副猪嗜血杆菌和猪传染性胸膜肺炎放线杆菌双重PCR检测方法的建立及应用
副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立及应用
均在 98.2%～99%。表明建立的方法灵敏度高、特异性强，可以应用于副猪嗜血杆菌的实验室诊断。
关键词：副猪嗜血杆菌；聚合酶链反应；建立
中图分类号：S858.28
文献标识码：B
文章编号：1672-9692(2018)09-0010-04
Establishment and Preliminary Application of PCR for Detecting Haemophilus parasuis
收稿日期：2018-06-09 作者简介：梁乔（1991-），女 ，汉族 ，本科 ，硕士学位 ，研究方向 ：动物疫病检测。
2018 年 第 9 期
modern journal of animal husbandry and veterinary medicine
11
因 infB 序列设计引物，建立了该病原菌的 PCR 检测 方法，为该病的防控和研究提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品 副猪嗜血杆菌由沈阳农业大学惠赠 ， 金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、致病性大肠杆菌、奇 异变性杆菌、猪链球菌由辽宁省动物疫病预防控制 中心保存。 1.1.2 主要试剂 DNAzol 购自 invitrogen 公司；EX Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、dNTP（2.5 mmol/L)、溴 化乙锭、DL 2000 DNA Marker、三羟甲基氨基甲烷乙酸电泳缓冲液购自宝生物工程（大连）有限公司 ； 犊牛血清购自澳洲 Gibico；TSA 购自北京奥博星公 司；辅酶 I（NAD 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）购自北京索 莱宝科技有限公司。 1.1.3 引物 根 据 副 猪 嗜 血 杆 菌 infB 基 因 序 列 设 计，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合 成，根据 GenBenk 公布的国内外副猪嗜血杆菌 infB 基因的参考序列合成 1 对引物分别为：DQ781933、 EF396317、HM243068、KT740926，引物序列见表 1。
副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立与初步应用
副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立与初步应用摘要:针对副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)16 S rRNA序列设计1对特异性引物,能扩增出821 bp的特异性DNA片段,并据此建立了快速准确鉴定副猪嗜血杆菌PCR方法,临床试验证明该方法具有很好的特异性和敏感性｡13份疑似病料检测结果表明,PCR检测结果与传统生化鉴定结果符合率为100%｡结果表明已成功建立了副猪嗜血杆菌PCR检测方法,并可应用于临床副猪嗜血杆菌的检测｡关键词:副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS);PCR;检测Establishment and Preliminary Application of PCR Assay to Detect Haemophilus parasuisAbstract: In this study, a pairs of primers directed to Haemophilus parasuis(HPS) 16 S rRNA gene were designed and amplified a 821 bp specific DNA fragment by polymerase chain reaction(PCR). It was conformed to be specificity and sensitivity to detect Haemophilus parasuis in pigs after clinical application. It showed that the results of PCR method were 100% accordance with the results of classic biochemical identification for 13 suspected samples. It indicated that the PCR method was successfully established and applicable for the identification of clinical isolates for Haemophilus parasuis.Key words: Haemophilus parasuis; PCR; detection副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)病又称格拉泽氏病(Glasser′s disease)｡HPS是存在于猪的上呼吸道的一种常在菌,在特定条件下可以侵入机体,引起以呼吸道症状为主的全身性疾病,以纤维素性浆膜炎､关节炎和脑膜炎为特征[1-3]｡该菌多与其他病原如猪繁殖与呼吸综合征病毒､猪圆环病毒等混合感染,严重危害仔猪和青年猪的健康[4]｡近几年来副猪嗜血杆菌病在猪场不断发生,已趋于流行,发病率和死亡率均呈显著上升趋势[1]｡由于副猪嗜血杆菌对营养要求比较苛刻,一般从病料中分离率较低[5],使病原学诊断方法受到一定的限制｡常规的血清学诊断方法存在操作繁杂､费时费力､敏感性和特异性低等不足[6],和常规的诊断方法相比PCR具有检测快速､特异性强､敏感性高的优点｡因此,建立HPS PCR快速准确的诊断方法对HPS的防治具有重要意义,并可为其流行病学调查提供技术手段｡1 材料与方法1.1 菌株副猪嗜血杆菌血清4型菌株由福建省预防兽医学与生物技术高校重点实验室分离并保存｡链球菌､巴氏杆菌和产肠毒素大肠杆菌(ETEC)由本实验室保存｡1.2 主要试剂胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基和胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)购自北京陆桥技术有限责任公司;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)购自成都贝斯特试剂有限公司;rTaq DNA聚合酶和DL 2000 Marker为宝生物工程(大连)有限公司产品｡1.3 引物设计与合成按文献[7]的方法设计引物｡