细胞生物学第三章细胞生物学研究方法知识讲解
细胞生物学研究方法
yy
6
公司名称
举例：过氧化物酶 peroxidase ,(POX) 1.原理
血细胞中的POX能分解H2O2而释放出新生态氧，后者 可使联苯胺氧化成联苯胺蓝沉淀于细胞质酶活力处。 2.正常阳性细胞: ①. 中性粒细胞呈均匀颗粒状蓝黑色阳性。 ②. 嗜酸性粒细胞呈均匀粗大颗粒状蓝色阳性。 ③. 单核细胞呈弥散细颗粒状蓝色阳性。
› 转染（transfection）：将带有外源性基因的克隆载体或表达载体导入真核细胞的过程。
› 在表达载体启动子的驱动下，外源基因将获得过表达（over-expression），从而实现 上调细胞中的目的基因表达。
yy
29
公司名称
（一）外源性基因在细胞中的过表达是上调基因表达的主要 方式
yy
30
› 应用：用于显示特定蛋白质的细胞内的定位，间接研究蛋 白之间的相互作用。
› 原理：当荧光工体与荧光受体分子彼此接近而供体的发射 光谱与受体的激发光谱重叠时就会通过偶极子相互作用， 实现了能量向邻近的受体分子转移，一种非辐射能量跃迁， 通过荧光显微镜可以观察到这种改变。
› 特点：①受、供体的激发光要足够分得开；②供体的发光 光谱与受体的激发光谱要重叠。
› 缺点：只能说明两个蛋白之间有相互作用的结构基础，并不标示这两 个蛋白在细胞内一定会相遇或这种相互作用在活细胞中确实存在，需 要用免疫共沉淀进行验证。
yy
34
公司名称
yy
35
公司名称
› （三）吞噬体展示可筛选存在相互作用的蛋白质 › 被筛选蛋白cDNA与噬菌体的衣壳蛋白DNA构建成融合基因，使被筛
›
光或改变本身荧光的发射波长与强度，从
而
›
通过荧光检测可以显示该离子的量。
细胞生物学知识点
第一章医学细胞生物学绪论名词解释：生物学，细胞生物学解答题：细胞对生命活动的意义，细胞的共同属性易考点：首次命名植物细胞的人，发现无丝分裂、减数分裂的事件，提出DNA 双螺旋模型第二章细胞生物学研究方法名词解释：分辨率，电子显微镜，酶细胞化学技术，流式细胞技术，细胞培养，细胞系，细胞株，细胞融合，干细胞解答题：细胞培养的基本条件，光学显微镜技术的原理易考点：分辨率的计算公式及各个字母代表的意思，光镜的分辨极限，暗视野显微镜观察的是细胞轮廓以及观察的范围，透射显微镜观察的是细胞内部的细微结构，扫描电子显微镜观察的是三维立体形貌。
第四章细胞膜名词解释：生物膜，细胞膜解答题：流动镶嵌模型，细胞膜的特性，耦联运输易考点：功能复杂的膜中所占蛋白质的比例大，三种膜蛋白的存在形式，影响膜脂流动性的因素，细胞膜的物质转运功能（选择题形式），糖萼的本质第六章内膜系统名词解释：内膜系统，细胞质解答题：信号假说的主要内容，高尔基复合体的功能，滑面内质网的功能，溶酶体的形成过程，溶酶体的功能易考点：内质网的标志酶，高尔基复合体的形态（形成面，成熟面），溶酶体的标志酶第七章线粒体名词解释：三羧酸循环，氧化磷酸化，底物水平磷酸化，呼吸链，分子伴侣，导肽解答题：描述线粒体的结构易考点：光镜下线粒体的结构，线粒体各部位的标志酶，呼吸链的复合体中每个复合体有哪些物质，线粒体疾病的特点，化学渗透学说主要知道氧化放能第八章细胞骨架名词解释：细胞骨架，中间纤维结合蛋白解答题：微管的体外装配，影响微管装配的因素，微管的功能（简单描述），微丝的组装过程，影响微丝组装的因素，微丝的功能，中间纤维结合蛋白的功能，中间纤维的组装的控制以及影响因素，中间纤维的功能第九章细胞核名词解释：核型，核纤层，细胞骨架，核基质，解答题：简述细胞核的基本结构，核孔复合体的结构，常染色质和异染色质的异同点，核仁的光镜和电镜结构。
易考点：核基质的功能，人体哪几号染色体上有核仁组织区。
第3章 细胞生物学的研究方法1(显微镜技术)
显微镜技术
显微镜的成像原理
无论是何种显微镜，镜像的形成都需要3个基本要素：照 明系统；被观察的样品；聚焦和成像的透镜系统。
光源 聚光镜 样品 物镜
光源 透镜
射线扫描器
聚 光 镜
样品
目镜
电视屏观 察图像
直接成像
荧光屏观察 图像
光学显微技术
在细胞生物学的领域中，光学显微镜作为研究细胞显微
结构的重要工具和手段是应用最早也是最广的一种。光学显 微镜是利用可见光作光源，通过一组玻璃透镜包括目镜、物 镜、聚光镜放大被观察物体，提高分辨率的仪器。分辨率指： 人眼在25厘米的明视距离处分辨物体结构最小间距的能力。
载物台的上方：
光源
长焦距聚光器 载物台的下方： 物镜 应用：直接对培养的 细胞进行观察
荧光显微镜
原理:
