5 - 0 3 — 0 2
1 . 2 工 具酶及 试 剂盒
p MD 1 8 - T 载 体 、P r e mi x T a q 、D L 2 0 0 0 Ma r k e r 购
基 金 项 目 :山 东 省 现 代 产 业 技 术 体 系 牛 创 新 团 队 项 目
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