上游引物为:5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′,下游引物为:5′-GGCTTCGTCACCCTCTGTA-3′,目的片段为821 bp,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成｡1.4 HPS的分离培养与生化鉴定按文献[5]的方法进行｡1.5 PCR模板处理副猪嗜血杆菌血清4型菌株在TSA培养基上培养,用接种环挑取可疑单一菌落溶于40 μL无菌蒸馏水中,煮沸10 min,12 000 r/min离心1 min,上清液4℃保存备用｡将疑似副猪嗜血杆菌病猪的肺脏､心包液､关节液等接种于TSB液体培养基中,37℃培养18 h后,取40 μL菌液煮沸10 min,12 000 r/min离心1 min,上清液4 ℃保存备用｡1.6 PCR扩增采用20 μL反应体系: 10 ×PCR Buffer 2 μL,dNTP 1.6 μL (2.5 mmol/L),上下游引物各0.8 μL,模板2 μL,rTaq DNA聚合酶0.2 μL(5 U/μL),加ddH2O至20 μL｡循环参数:94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,56 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,35个循环;72 ℃延伸10 min｡反应完毕后用1%琼脂糖凝胶电泳后检查结果｡1.7 PCR反应条件的优化对PCR反应的退火温度(53.5､54.1､55.1､56.6､58.6､60.3､61.3和62.0 ℃)､引物浓度(0.05､0.10､0.20､0.40､0.80和1.20 mmol/L)及dNTP浓度(0.01､0.02､0.04､0.08和0.16 mmol/L)等条件进行优化,筛选PCR扩增的最佳反应体系和程序｡1.8 PCR敏感性试验将副猪嗜血杆菌血清4型菌株纯培养后,取菌液进行细菌平板计数测得菌液浓度为 6.8×106 CFU/mL,将其作为模板进行10倍倍比稀释(10-1､10-2､10-3､10-4､10-5､10-6),每个梯度取菌液1 mL作为模板,采用优化后的PCR扩增条件进行扩增,检测其敏感性｡1.9 PCR特异性试验分别以副猪嗜血杆菌､链球菌､巴氏杆菌､产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的细菌培养液和猪细小病毒(PPV)､猪圆环病毒2型(PCV2)､猪伪狂犬病病毒(PRV)的DNA为模板,进行PCR反应,验证PCR的特异性｡1.10 临床样品的检测与序列比对对闽西几个规模化猪场采集的13份疑似副猪嗜血杆菌病料进行PCR检测和生化鉴定,随机挑取阳性产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序,将测序结果与GenBank的HPS 16 S rRNA进行同源性比较分析｡2 结果与分析2.1 PCR反应条件的优化结果对HPS引物浓度､dNTP浓度､退火温度等条件进行了筛选｡结果最佳退火温度为56.6 ℃(图1),最佳dNTP浓度为0.04 mmol/L(图2),最佳引物浓度为0.20 mmol/L(图3)｡2.2 PCR反应程序的确定通过对PCR 扩增条件优化,最终确定反应循环参数为:94 ℃5 min;94 ℃45 s,56.6 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,35个循环;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存｡2.3 特异性试验结果结果显示只有HPS扩增出特异性条带,而其他对照组均未扩增出明显条带(图4)｡2.4 敏感性试验结果将副猪嗜血杆菌菌液做10倍倍比稀释后,进行PCR扩增,结果显示阳性结果的最高稀释度为10-4(图5),表明该法的最低检出限为6.8×102 CFU/mL｡2.5 PCR的临床应用和序列比对对临床13份疑似病料进行检测,结果8份样品为阳性(图6),与生化鉴定结果一致,并随机挑取4份PCR阳性产物进行了测序,与已发表的部分菌株同源性达到99%~100%｡3 小结与讨论由于副猪嗜血杆菌对营养的要求特别苛刻,难于培养和分离,往往影响临床的诊断结果｡抗生素的大量使用也大大降低了副猪嗜血杆菌的分离率,给诊断和治疗带来一定困难｡常规的血清学方法如琼脂扩散试验､间接血凝试验､ELISA[8,9]等灵敏性低,重复性差,往往导致诊断结果不准确｡而16 S rRNA基因普遍存在于细菌并参与细菌蛋白质的合成过程,成为细菌分类和鉴定的一个重要标志[10]｡本试验根据副猪嗜血杆菌16 S rRNA序列设计引物建立了快速的PCR检测方法｡本试验参考Oliveira等[7]的方法设计引物,从而使目的片段得到有效扩增,当引物浓度增加至1.20 mmol/L或dNTP浓度增加为0.16 mmol/L时,均无法扩增出目的条带,说明在PCR反应中引物和dNTP浓度并不是越高越好｡用建立的PCR方法对副猪嗜血杆菌､链球菌､巴氏杆菌､PPV､PCV2､PRV和产肠毒素大肠杆菌(ETEC)进行了检测,结果证明该方法对HPS有较好的特异性,敏感性试验最低可检测到6.8×102 CFU/mL细菌量｡对临床病料的检测,PCR检测结果和传统生化鉴定结果符合率为100%,本试验可直接以菌液为模板进行PCR扩增,使PCR诊断方法变得更为快速､简便,远比传统生化鉴定需要的时间短｡参考文献:[1] RAFIEEM, BLACKALL P J. Establishment, validation and use of the Kielstein-Rapp-Gabrielson serotyping scheme for Haemophilus parasuis[J]. Aust Vet J,2000,78(3):172-174.[2] NEDBALCOV A K,SATRAN P,JAGLIC Z, et al. Haemophilus parasuis and Glasser′s disease in pigs: a review[J]. V et Med,2006,51(5):168-179.[3] STRAW B E. 猪病学[M]. 第九版. 赵德明,张仲秋,沈建忠,译. 北京:中国农业大学出版社,2008.769-782.[4] KIM J, CHUNG H K,JUNG T, et al . Postweaning multisystemic wasting syndrome of pigs in Korea : prevalence , microscopic lesions and coexisting microorganisms[J]. J Vet Med Sci,2002,64(1):57-62.[5] 尹秀凤,姜平,邓雨修,等.副猪嗜血杆菌的分离与鉴定[J]. 畜牧与兽医,2004,36(7):6-8.[6] 蔡旭旺.副猪嗜血杆菌:诊断､流行病学和防制的新趋势[J].国外畜牧学(猪与禽),2004,24(6):49-56.[7] OLIVEIRA S,GALINA L,PIJOAN C. Development of a PCR test to diagnose Haemophilus parasuis infections[J]. J V et Diagn Invest,2001,13(6):495-501.