荧光分子在受到光照射后，可吸收特定波长的短波光线， 并发射出比原来吸收波长更长的光。
紫外光 可见光 红外光
λ short
long
基本构造：
A 光源 B 二向色镜：反射短波光线，透过长波光线 C 一组滤光片：得到纯的激发光和发射光
透射电镜生物标本制备过程 (自学）
(1)取材
(2)固定:防止产生结构改变。 戊二醛：在蛋白质分子之间形成共价键, 将它们交联在一起。 四氧化锇：除与蛋白共价结合外,还对脂类有良好的固定效果。 (3)脱水：标本必须置于高真空中进行电镜观察,所以电镜生物标本 不能含水。梯度乙醇。 (4)包埋:为使柔软生物组织制成超薄切片,并使切片耐受高真空、 电子轰击，应在切片前将标本进行包埋,常用环氧树脂。 (5)切片:电子穿透力很弱,需将样品制成50～100nm厚薄片。约为细 胞的1/200厚度。 (6)染色:生物分子由原子序数低的轻元素组成，它们散射电子能力 弱,在电镜下几乎不存在明暗反差,需加大生物样品反差,进行染 色。重金属浸染。
细胞生物学细胞生物学研究方法
Methodology of Cell Biology
Cells are (relatively) small and complex. How do we study them?
第三章 细胞生物学研究方法
第一节 显微技术 • 一、光学显微镜
• 二、电子显微镜
• 三、显微操作技术 第二节 细胞分离与细胞培养 第三节 细胞及其组分的分析方法 第四节 细胞生物学研究常用的模式生物
antibodies for immunocytochemistry
Immunofluorescence staining for Golgi (blue) actin (green) histones (red)
颜色†
吸收 光谱 (nm)
发射 光谱 (nm)
Alexa Fluor 蓝色 350 — 405 紫色 — 430 绿色 — 488 蓝绿色 — 500 绿色 — 514 绿色 — 532 绿色 — 546 黄色 — 555 黄绿色 — 568 橙色 — 594 橙红色 — 610 红色 — 633 红色 — 647 红色 — 660 红色 — 680 红色 — 700 红色 — 750 红色
4. 绿色荧光蛋白
Fluorescence microscopy exploits special molecules called fluorophores（荧光团）
Fluorescent dyes/fluorophores absorb light (energy) of a specific color (wavelength)
收特定波长的短波光线，并发射 出比原来吸收波长更长的光。
照明方式通常为落射式
(完整版)细胞生物学知识点总结
细胞生物学目录第一章绪论第二章细胞生物的研究方法和技术第三章质膜的跨膜运输第四章细胞与环境的相互作用第五章细胞通讯第六章核糖体和核酶第七章线粒体和过氧化物酶体第八章叶绿体和光合作用第九章内质网，蛋白质分选，膜运输第十章细胞骨架，细胞运动第十一章细胞核和染色体第十二章细胞周期和细胞分裂第十三章胚胎发育和细胞分化第十四章细胞衰老和死亡第一章绪论1.原生质体：被质膜包裹在细胞内的所有的生活物质，包括细胞核和细胞质细胞质：细胞内除核以外的原生质，即细胞中细胞核以外和细胞膜以内的原生质部分原生质体：除去细胞壁的细胞2.结构域：生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域3.装配模型：模板组装，酶效应组装，自组装4.五级装配：第一级,小分子有机物的形成第二级，小分子有机物组装成生物大分子第三级,由生物大分子进一步组装成细胞的高级结构第四级,由生物大分子组装成具有空间结构和生物功能的细胞器第五级，由各种细胞器组装成完整细胞6.支原体：目前已知的最小的细胞第二章细胞生物的研究方法和技术1.显微镜技术：光镜标本制备技术、2.光镜标本制备技术步骤：样品固定、包埋与切片、染色3.电子显微镜种类：透射电子显微镜，扫描电镜，金属投影，冷冻断裂和冷冻石刻电镜，复染技术，扫描隧道显微镜4.细胞化学技术：酶细胞化学技术，免疫细胞化学技术，放射自显影5.细胞分选技术：流式细胞术6.分离技术：离心技术，层析技术，电泳技术第三章质膜的跨膜运输1.细胞功能：外界与通透性障碍，组织和功能定位，运输作用，细胞间通讯，信号检测2.膜化学组成：膜脂，膜糖，膜蛋白3.膜脂的三个种类：磷脂，糖脂，胆固醇4.脂质体用途：用作生物膜的研究模型，作为生物大分子与药物的运载体5.膜糖功能：细胞与环境的相互作用，接触抑制，信号转导，蛋白质分选，保护作用。