[8] OLIVEIRA S,PIJOAN C. Haemophilus parasuis: new trends on diagnosis, epidemiology and control[J]. V et Microbiol,2004,99(1):1-12.[9] DEL R?魱O M L, GUTI?魪RREZ C B, RODR?魱GUEZ FERRI E F.V alue of indirect hemagglutination and coagglutination tests for serotyping Haemophilus parasuis[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(2):880-882.[10] 覃宗华,蔡建平,吕敏娜,等. 鸭疫里默氏菌病和大肠杆菌病鉴别诊断双重PCR方法的建立和应用[J].畜牧兽医学报,2008, 39(4):517-521.。
猪胸膜肺炎放线杆菌与副猪嗜血杆菌分离鉴定和药敏试验
５０４ ； ． １６ ２ ２ 福建农林大学动物 科学学 院， 福建 福州
文章编号： ｏ — ９ ７２ ０ ）１０ ４ — ２ １ ２ １５ （０ ８０ — ０ ９ ０ ０
３００） ５ ０ ２
文献标志码 ：Ｂ
猪胸 膜肺 炎放线 杆菌 ｃ ｎｂｃ ｕ ｌ ｒ — 监 察所 。 ｔ ｏ ａｉ ｓｐ ｕｏ ｉ Ｕ ｅ ｐ
一
１ ． 细茵的分 离 ２ 打开胸腔，用无菌接种环挑取肺气管 中的分泌
物和 胸腔 内纤 维素性渗 出物接种 于巧克力培 养基。 置５ ０ 培养箱 中３ ℃培养２ 。观察菌落状态， ％Ｃ ７ ４ ｈ 然 后挑取可疑菌落进行纯培养 。 １ 细茵形态及生化特性检查 ． ３ １ ． 形态学检查 挑单菌落均匀涂布于有生理盐 ．１ ３ 水的载玻片上， 革兰 氏染色， 镜检。 １ ． 培 养特性 将细菌接种 于普通鲜血 平板 、 ．２ ３ 含 Ｖ因子 的鲜 血平板 、 乳糖 营养 肉汤 、 Ｖ因子 的营 含 养肉汤 、Ｓ Ｔ Ａ平板 、 ｖ因子 的 Ｔ Ａ平板 、 含 Ｓ 麦康凯培 养基 以及 巧克力培养基中， 察细菌 的生长情况 。 观 １ ． 卫星现 象试 验 将细 菌接种 于 不含 Ｖ 因子 ．３ ３ 的鲜血琼脂平板上 ， 用金黄色葡萄球菌垂直划线 ， 置 ３ Ｏ 培养箱 中 ２ ， ７ｏ Ｃ Ｃ ４ 观察细菌的生长状况 。 ｈ １ ． 生化试验 先于生化管中加入 ｖ因子． ．４ ３ 使其 浓度达 １０ ／ Ｌ 然后接种分 离的细菌 ， Ｃ ０ ｇ ， ｍ 置 Ｏ 培 养 箱中，４ ２ ｈ后观察生化反应情况。 １ ． Ｃ ＭＰ试验 在鲜血 平板上 先划线接种金黄 ．５ Ａ ３ 色葡萄球菌 ， 再垂直于金黄色葡萄球菌划线方 向， 间 距 ３ ５ ｍ处分别接种 分离菌 ，置含 ５ Ｏ 培养箱 ～ ｍ ％Ｃ ， 中，７ ３ ℃培养 ２ ｈ 观察溶血现 象。 ４ ， ｌ ． Ｐ Ｒ鉴定 根据 Ｇ ｎ ａｋ上发表 的序列 ， ＿６ Ｃ ３ ｅＢ ｎ 设 １ 材料与方法 计 了扩增 副猪嗜血杆菌（ｌ ２ Ｐ、 ） Ｐ 和胸膜肺炎放 线杆菌 ｌ 试验材料的准备 ＿ １ 胰大豆琼脂培养基（Ｓ ） 于北京普 博欣 公司； Ｔ Ａ购 Ｐ 的引物 ， ４ ） 由广 州赛 百盛基 因技术 有 限公 司合 巧克力平板 培养基 、 鲜血 平板 培养基 、 普通 琼脂平 成 弓物 。Ｐ： Ｇ Ｔ Ｔ Ｇ Ａ Ａ Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ Ｃ Ａ 一 ｌ ， 一 ＣＣ ｒＧ Ａ Ｃ ｒＧ Ａ ＴＴ Ａ ５ 板培养基 由实验室 自制； Ｖ因子 （ 烟酰胺腺嘌呤二核 ３； ２ Ｔ Ａ Ｃ Ｔ Ｇ Ｔ Ｔ Ｃ Ｔ Ｇ Ｃ ３， 增 长 度 Ｐ： 一 Ｔ Ｇ Ｃ Ｔ Ｃ Ｃ ｒ Ｔ Ａ Ｃ 一 扩 ５ ０ ｐ； ３ ５ Ｔ ＇ ＡＴＩ 苷酸 ）Ｐ Ｒ相 关试剂购 于大连 宝生 物工 程有 限公 １ ９ ０ ｂ Ｐ ： 一 ＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＴＩ ＴＧＧＣＡ 、Ｃ 司； 微量生化鉴 定管由杭 州天和微生物试剂 有 限公 Ｃ一３ ； ： ＣＣＣＡＡＧＣＴｒＩ Ｐ ～ ５ ＴＣＧＴ ＧＴＹ ＡＡＡＧＣＡＧ ＡＴ ＡＴ 一 扩增长度 ５ ２ｂ 。 ２ Ｄ 检测副猪嗜血杆菌反应体 系 司提供 ； 金黄色 葡萄球 菌标 准菌株 ， 自中国兽药 Ｃ ３， 购 为： ０ Ｐ ＲＢ ｆ ｒ． ，Ｎ Ｐ ２ ｍ ｌ ） ，１ １ｘ Ｃ ｕ ｅ ５ ２ Ｌ ｄ Ｔ ｓ（． ｍ ｏ Ｌ２ Ｐ ５ ／ Ｌ 收稿 日期 ：０７ ｌ～ ６收稿 ，０ ７ １ —０修 回 ２０一Ｏ １ ２０—０２ （ ｍ ｌ ） Ｐ（ ｍ １ ） ０ ．， ａ （ Ｉ／ Ｌ ２ ｐ ｏ Ｌ 和 ２ ０ｐ ｏ Ｌ 各 ． ｐ ｒ ｑ５ Ｕ ￣ ） ０ ／ ２ ］ ５ ＬＴ 作 者 简 介 ： 欣 （９ ０ ） 男 ， 东临 朐 人 ， 士 ， 要 研 究 方 向 张 １８ 一 ， 山 硕 主 ０２ ， ． Ｌ模板 １ ， Ｌ灭菌双蒸水 １ ． 。混合均匀后 ８ Ｌ ３ 为家畜传染病 学． 置 核 酸扩 增 仪 中 执行 以下 程 序 ： ９ ４℃ ４ｍ ｎ９ ｉ，４℃ 通讯作 者： 罗满林 ， 教授 ， 主要从事动物传 染病学研 究． Ｅ— ｉ ｌ ｏ ＠ｓ １ ｄ ． ｎ ｍａ ｌ ｕ ｍｌ ｃ Ｉ． ｕ ｃ ： ａ ｅ １ ｎ５ 。 ｍｉ ０℃ １ ｉ， ｎ ２℃ ３ｍ ｎ运行 ３ ｍ ７ ｉ， ０个循 环 ； 最后
副猪嗜血杆菌PCR鉴定方法的建立
Ｃ ９ ｎ，４℃ ３ ， ０℃ ３ ，２℃ ０Ｓ ５ ０Ｓ７ 上游 引物５ＧＴ Ｇ ＡＧＧ ＡＡＧ ＧＧＴ ＧＧ ３ ， 、 Ｇ ＡＴ Ｔ ＧＴ 、 下 Ｐ Ｒ反应条件 为 ： ５℃ ２ｍｉ ９
３ 结果与讨论
用上述 １ 个分 离株 、 个胸膜肺炎放线杆 菌株和４ ０ １ 个ＨＰ Ｓ
． 将 副猪嗜血 杆菌标准株 ： ４ Ｓ ｌ４ Ｓ １０ Ｓ １ ， ３ １分离株的扩增 ＮＲ 、 Ｗ ２ Ｗ ４ 、 Ｗ１ ４
疑似副猪嗜血杆 菌国内分 离株 ： ＷＦ ＮＪＮＧ株 、 ＱＤ 株、 Ｉ ＸＸ株 、
炎 等为特征 。
一
。
每 个平 板 加入 ｐ ． 的 冲洗 液 ， Ｈ７０ 然后 ５０ ０ｒｍｉ离 心 ０ ／ ｎ
１ 材 料
１ １ 菌株 ．
５ｍｉ 弃 上清 再￣ＩＢＳ １ ｎ， ｊＰ 液 ０ｍＬ离 心 ， 此重 复３ ， 后 ［ 如 次 最
沉淀 加 纯水 ２ ０ｍＬ， ℃ 备 用 。 ４
和江苏省 ７ 资助。 １
Ｘ 等在该位置扩 增条带没有出现 （ Ｍ９ 见图１ 。 明以该方法检 ）说
２ 猪业科学 Ｓ ＩＥ ＩＤ Ｓ Ｒ Ｃ Ｅ Ｃ ２ ０ 年 第ｌ 期 ６ ＷＮ Ｎ Ｕ Ｔ Ｙ Ｓ ＩＮ Ｅ ０ ７ ２
维普资讯
副猪嗜血杆菌Ｐ Ｒ Ｃ 鉴定
方法的建立
周勇岐 刘茂军’ ，苏 国东 ，朱晓玮 ，丁美娟 ，邵国青 ’ （． １ 江苏省农业科学院兽医研究所 江苏 南京 ２ ０ １ ；２ 南京天邦生物科技有 限公司 江苏 １０ ４ ． 南京 ２ １ｏ ） １ ｌ２
副猪嗜血杆菌菌体蛋白双向电泳技术的建立
采用 双 向 电泳 技术 ，构建 起副 猪 嗜血 杆菌 全 菌蛋 白分 离 技 术 。以 ０ ． ２ ｇ Ｎ体 按照 １ ：４的 比例放 人 配制 好 的裂解 缓 冲液 中匀浆 ；室温 期为 了解 副 猪 嗜血 杆 菌其 主要 蛋 白表 达 的变化 ，差异 性 表 达蛋 白 静 置３ ０ ａ ｒ ｉ ｎ ，４ ￣ Ｃ １ ５ ０ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ离 ￣ １ ， ６ ０ ｎ ｌ ｉ ｎ ，最后用 超声 仪 对其进 行 的筛选 及 功能研 究奠 定基 础… 。 超 声 ，最 后 ，上清 即为粗 提 的菌 体蛋 白。用 ２ 一 Ｄ ｃ ｌ ｅ ａ ｎ — ｕ ｐ ｋ ｉ ｔ 纯 化 粗 提 的菌体 蛋 白 ，方 法按 ２ 一 Ｄ ｃ ｌ ｅ ａ ｎ — ｕ ｐ ｋ ｉ ｔ 试 剂盒 操作 指南 进行 。 １ 材料与方法 我 们 利 用Ｂ ｒ ａ ｄ ｆ ｏ ｒ ｄ 法 蛋 白定 量 试 剂盒 测 定 蛋 白质 的浓 度 ，根 据 试 １ ． １ 材 料
副猪 嗜血 杆菌 （ Ｈ ａ ｅ ｍ ｏ ｐ ｈ ｉ ｌ ｕ ｓ ｐ ａ ｒ ａ ｓ ｕ ｉ ｓ ，Ｈ Ｐ Ｓ） 隶属 于 巴氏杆 菌 所升高 ，我们选择了高温等四ห้องสมุดไป่ตู้条件来模拟该菌在猪体内的生长 科 嗜血 杆菌 属 ，是 猪 上呼 吸道 的一种 共柄 菌 ，在特 定条 件 下可 引
环境 。我们 采取 模 拟体 内发 病时 的体 外 生 长环 境 ：首 先 ，挑 取 在 发 猪严 重 的全 身性 疾 病 ，主要 引起猪 纤 维 素浆 膜炎 、关 节 炎 和脑 巧克 力 培 养基 上单 个 生 长 良好 的 菌落 接种 到 含 ２ ０ ０ ｍ ｌ 脑心 浸 液 培 膜 炎等 。该菌 较 多的 与诸 如猪蓝 耳病 、猪 圆环病 毒２ 型 、猪瘟 等混 养基 中 ，其 中 ，一 瓶 在正 常 条件 下培 养 ，另一 瓶 在特 殊 条件 下 培 合感 染 ，严重 危 害了青 年猪 和仔猪 的健 康 。 养 。特 殊 条 件 为 首 先 往 培养 基 中添 Ｊ ／ １ ］ ２ ０ ０ ｍＭ，２ － ２ ’一 联 吡 啶 和 近 年来 ，南于 该病 频 发 ，给养 猪 业造 成严 重 的 经济 损 失 ，因 醋酸 钠 ；其 次 ，把 培 养基 放 在４ Ｏ ℃高 温 条 件下 和 做需 氧 条件 下 培 此 ，备 受业 界 专业 技 术人 员等 的关 注 。过 去 ，人 们 在副 猪 嗜 血杆 养 。 菌 的分 子生 物 学 、毒 力 、致病 机理 与 致病 性 等方 面 的研 究 中取 得 １ ． ２ ． ２ 提 取 菌体蛋 白
猪肺炎支原体和猪鼻支原体双重PCR检测方法的建立与应用
猪肺炎支原体和猪鼻支原体双重PCR检测方法的建立与应用刘茂军;王占伟;韦艳娜;马庆红;杨莉莉;周勇岐;邵国青【摘要】根据猪肺炎支原体（Mhp）和猪鼻支原体（Mhr）的16S rRNA基因设计3条引物,建立Mhp和Mhr的双重PCR检测方法,并对该方法进行了特异性和敏感性试验。
应用建立的方法检测了临床样品和疫苗样品。
结果显示,该方法具有良好的特异性,最低可检测到0.66 ng的Mhp基因组DNA和0.58 ng Mhr基因组DNA。
临床样品和疫苗样品检测结果与普通PCR检测结果一致。
该双重PCR 方法可用于Mhp与Mhr的鉴别、诊断以及疫苗纯粹性检查,快速而准确。
%According to the 16S rRNA gene of Mycoplasma hyopneumoniae(Mhp) and Mycoplasma hyorhinis(Mhr),we designed three primers and established a double PCR method for simultaneous detecting Mhp and Mhr,and the specificity and sensibility assay of the method were performed.The clinical samples and vaccine sample were detected by the method.The results showed that the specific DNA fragment could be amplified from Mhp and Mhr,and the minimum detection limit could reach to 0.66 ng of Mhp genome DNA and 0.58 ng of Mhr genome DNA.The results of clinical samples and vaccine samples test with the double PCR were consisted with that by the normal PCR.Therefore,the double PCR method is a fast and accurate method for the detection and diagnosis of Mhp and Mhr.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2012(046)009【总页数】4页(P7-10)【关键词】猪肺炎支原体;猪鼻支原体;PCR;检测【作者】刘茂军;王占伟;韦艳娜;马庆红;杨莉莉;周勇岐;邵国青【作者单位】江苏省农业科学院兽医研究所·农业部兽用生物制品工程技术重点实验室·国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所·农业部兽用生物制品工程技术重点实验室·国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所·农业部兽用生物制品工程技术重点实验室·国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所·农业部兽用生物制品工程技术重点实验室·国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京210014;南京天邦生物科技有限公司,南京211102;江苏省农业科学院兽医研究所·农业部兽用生物制品工程技术重点实验室·国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京210014 南京天邦生物科技有限公司,南京211102;江苏省农业科学院兽医研究所·农业部兽用生物制品工程技术重点实验室·国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京210014【正文语种】中文【中图分类】S859.797猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS)的主要病原，该病又称猪气喘病或猪地方流行性肺炎(EPP)，是一种猪的慢性呼吸道传染病，在全世界广泛存在，长期以来被认为是最常发生和经济意义重大的猪病之一。