6.膜蛋白类型：整合蛋白，外周蛋白，脂锚定蛋白7.膜蛋白功能：运输蛋白，酶，连接蛋白，受体（信号接受和传递）8.不对称性的研究方法：冰冻断裂复型，冰冻蚀刻9.膜流动性研究方法：质膜融合，淋巴细胞的成斑成帽效应，荧光漂白恢复技术10.膜流动性的重要性：酶活性，信号转导，物质运输，能量转换，细胞周期11.影响膜脂流动性的因素：脂肪酸链，胆固醇，卵磷脂/鞘磷脂比值12.影响膜蛋白流动的因素：整合蛋白，膜骨架，细胞外基因，相邻细胞，细胞外配体、抗体、药物大分子13.膜骨架的主要蛋白：血影蛋白，肌动蛋白和原肌球蛋白，带4.1蛋白，锚定蛋白14.转运蛋白质包括：载体蛋白，通道蛋白15.协同运输的方向：同向协同，反向协同第四章细胞与环境的相互作用1.细胞表面结构：细胞外被、膜骨架、胞质溶胶2.细胞外被功能：连接，细胞保护，屏障3.糖萼：由细胞表面的碳水化合物形成的质膜保护层，又称为多糖包被。
细胞生物学笔记
第三章细胞生物学研究方法一. 名词解释：1.细胞株从原代培养物中接种出来的一群不均一的细胞群（染色体数目不变，不能无限长期传代、繁衍）。
2.细胞系细胞系一般都是转化细胞，可以无限传代长期繁衍下去，每种细胞系都具有特殊的遗传标志特征，3.接触抑制当贴壁生成单层细胞且细胞达到一定密度相互接触时，造成细胞表面许多反应受到遮蔽，从而细胞的生长和繁殖受到抑制。
4.电融合技术将悬浮细胞在低压交流电场中聚集成串珠状细胞群或相互接触的单层培养细胞，加高压电泳冲促使融合的技术。
5.密度梯度离心离心操作如果在一种连续密度梯度介质中进行，6.差速离心装有不均一粒子的离心管在离心机中高速旋转时，大小、密度不同的粒子将以各自的沉降速率移向离心管底部7.细胞克隆由单个细胞培养繁殖而成的一群遗传性状完全相同的细胞群体。
二. 简答题:1.透射电镜、扫描电镜、扫描隧道显微镜的原理2.细胞及细胞器分离提纯方法细胞：采用流式细胞术；细胞器：超速离心术，差速离心术，密度梯度离心术，蔗糖密度梯度离心术，氧化铯密度梯度离心。
3.动物细胞培养方法液体悬浮培养，平板培养，回转玻璃管培养。
4.单克隆抗体技术及优点单克隆抗体技术是细胞杂交技术的成功应用，正常的淋巴细胞具有分泌抗体的能力，但不能在体外长期培养，瘤细胞可以在体外长期培养，但不能分泌抗体，将两细胞融合成杂交瘤细胞这样既能合成抗体，又能在体外无限繁殖，优点：永久性产生，特异性强，5.如何利用细胞杂交技术由不纯的抗原制备纯的抗体6.免疫荧光技术及应用7.相差显微镜的原理其基本原理是吧透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构中的对比度，使各种构造变得清晰可见。
第四章细胞质膜与细胞表面● 1. 成斑现象. 2. 成帽现象.● 3. 连接子. 4. 化学突触. 4.“多莉”克隆羊的问世对细胞生物学研究有何意义？1、首次证明了哺乳动物成体细胞的细胞核仍保持有细胞全能性；2、首次证明了哺乳动物特化细胞的发育潜能是有可能在人为条件下发生逆转的，；3、证明了动物克隆并不是100%的复制。
第三章细胞生物学技术
构造上，相差显微镜不同于光镜之处：
1、环形光阑（annular diaphragm） 位于光源与聚光器之间，使透过聚光器 的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。
2、相位板（annular phaseplate）在 物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将 直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。
Figure 3-2. Interference between light waves. When two light waves combine in phase, the amplitude of the resultant wave is larger and the brightness is increased. Two light waves that are out of phase partially cancel each other and produce a wave whose amplitude, and therefore brightness, is decreased.