副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立及初步应用
副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立及初步应用副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立及初步应用导言：副猪嗜血杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）是引起猪链球菌病（porcine pleuropneumonia, APP）的主要病原菌之一。
该病在全球范围内广泛分布，对养猪业造成了严重损失。
因此，建立一种可快速、敏感、特异性的PCR检测方法，对副猪嗜血杆菌的定性与定量检测具有重要意义。
一、材料与方法1. 实验材料：（1）猪链球菌脱氧核糖核酸（DNA）样本：通过猪链球菌感染猪体，分离获得猪链球菌细菌株，提取其DNA，作为阳性对照。
（2）副猪嗜血杆菌菌株：鉴定并保存不同型号的副猪嗜血杆菌菌株作为实验材料。
（3）PCR试剂盒：包括PCR扩增酶、引物等。
2. 实验方法：（1）副猪嗜血杆菌菌株培养：将培养基中的副猪嗜血杆菌菌株接种于含有适合生长的培养基中，在37℃条件下培养至其达到合适的生长状态。
（2）DNA提取：采用商用DNA提取试剂盒，按照说明书提取培养基中的副猪嗜血杆菌的DNA。
（3）PCR反应：将提取的副猪嗜血杆菌DNA与PCR试剂盒中的扩增酶和引物混合，进行PCR反应。
反应条件为：酶解前处理（95℃ 5min）、酶解依次处理（95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，重复40次）、终止处理（72℃ 10min）。
（4）PCR产物检测：将反应产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，用紫外线照射后观察结果。
根据预设的PCR产物大小，判断是否有副猪嗜血杆菌的特异DNA产物出现。
二、PCR检测方法的优化与调控1. 引物的优选：设计一对特异性引物，确保扩增产物的相对特异性。
通过与相关细菌的DNA进行反应，验证引物的特异性。
通过调整引物浓度，确定最佳扩增效果。
2. PCR条件的优化：调整PCR反应温度、时间和循环次数，通过观察PCR产物的强度和清晰度，确定最佳PCR反应条件。
三、副猪嗜血杆菌PCR检测方法的初步应用通过上述步骤，建立了一种基于PCR的副猪嗜血杆菌检测方法。
副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立与初步应用
１ ． 直接镜检 取肝 、 ．１ ２ 脾触 片 ， 革兰 氏染色 。 副猪 嗜血 杆菌属革兰 氏阴性短小杆菌 ， 形态多变 。 １ ． 菌株 的培养 培养用营养琼脂 （Ｂ ， ．２ ２ Ｎ ） 加入 ５ ０ ｍＩ 犊牛血清和 ３～ ０ｍ ／ 几 ０５ ｇ Ｌ的 Ｎ Ｄ ３ 培养 ２ Ａ ，７ｏ Ｃ ４ｈ 左右后 ４ｑ保存。或将 Ｈ Ｓ分离株接种于含有 ｖ因 Ｃ Ｐ
１ 材 料 与 方 法 １１ 试 验 材 料 ．
１１ 菌株 大肠 埃希 氏杆菌、 门氏菌 、 ．１ ． 沙 胸膜肺 炎 放 线杆菌、 铜绿假单胞菌 、 链球菌和葡萄球 菌等 均 由 贵州省 畜牧兽 医研 究所畜禽 疫病研 究室分 离保存 。 副猪嗜血杆菌标准菌株 由华 中农业 大学提供 。 １１ 酶 及试 剂 Ｐ Ｒ Ｍａｔ ｉ 冲液 、 ｒｅ ．２ ． Ｃ ｓ ｒＭ ｘ缓 ｅ Ｍａｋｒ Ｄ ０ Ｌ２００购 自华美 生物工程 公司和恒 因生物公 司 ，
关键词 ： 副猪 嗜血杆 菌；６ Ｎ １Ｓｒ Ａ基 因； Ｒ 聚合酶链 式反应（ Ｃ Ｐ Ｒ）
副 猪嗜 血杆 菌 （ ａｍ ｐ ｉ ｓ ａａｕ ， Ｐ ） Ｈ ｅ ｏ ｈｌ ｒｓｉ Ｈ Ｓ 是 ｕｐ ｓ 种 革 兰 氏 阴性 、 非溶 血 性 、 Ａ 烟酰 胺 腺 嘌 呤 Ｎ Ｄ（ 二 核 苷 酸） 赖 性 细菌 ， ｌ 依 有 ５个 血 清 型 。Ｈ Ｓ可 Ｐ 引起猪 的纤 维素 性 多发性 浆膜 炎 、 关节 炎 、 胸膜 炎 和脑 膜 炎 ， 自 １ １ ９０年 以来就被 认为 是猪革拉 泽 氏 （ｌｓ ｒ ） 的病原 体 。Ｈ Ｓ 在于健 康猪 的上 呼 Ｇａｓ ＇ 病 ｅｓ Ｐ存 吸道 ， 临床上 主 要感 染小 猪 ， 别 是 ４ ６周龄 的断 特 奶仔 猪 ， 临床 特征为 急性败血症 ， 往往在感 染后 ２ｄ 死亡 ，会给养猪业 造成重大经济损失 。副猪嗜血杆 菌病 在我 国一些养猪 基地 、 养猪 专业 户及农户 的猪 群 中存在 ， 严重危害猪群健康 。 ０ ０年 以来 ， ２０ 国内外 均有 关于副猪嗜血杆菌分离培养 、 生化鉴定 、 血清 学 试验 和 Ｐ Ｒ检 测的报道 。Ｒ ｅ 等 （０ ０ 首先建立 Ｃ ｅ ２０） 了 Ｅ Ｉ — Ｃ 国 内尹秀凤 等 （０ ４ 率先 开展 了副 Ｒ Ｃ Ｐ Ｒ； ２０） 猪 嗜血杆菌 的分离与鉴定 ， 用特异 性的Байду номын сангаасＰ Ｒ检测 副 Ｃ 猪 嗜血杆菌 １Ｓｒ Ｎ ６ Ａ基 因和 ｔｐ Ｒ ｂ Ａ基 因。为了解 副 猪 嗜血杆 菌病对贵卅Ｉ 当地猪群 的危 害和流行 规律 、 为进 一步开展副猪嗜血杆菌病 的防治研 究提供 参考 依据 ，笔者进行 了适合检测副猪嗜血杆菌贵州地 方 株 的 Ｐ Ｒ方法的应用研究 。 Ｃ
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立
行 观察 。
１ 材 料 与 方 法 １ １ 材 料 ．
１１ １ 菌 株 ： ．． 胸膜 肺 炎 放 线 杆 菌 、 肠 埃 希 氏 杆 菌 、 丹 毒 大 猪 杆 菌 、 球 菌 和 葡 萄菌 均 由本 实 验 室 分 离 保 存 。 链
１１２ ．． 酶 及 试 剂 ： ｑ Ａ 聚 合 酶 、 Ｎ Ｐ（ ｘ 、 ｒ ｅ ＴａＤＮ ｄ Ｔ ｍｉ） Ｍａｋ ｒ ２０ ０ ０购 自华 美生 物 工 程 公 司 ， ｒｔｉｅＫ、 ＮａｅＡ 购 自上 Ｐ ｏｅ ｓ Ｒ ｓ ｎ
验 、 扩 试 验 、 胶 凝 集 试 验 等 。 由 于 Ａ Ｐ有 １ 琼 乳 Ｐ ５个 血 清 型 ，
１２ ３ Ｐ Ｒ 扩 增 ： Ｐ Ｒ 反 应 管 中 加 人 Ｔａ ．． Ｃ 在 Ｃ ｑ酶 预 混 酶
８ ８ ，Ｐ （ 游 引 物 ） Ｌ Ｒ（ 游 引 物 ） １ ｌ模 板 Ｄ Ａ ． ｌＬ Ｆ 上 、Ｐ 下 各 ， Ｎ ３ ， 菌 去 离 子 水 １ ． ｌ组 成 ２ ｌ 反 应 体 系 ； 成 为 ｌ灭 １２ ， ５ 的 使
ｍ ｎａ． Ｐ ） ｏ ｉ Ａ Ｐ 引起 的高 度 接 触 性 、 死 性 呼 吸 道 疾 病 ， ｅ 致 以纤 维 素 性 胸 膜 肺 炎 和 出 血 性 坏 死 性 肠 炎 为 主 要 病 理 特 征 。病 猪
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立及应用