暗视野显微镜光学显微镜受照射光波长的限制在可见光下其分辨极限只有02m即使在紫外光下最大分辨率也只有01要观察更精细的结构只有借助分辨率更高的电子显微镜
第三章 细胞生物学研究方法
Chapter 3 Techniques in Cell Biology
第一节 显微技术
细胞生物学的建立和发展得益于光学显 微镜的发明； 电子显微镜的发明使对细胞结构和功能 的研究达到了新的水平。
Comparison of conventional and confocal fluorescence microscopy. These two micrographs are of the same intact gastrulastage Drosophila embryo that has been stained with a fluorescent probe for actin filaments. The conventional, unprocessed image (A) is blurred by the presence of fluorescent structures above and below the plane of focus. In the confocal image (B), this out-of-focus information is removed, which results in a crisp optical section of the cell in the embryo.
细胞生物学 第三章
图3-6
膜各个断面的名称
第一节
细胞膜
（1）膜脂的不对称性 膜脂的不对称性是指同一种膜脂分子在膜的脂双层中 呈不均匀分布。组成膜两个单层的膜脂种类不同。糖脂的 分布表现出完全不对称性，其糖侧链部都在质膜的ES面上， 所以糖脂仅存在质膜的细胞外小页中，糖脂的不对称分布 是完成其生理功能的结构基础。膜脂的不对称性有重要的 生理意义，有一些疾病，如镰刀状贫血病、未分化肿瘤细 胞等疾病都是质膜脂双层的不对称性发生紊乱造成的。 （2）膜蛋白的不对称性 膜蛋白的不对称性是指每种膜蛋白分子在细胞膜上都 有明确的方向性和分布的区域性。各种生物膜的特征及功 能主要由膜蛋白决定的，膜蛋白的不对称性是生物膜完成 复杂有序的各种生理功能在时间上与空间上的保证。
第三节 细胞连接
2.胞间连丝 胞间连丝是植物细胞特有的通讯连接。是由穿过细胞壁的质膜围 成的细胞质通道，直径约20～40nm。因此植物体细胞可看作是一个巨 大的合胞体。通道中有一由膜围成的筒状结构，称为连丝小管。连丝 小管由光面内质网特化而成，管的两端与内质网相连。连丝小管与胞 间连丝的质膜内衬之间，填充有一圈细胞质溶质。一些小分子可通过 细胞质溶质环在相邻细胞间传递（图3-13）。
第三节 细胞连接
1.桥粒和半桥粒
在锚定连接中，如果细胞是通过中间纤维锚定到骨架上，这种连接方式 称为桥粒(desmosome)。通常在易受牵拉的组织结构中，桥粒最为丰富，如 皮肤、口腔、食管等处复层鳞状上皮细胞易受撕拉和摩擦，其细胞间桥粒最 丰富。
图3-10 桥粒结构模式图
第三节 细胞连接
2.粘着带和粘着斑
第三节 细胞连接
一、封闭连接
封闭连接（occluding junction）是指在相邻细胞的质膜之间，只 有2nm或更小，甚至没有间隔。
《细胞生物学》考研习题解析(第三章 细胞生物学研究方法和技术)
第三章细胞生物学研究方法和技术一、名词解释荧光漂白恢复技术：即fluorescence photobleaching recovery，FPR或fluorescence recovery after photobleaching，FRAP。
首先利用亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质耦联，然后利用高能量的激光束照射被被标记的特定区域，使该区域标记分子的荧光发生不可逆淬灭而被漂白。
因非照射区域荧光标记分子的移动，使得漂白区域逐渐恢复荧光。
该技术可用于研究蛋白质的运动。
酵母双杂交技术：该技术用于研究蛋白质之间的相互作用。
放射自显影技术：利用放射性同位素（如3H、14C等）的电离辐射对乳胶（含AgBr 活AgCl）的感光作用，研究样本中放射性化合物在机体、组织和器官、细胞中的分布、定位、运动等生物学活动。
二、选择题1. 正常细胞培养的培养基中常需要加入血清，主要是因为血清中含有（）。
A 氨基酸；B 核酸；C 生长因子；D 维生素。
【答案及解析】C。
加入血清主要是为培养基增加生长因子。
2. 冰冻蚀刻技术主要用于（）。
A 电子显微镜；B 光学显微镜；C 原子力显微镜；D 激光共聚焦显微镜。
【答案及解析】A。
冰冻蚀刻技术属于电镜制样技术之一，另外还有超薄切片技术、负染色技术、电镜三维重构与低温电镜技术、扫描电镜技术等。
3. 建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞是通过下列哪种技术构建的？（）A 细胞融合；B 核移植；C 病毒转化；D 基因转移。
【答案及解析】A。
4. 关于光镜的使用下列哪项有误？（）A 观察标本时，应双眼同时睁开，双手并用；B 按照从低倍镜到高倍镜到油镜的顺序进行操作；C 使用油镜时，需要在标本上滴香柏油，将聚光器降至最低，光圈关至最小；D 使用油镜时，不可一边在目镜中观察，一边下降镜筒或上升载物台。
【答案及解析】C。
三、填空题1. 体外培养的细胞，不论原代还是传代细胞一般不保持体内原有的细胞形态。
第三章 细胞生物学研究方法
第三章细胞生物学研究方法一．名词解释1.福尔根反应：特异显示DNA分布的反应。