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立及应用杨永能【摘要】猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起猪的一种高度接触性呼吸道传染病,该病可给养猪业造成巨大的经济损失.为有效控制和确诊该病,根据报道的猪胸膜肺炎放线杆菌APXIV毒株的基因序列,合成了2对可扩增长度分别为442 bp和378 bp的特异引物,建立检测胸膜肺炎放线杆菌的巢式PCR方法.利用合成的引物在扩增猪肺疫巴氏杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌和大肠杆菌等细菌DNA时,结果均为阴性.用引物检测猪胸膜肺炎放线杆菌的标准菌株可扩增出442 bp和378 bp的特异性条带.表明运用PCR法检测猪胸膜肺炎放线杆菌的特异性和灵敏性均较高,可作为猪传染性胸膜肺炎的快速诊断和流行病学调查的手段.【期刊名称】《中国猪业》【年(卷),期】2019(014)006【总页数】5页(P43-46,50)【关键词】猪传染性胸膜肺炎;放线杆菌;巢式PCR【作者】杨永能【作者单位】云南省楚雄彝族自治州动物疫病预防控制中心, 云南楚雄 675000【正文语种】中文【中图分类】S828;S852.61+9猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia，PCP）是世界范围的猪病，给养猪业带来了严重的经济损失。
为有效地预防和控制该病，建立一种快速、灵敏又特异的检测方法势在必行。
目前，国内诊断该病的方法大多是采用细菌分离鉴定和血清学诊断，细菌分离鉴定费时、费力、过程繁琐且有时分离不到致病菌；血清学诊断虽然简便、快速，但有其局限性，如亚临床感染或带菌状态下易造成假阴性，对免疫猪和感染猪不能做出有效的鉴别诊断。
猪传染性胸膜肺炎有15个血清型，目前，虽然已建立了以胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP） APXI、APXII、APXIII及OMP等某一DNA片段为目标基因的PCR诊断方法，但与胸膜肺炎放线杆菌相近的菌属较多，且也存在这些目标基因或者与目标基因差别极小的基因片段，在进行PCR扩增时，偶尔会出现假阳性，造成误诊。
非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重荧光PCR检测试剂盒及使用
专利名称：非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重荧光PCR检测试剂盒及使用方法
专利类型：发明专利
发明人：于新友,王金良,孟卫芹,沈志强,陈金龙,董林,王海丽申请号：CN202011453158.6
申请日：20201211
公开号：CN112481416A
公开日：
20210312
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重荧光PCR检测试剂盒及使用方法，试剂盒包含核酸释放剂、反应预混液Premix Taq、荧光染料LyGreen、阴性对照、阳性对照以及引物混合液，引物混合液中，引物的核苷酸序列为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；在使用方法中，控制荧光PCR扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性20s；55℃退火20s；72℃延伸20s；40个循环。
使该试剂盒具有敏感性和特异性高的优点；可一次性完成对非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌检测，使检测过程更加简单、易于操作。
申请人：山东绿都生物科技有限公司,山东省滨州畜牧兽医研究院
地址：256600 山东省滨州市经济开发区绿都生物工程高科技园
国籍：CN
代理机构：济南舜源专利事务所有限公司
代理人：牟京霞
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猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌多重PCR检测方法的建立和应用
猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌多重PCR检测方法的建立和应用孙学飞;倪艳秀;茅爱华;何孔旺【期刊名称】《江苏农业学报》【年(卷),期】2016(032)005【摘要】根据已发表的猪呼吸道疾病主要致病菌猪链球菌（SS）、胸膜肺炎放线杆菌（APP）和副猪嗜血杆菌（ HPS）基因序列合成3对特异性引物，通过单一PCR和三重PCR体系及条件优化，建立这3种致病菌的三重PCR检测方法，并对200份临床表观健康猪鼻拭子样品用三重PCR方法进行检测。
结果显示：建立的三重PCR方法能对同一样品中的SS、APP、HPS 3种病原菌的DNA模板进行扩增，无交叉反应；对猪体内常见的猪多杀性巴氏杆菌、猪大肠杆菌、猪放线杆菌、猪葡萄球菌、猪丹毒杆菌、猪沙门氏菌进行扩增，并无任何扩增产物；对SS、APP、HPS细菌纯培养物的检测敏感性分别为1×104 CFU／ml、1×103 CFU／ml、1×103 CFU／ml；对人工模拟SS、APP、HPS感染组织样品的敏感性均为1×104 CFU／ml。
三重PCR方法对200份临床表观健康猪鼻拭子样品的检测结果显示：SS阳性160份，阳性率80�0％；APP阳性3份，阳性1�5％；HPS阳性45份，阳性22�5％。
分别用细菌分离法和三重PCR法对30份临床病料进行检测，两者检测结果的符合率达到93％。
建立的三重PCR可在4�5 h左右得到检测结果。
【总页数】6页(P1094-1099)【作者】孙学飞;倪艳秀;茅爱华;何孔旺【作者单位】安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230000; 江苏省农业科学院兽医研究所，江苏南京 210014;江苏省农业科学院兽医研究所，江苏南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所，江苏南京 210014;安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230000; 江苏省农业科学院兽医研究所，江苏南京 210014【正文语种】中文【中图分类】S858.282.61【相关文献】1.复合PCR鉴定胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌方法的建立及初步应用 [J], 贺英;赵萍;储岳峰;高鹏程;逯忠新;赵海燕2.副猪嗜血杆菌和猪传染性胸膜肺炎放线杆菌双重 PCR 检测方法的建立及应用[J], 余远迪;曾泽;岳华;张斌3.猪的胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌复合PCR检测方法的建立 [J], 米丰泉;陈小玲;王翠敏;赵玉军;王凤强4.猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌复合PCR检测方法的建立 [J], 朱吕昌;陈义平;李明义;郭玉广;马爽;周洁5.猪胸膜肺炎放线杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌复合PCR检测方法的建立 [J], 米丰泉;陈小玲;赵玉军;王翠敏;王凤强;张彦因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR诊断方法的建立与应用