酸水解可除去RNA，仅保留DNA，冰出去DNA 上嘌呤脱氧核糖核苷键上的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露。
所暴露的自由醛基与西夫试剂反应呈紫红色。
2.负染色：用重金属盐(如磷钨酸钠、醋酸铀等)对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。
染色后，在电镜下观察时，被观察的对象为亮的，背景为暗的，反衬出样品中的生物大分子及其复合物的形态。
3.原位杂交：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特意核苷酸序列在染色体上火细胞中的位置的方法。
4.原代培养：直接从动物体内获取细胞进行首次培养，称原代培养。
5.传代培养：原代培养的细胞在一个容器中增殖到一定的密度后，将细胞分散到多个容器中继续培养的方式称传代培养。
6.细胞株：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，一般可顺利地传40-50代次，它保持染色体二倍体的数量及接触抑制行为。
7．细胞系：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，使其获得“不死性”特征，从而无限增殖，从正常组织或胚胎组织也可以建立细胞系，这是一个含有多个细胞谱系的混杂细胞群体。
8.探针：带有放射性同位素、生物素或其他活性物质标记的某种特定的DNA或RNA片段，用于核酸分子杂交技术以检出标本中待测核酸分子。
9.超薄切片：是一种主要的透射电子显微镜制样技术，利用超薄切片机将样品切成40-50nm 左右，穿透很弱的电子束才能透过。
其主要步骤为：固定、脱水、包埋、切片、染色。
二．填空1、细胞生物学常用的光镜有相差显微镜、微分干涉显微镜、和荧光显微镜。
2、利用超速离心机对细胞组分进行分级分离的常用方法有差速离心和密度梯度离心。
3、单克隆抗体技术是将B淋巴细胞与无限繁殖的肿瘤细胞杂交的技术。
4、对电镜观察的生物样品有_要求样品很薄和保持样品的精细结构5、贴壁生长的细胞具有三个特点：单侧生长、形态多变、接触抑制。
第三章细胞生物学研究方法
第三章细胞生物学研究方法一、是非判断1．提高显微镜的分辨率，可通过缩短波长，或给标本染色。
2．光学显微镜和电子显微镜的差别在于后者的放大倍数远远大于前者，所以能看到更小的细胞结构。
3．亚显微结构就是超微结构。
4．电子显微镜的镜筒中是真空的，其目镜与光学显微镜的目镜也有很大区别。
5．在电子显微镜下观察细胞核时用碱性品红染色，染色质被染成红色。
6．为了使光学显微镜或电子显微镜标本的反差增大，可用化学染料对标本进行染色。
7．生物样品的电子显微镜分辨率通常是超薄切片厚度的十分之一，因而切得越薄，照片中的反差越强，分辨率也越高。
8．透射或扫描电子显微镜不能用于观察活细胞，而相差或倒置显微镜可以用于观察活细胞。
9．CsCl密度梯度离心法分离纯化样品时，样品要和CsCl混匀后分装，离心时，样品中不同组分的重力不同，停留在不同区带中。
10．用免疫荧光技术可显示与酶解过程有关的酶是否结合在微管上。
11．用带有标记的特定核酸分子作探针，测定与之互补的染色体DNA区段的位置，称为原位杂交。
12．Western blotting是体外分析RNA的技术。
13．进行流式细胞术时，所用的细胞需染色，而且还需对组织块中的细胞进行分散处理。
二、选择1．要观察肝组织中的细胞类型及排列，应先制备该组织的( )。
A．滴片B．切片 C．涂片 D．印片2．小鼠骨髓细胞染色体标本一般制备成细胞的( )。
A．滴片B．切片 C．涂片 D．印片3．观察血细胞的种类和形态一般制备成血液( )。
A．滴片D．切片 C．涂片 D．印片4．提高一般光学显微镜的分辨能力，常用的方法有( )。
A．利用高折射率的介质(如甘油) B．调节聚光镜，加红色滤光片C．用荧光抗体示踪D．将标本染色5．下列( )与显微镜能达到的分辨率无关。
A．光波波长B．物镜的放大倍数C．标本和透镜之间的物质的折射率D．透镜的数值孔径6．适于观察培养瓶中活细胞的显微镜是( )。
A．扫描电镜B．荧光显微镜C．相差显微镜D．倒置显微镜7．用于观察活细胞的显微镜是( )。
第三章 细胞生物学研究方法综述
特点：（1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。 （侧分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.01nm）； （2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息； （3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。 （4）可连续成像，进行动态观察
第三章 细胞生物学研究方法
细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
第一节 细胞形态结构的观察方法
光学显微镜技术（light microscopy）
电子显微镜技术 (Electro microscopy) 扫描探针显微镜（Scanning Probe Microscope） 扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope )
第二节 细胞组分的分析方法
离心分离技术 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性 放射自显影技术 定量细胞化学分析技术
第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
细胞的培养 细胞工程
一、光学显微镜技术（light microscopy)
普通复式光学显微镜技术 荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） 激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy） 相差显微镜（phase-contrast microscope） 微分干涉显微镜 （differential interference contrast microscope, DIC） 录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy）
电镜与光镜的比较
细胞生物学的研究方法(1)
编辑课件 光学显微镜和电子显微镜下的细胞3结构
2、分辨率(resolution)
R = 0.61λ/n Sinα n=介质的折射率 ；空气为1. 油为1.5 α=样品对物镜角孔径的半角；sinα的最大值为1 λ=照明光源的波长 0.61是一个恒定的参数；表示成像的点虽被重叠但仍能 被区别的程度
1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明
DIC显微镜又称Nomarski相差显微镜（Nomarki contrast microscope）
利用的偏振光 ;标本可略厚，折射率差别更大
基因注入、核移植、转基因等的显微操作
编辑课件
15
（八）、倒置显微镜
倒置显微镜特点: 物镜与照明系统颠倒 观察培养的活细胞 具有相差物镜
1）自发荧光
细胞中有些物质（如叶绿素等）紫外线照射后可 发荧光
2）诱发荧光
一些物质紫外线照射后不能发荧光，但如果用荧 光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发
荧光
编辑课件
8
荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）
编辑课件
9
2、荧光显微镜和普通显微镜的区别
1）照明方式： 通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上
（四）、暗视野显微镜
暗视野显微镜(dark field microscope) 用特殊的聚光器使照明光线不能进入物镜被放大 在黑暗的背景下呈现明亮的像 反差增大，分辨率提高 观察未经染色的活体或胶体粒子
编辑课件
13
（五）、相差显微镜
相差显微镜（phasecontrast microscope）
荷兰人Zernike1932年发明，获1953年诺贝尔物理奖 作用：可观察未经染色的标本和活细胞
【免费下载】第三章 细胞生物学研究方法
第三章细胞生物学研究方法第一节细胞形态结构的观察方法肉眼分辨率：0.2mm光学显微镜分辨率：0.2μm电子显微镜分辨率：0.2nm一、光学显微镜技术（一）普通复式光学显微镜光学显微镜的组成：①光学放大系统（目镜和物镜）；②照明系统（光源、折光镜、聚光镜）；③机械和支架系统（保证光学系统的准确配置和灵活调控）缺图分辨率是指区分开两个质点间的最小距离。
分辨率的高低取决于光源的波长λ，物镜镜口角α和介质折射率N。
公式缺图在油镜下可提高介质折射率，从而最大分辨率达到0.2μm。
光学显微镜可以直接用于观察单细胞生物体或体外培养细胞。
如果要观察生物组织样品，则需要对材料进行固定，包埋，切片，染色。
苏木精可以特性使DNA着色，伊红可以染蛋白质，从而能显示出细胞核细胞质的位置。
（二）相差和微分干涉显微镜光线通过样品的每一个点到达成像系统时所出现的图像是一个个模糊的圆盘，因此两个相邻的像点所显示的图像可能会发生重叠，重叠到一定程度时，就无法分辨两个点了，造成了光学显微镜的分辨极限。
1、相差显微镜缺图原理：相差显微镜可以将光通过不同密度物质时产生的光程差转换成振幅差，而且相差显微镜在物镜后有一块相差板，相差板上的吸光物质增大了两组光线间的相位差，最后经透镜汇聚时便会产生相互叠加或抵消的干涉现象，从而表现出肉眼可见的明暗区别。
研究对象：由于反差是以样品中的密度差别为基础形成的，故相差显微镜不需染色，可观察或细胞，甚至研究细胞器的动态。
2、微分干涉显微镜原理：以平面偏振光为光源，光线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后再经过另一棱镜汇合，从而样品中厚度上微笑的区别就会转化为明暗区别，增加反差，且具有很强的立体感。
研究对象：适合于研究或细胞中较大的细胞器，还可接上录像装置观察动态。
（三）荧光显微镜原理：主要用于检测细胞上的特异荧光染料，为此增加了两套滤光片，第一套为激发光滤片，装载光源和样品之间，只有那些能激发荧光染料发光的特定波长的光才能通过；第二套为阻断滤片，装在物镜和目镜之间，只让染料所发出的荧光通过。
细胞生物学-3细胞生物学研究方法
02
Charged Plates
Fluorescence Activated Cell Sorting
添加标题
1
添加标题
2
+
添加标题
3
Single cells sorted into test tubes
添加标题
4
FALS Sensor
添加标题
5
Fluorescence detector
应用：胶体金粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽聚合物等结合，因而在基础研究和临床试验中成为非常有用的工具。