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR诊断方法的建立与应用张建新;朱岩昆;马金友;赵杰;余燕;韩科芳【摘要】According to the APP included in GenBank serum surface antigen of D15 type 1 to 14 and 16S rRNA gene sequences were designed two pairs of primers, namely amplified two nucleotide fragments of 637, 431 bp, and built PCR detection method of APP. The results indicated that type-specific serum 1, 3, 5a, 8, 10 could amplify two expected fragments and Escherichia coli, Pasteurella, Salmonella, Streptococci and Staphylococci, and they were negative. Sensitivity checked out test results showed that the lowest concentration was 50/μL. 5 strains of clinical isolates strain suspected APP by PCR ,the results showed that in four of them were positive, one was negative. The specificity of PCR detection method of the experimental establishment was strong specificity, high sensitivity.%根据GenBank登录的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)血清1～14型的表面抗原蛋白D15和16S rRNA基因序列,设计2对特异性引物,分别扩增出637、431 bp两条核苷酸片段,建立了APP 的多重PCR检测方法.特异性结果表明,血清1、3、5a、8、10型能扩增出两条与预期大小的片段,而扩增的大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、链球菌、葡萄球菌均成阴性.敏感性试验结果表明,最低检出浓度为50/μL.对临床分离的5株疑似APP 菌株进行PCR,结果表明,其中4株为阳性,1株为阴性.提示,该方法的特异性和敏感性均良好.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2013(040)004【总页数】4页(P69-72)【关键词】猪传染性胸膜肺炎;D15基因;16S rRNA;聚合酶链式反应(PCR)【作者】张建新;朱岩昆;马金友;赵杰;余燕;韩科芳【作者单位】河南师范大学水产学院,河南新乡 453003;河南师范大学水产学院,河南新乡 453003;河南科技学院动物科学学院,河南新乡 453003;河南师范大学水产学院,河南新乡 453003;河南科技学院动物科学学院,河南新乡 453003;河南师范大学水产学院,河南新乡 453003【正文语种】中文【中图分类】S855.1+2猪传染性胸膜肺炎（porcine pleuropneumonia）是由猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起猪的一种高度传染性呼吸道疾病，又称为猪接触性传染性胸膜肺炎，能引发病猪肺脏出血、坏死及纤维素性渗出（Jaglic等，2004），又以急性出血性纤维素性胸膜肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜肺炎为特征，急性呈高死亡率（杨汉春等，2005），其中1周龄～4月龄易感性高，病死率可达5%～30%。
猪胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立
猪胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立马晓平;曹三杰;文心田;肖国生;杨利;陈华美;张雪峰【摘要】根据已经发表的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(App)dsbE-like基因的序列,设计了一对可扩增374 bp目的片段的特异性引物.经PCR扩增,App1-4和6-10型标准菌株均能扩出约374 bp的片段,而对大肠埃希菌(K88)、巴氏杆菌(5:A)和链球菌(Ⅱ)的扩增结果均为阴性.用建立的方法来检测分离菌株MC、ME和MH,结果表明,该方法能用于临床分离株的检测.灵敏性试验表明本方法对App菌液最低检出浓度为71 cfu/mL.建立的PCR检测App的方法可用于临床上对App的检测.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2010(031)002【总页数】4页(P44-47)【关键词】猪;胸膜肺炎放线杆菌;PCR【作者】马晓平;曹三杰;文心田;肖国生;杨利;陈华美;张雪峰【作者单位】四川农业大学动物医学院动物传染病与基因芯片实验室,四川省动物疫病与人类健康重点实验室,四川雅安,625014;四川农业大学动物医学院动物传染病与基因芯片实验室,四川省动物疫病与人类健康重点实验室,四川雅安,625014;四川农业大学动物医学院动物传染病与基因芯片实验室,四川省动物疫病与人类健康重点实验室,四川雅安,625014;四川农业大学动物医学院动物传染病与基因芯片实验室,四川省动物疫病与人类健康重点实验室,四川雅安,625014;四川农业大学动物医学院动物传染病与基因芯片实验室,四川省动物疫病与人类健康重点实验室,四川雅安,625014;四川农业大学动物医学院动物传染病与基因芯片实验室,四川省动物疫病与人类健康重点实验室,四川雅安,625014;四川农业大学动物医学院动物传染病与基因芯片实验室,四川省动物疫病与人类健康重点实验室,四川雅安,625014【正文语种】中文【中图分类】S852.619猪传染性胸膜肺炎(Infectious p leuropneumonia of sw ine,IPPS)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus p leuropneumonia,App)引起的一种以胸膜炎、肺炎和肺脏的充血、出血、坏死以及纤维素性黏连为特征的传染病,患猪表现为高度呼吸困难,因急性败血症而突然死亡;感染后存活的育肥猪生长缓慢,平均日增重下降,饲料报酬低,耐过种猪因带菌往往成为潜在的传染源[1-2]。