免疫胶体金标定(Immunogold labeling)
利用了胶体金颗粒具有高电子密度的特性，在蛋白质与金粒子结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒。因此，可以观察蛋白质的分布区域。
基本原理： 氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶状溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。 胶体金标记：实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的过程。
吸附机理：因胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸值被各种不同颜色的胶体金颗粒。
细胞培养
在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。培养中的细胞不受体内复杂环境的影响，人为改变培养条件(如物理、化学、生物等外界因素的变化)即可进一步观察细胞在单因素或多因素的影响下的生理功能变化。
人的细胞培养
细胞系: 原代培养物经首次传代成功后即为细胞系，有无限的传代能力。 细胞株: 通过原代培养或经过细胞克隆与选择而建立的、具有特异的性质或标记的细胞系，但是它们具有有限的传代能力。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
利用放射性标记技术研究生物大分子 在细胞内的合成动态
步骤
– 适宜的放射性前体分子标记机体或细胞 – 常规制片 – 暗室敷乳胶(核子乳胶3-10m) – 暗盒暴光或自显影 – 显影、定影、观察
与显微自显影区别
敷胶要单层晶体 暴光时间长
定量细胞化学分析技术
细胞显微分光光度术(Microspectrophotometry) 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收， 测定这些物质(如核酸与蛋白质等)在细胞 内的含量 包括： 紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法 BACK
0.2 m
电子显微镜技术(Electro microscopy)
0.2nm
扫描探针显微镜(Scanning Probe Microscope)
3nm, 0.7nm
扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope)
（侧0.1-0.2，纵0.001nm）
BACK
光学显微镜技术
自发荧光(叶绿素)、诱发荧光(酸性品红、甲基 绿、吖啶橙)
优点：
– 多种成分定位 – 只有激发荧光可成像，敏感度高 – 染色简便 – 标本呈彩色图像 – 固定细胞和活细胞
数字成像显微技术
图像后期处理，提高信/噪比、放大信号 摄像机和计算机 原理：摄取同一区域多幅图像，信号经
计算机放大、假信号减弱或消除
BACK
扫描遂道显微镜原理
量子力学中的隧道效应，即在低电压下，二电 极之间具很大阻抗，阻止电流通过(势叠)
当二电极间近到一定距离时，电极间产生了电 流(隧道电流)，且Iexp(-2Kd)，d为针尖与样品 间距离，K为常数，d转化为I的函数而被测定
扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产 生彼此间相互作用力，并在计算机显示出来，从 而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等
第二节 细胞组分的分析方法
离心分离技术 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性 放射自显影技术 定量细胞化学分析技术
用超速离心技术分离细胞器与 生物大分子及其复合物
差速离心(differential centrifugation) 沉降系数S与大小和形状有关 密度梯度离心
BACK
细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂 质等的显示方法
DNA：Feulgen反应，酸除去RNA和DNA上的 嘌呤脱氧核苷酸，使其醛基暴露，自由醛基再 通过Schiff试剂反应呈紫红色
多糖：PAS反应，同上原理使希夫试剂与醛基 反应，但多糖先被过碘酸氧化
脂肪：四氧化锇，苏丹III，苏丹黑 蛋白质：Millon反应，氮汞试剂与蛋白质侧链
电镜三维重构技术与X射线晶体及核磁共振技 术，当前结构生物学主要实验手段
扫描电镜Scanning electron microscope
电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次 电子，探测器收集、转换、放大二次电子成 象
CO 2临界点干燥法，解决引起样品变形的表 面张力问题
景深长，具强烈立体感
不能观察活样品和细胞全貌
分辨率：1.5 nm 磷钨酸或醋酸双氧铀 机理：未知
Examples of negtively stained and metalshadowed specimens.
Electron micrographs of a tobacco rattle virus after negtive staining with potassium phosphotungstate(a) or shadow casting with chromium(b).
扫描遂道显微镜
特点 (1)对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，具高分辨(侧分 辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率达0.01nm) (2) 得到三维图象，可测量厚度信息 (3)可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性 (4)可连续成像，进行动态观察
用途 DNA、RNA、蛋白质、病毒等生物大分子结构；纳米生物 学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的 结构
荧光显微镜技术(Fluorescence Microscopy)
原理与应用
直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术 在光镜水平用于特异蛋白质
等生物大分子的定性定位
如绿色荧光蛋白(GFP)的应用
荧光显微镜技术(Fluorescence Microscopy)
原理：以紫外线为光源，照射被检测物体发出 荧光后，在显微镜下观察其形状及位置仪器
冷冻断裂(fracturing)和冷冻蚀刻(etching)电镜 技术
原理：快速低温冷冻使样品从结构相对“脆弱” 部位 (磷脂双分子层疏水端)断裂，显示镶嵌在 脂膜中的蛋白质颗粒，冰在真空升华，可增强 “浮雕”式蚀刻效果
膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面，富立体感， 不需包埋，固定，很好保持真实性
冷冻深度蚀刻技术(quick freeze deep etching)： 细胞骨架纤维及结合蛋白
固定：OsO4、戊二醛、KMnO4、高频微波(低 温、快速、样块不宜太大)
包埋：完整、耐干燥、电子轰击和真空挥发， 环氧树脂(包埋剂要求)
切片 染色：锇酸染脂肪，铅盐染蛋白质，醋酸铀
染核酸
负染色技术negative staining
生物大分子(病毒、线粒体基粒、 核糖体、蛋白纤维)精细结构
暗场显微技术
明视野局限性
– 具颜色，吸收或折射随机光
暗场
– 通过样品进入成像系统的仅折射光或衍射光 – 微生物计数 – 放射自显影的银颗粒观察 – 分辨率低
激光共焦扫描显微镜技术 (Laser Scanning Confocal Microscopy)
原理：排除焦平面以外光的干扰，增强
图像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重构 样品的三维结构
第三章 细胞生物学研究方法
概论
细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
概论
对实验技术的依赖性 显微镜细胞学，奠基性作用 电镜与生物化学及分子生物学结合
细胞生物学，决定性作用
BACK
第一节 细胞形态结构的观察方法
光学显微镜技术(light microscopy）
（400-700）
成明暗反差和颜色变化
100nm 紫外光 玻璃透镜 不要求真空 （约200nm)
TEM
0.1nm
电子束 电磁透镜 （0.01-0.9）
要求真空
1.33x10-5～ 1.33x10-3Pa
利用样品对电子的散射 和透射形成明暗反差
超薄切片技术Ultrathin section
制样要求：样品很薄；完好保持其精细结构， 40-50 nm，即d为20 m细胞可切几百片，需 刚性、韧性
分子水平的原位杂交技术
(PCR技术)
BACK
利用放射性标记技术研究生物大分子 在细胞内的合成动态
放射自显影技术：利用放射性同位素电离 辐射对乳胶的感光作用，对细胞内生物大 分子进行定性定位与半定量研究的技术
追踪 DNA：3H-TdR RNA： 3H-U 蛋白质：35S 标记Met和 Cys，3H 或14C标
扫描隧道显微镜 Scanning tunneling microscope
1981年，IBM苏黎世实验室的Binnig，Rohrer， Gerber和Weible发明的，探测微观世界物质表面 形貌的仪器
统称扫描探针显微镜(Scanning Probe Microscope, SPM):包括STM、AFM (atomic force microscope)、 磁力显微镜、摩擦力显微镜等
定量细胞化学分析技术
流式细胞仪(Flow Cytometry)
分散群体细胞对待测成分染色悬液通过细胞仪
主要应用： 定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量 测定细胞群体中不同时相细胞的数量 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞 分离DNA含量不同的中期染色体
第三节 细胞培养、细胞工程与显 微操作技术
重标记、超薄切片、装配成分
应用：分泌蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的 定位与骨架蛋白的定位等
细胞内特异核酸的定位与定性
光镜水平的原位杂交技术
in situ hybridization
（同位素标记或荧光素标记的探针）
电镜水平的原位杂交技术
（生物素标记的探针与抗生物抗体相连的胶体金标记结合）
细胞培养
– 动物细胞培养 – 植物细胞培养 – 非细胞体系在细胞生物学研究中的作用
电镜三维重构技术
电子显微镜技术、电子衍射与计算机图像处理 相结合，适于难形成三维晶体膜蛋白、病毒和 蛋白质-核酸复合物三维结构
A.Klug 技术，一系列电镜照片经傅里叶变换得 到大分子电子密度图
低温电镜技术(cryoelectron microscopy)：直接 冰膜包埋，在-160°C制样台利用相位衬度成 像
活细胞，细胞核或线粒体动态
微分干涉(differential-interference)显微镜技术
原理
平面偏振光经棱镜折射分成两束，不同时 间经过样品的相邻部位，再经另一棱镜汇合， 使样品厚度的微小差别转换成明暗区别
优点 增加样品反差和立体感 可观察活细胞中较大细胞器 与录象机连接，活细胞中颗粒及细胞器运动 用计算机辅助，更精细结构
酪氨酸残基反应，成红色沉淀；重氮反应中， 氢氧化重氮与Tyr，Ser和His反应成有色复合物
BACK
特异蛋白抗原的定位与定性
免疫荧光技术 免疫酶标记技术 蛋白电泳(SDS-PAGE)与免疫印
迹反应(Western-Blot) 免疫电镜技术
特异蛋白质抗原的定位与定性
20th70年代，免疫学兴起，为特异蛋白的定性 定位提供了极重要手段
激光共焦点扫描显微镜