副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测方法的建立
副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测方法的建立苗立中;沈志强;韩文瑜【摘要】为了建立基于SYBR Green Ⅰ的快速检测副猪嗜血杆菌(HPS)的实时荧光定量PCR方法,参照GenBank公布的HPS的infB基因序列(DQ:781933.1),设计特异性引物；提取HPS基因组,进行PCR扩增,回收目的片段；构建阳性标准模板,建立标准曲线；验证其敏感性、重复性和特异性.结果显示,本试验得到了阳性标准质粒,并建立了标准曲线,线性关系在102 copies/μL～108 copies/μL检测范围内良好；该方法敏感性达到10 copies/μL,比常规PCR高100倍,重复性试验变异系数均小于2.5％,同时对HPS具有良好的特异性.结果表明,本试验建立的副猪嗜血杆菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法可用于临床对HPS的快速诊断和定量检测.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2012(033)011【总页数】5页(P85-89)【关键词】副猪嗜血杆菌;infB基因;SYBR Green Ⅰ;荧光定量PCR【作者】苗立中;沈志强;韩文瑜【作者单位】吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春130062;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春130062【正文语种】中文【中图分类】S852.612副猪嗜血杆菌病被称为猪革拉泽氏病，是由副猪嗜血杆菌（Haemophlius parasuis，HPS）感染引起的猪的一种传染病［1］。
近年来，随着规模化养猪业的发展，该病已成为影响养猪业的新发典型细菌性疾病［2］，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。
目前，我国对副猪嗜血杆菌病的诊断主要通过传统的病原分离与培养、血清学方法以及常规分子生物学方法。
但由于HPS对营养要求苛刻，直接从病料中很难分离到HPS，且该菌培养期间易发生杂菌污染，不易纯化［3］。
副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术的建立与应用
副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术的建立与应用于江;徐绍建;刘少宁;周顺;王文志;王金宝;吴家强;张玉玉;王兆;李俊;丁鹏;李坤;刘洋;张金强【期刊名称】《家畜生态学报》【年(卷),期】2010(031)004【摘要】根据GenBank中的副猪嗜血杆菌(HPS)的infB基因的序列(DQ781808.1),利用分子生物学软件Premier 5.0设计一对特异性引物,建立基于SYBR Green I 荧光定量PCR检测HPS的技术.试验采用煮沸法从HPS培养物中提取DNA,进行PCR扩增.将鉴定正确的目的基因片段克隆入pMD18-T载体中,转化大肠杆菌DH5α,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为阳性标准品.结果表明,该方法对HPS具有良好的特异性,不与其它猪源细菌发生交叉反应,其敏感性比常规PCR高100倍,而且非常稳定,批间与批内重复试验变异系数均小于2.5%.临床应用表明本方法的建立实现了对HPS的快速诊断和定量的检测.【总页数】5页(P77-81)【作者】于江;徐绍建;刘少宁;周顺;王文志;王金宝;吴家强;张玉玉;王兆;李俊;丁鹏;李坤;刘洋;张金强【作者单位】青岛农业大学动物科技学院,山东,青岛,266109;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东,济南,250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东,济南,250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东,济南,250100;山东农业大学动物科技学院,山东,泰安,271000;青岛农业大学动物科技学院,山东,青岛,266109;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东,济南,250100;青岛农业大学动物科技学院,山东,青岛,266109;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东,济南,250100;山东农业大学动物科技学院,山东,泰安,271000;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东,济南,250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东,济南,250100;青岛农业大学动物科技学院,山东,青岛,266109;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东,济南,250100;青岛农业大学动物科技学院,山东,青岛,266109;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东,济南,250100;青岛农业大学动物科技学院,山东,青岛,266109;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东,济南,250100;青岛农业大学动物科技学院,山东,青岛,266109;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东,济南,250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东,济南,250100;山东农业大学动物科技学院,山东,泰安,271000【正文语种】中文【中图分类】S811.5【相关文献】1.副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测方法的建立 [J], 苗立中;沈志强;韩文瑜2.副猪嗜血杆菌PCR与荧光定量PCR检测方法的建立与比较 [J], 张颖;王建春3.副猪嗜血杆菌荧光定量PCR方法的建立及初步应用 [J], 崔沛;王东方;闫若潜;王淑娟;冉晓龙;班付国4.副猪嗜血杆菌及巴氏杆菌双重荧光定量PCR检测方法的建立 [J], 姜睿姣;罗燕;周丽军;邬旭龙;张鹏飞;罗梓丹;肖璐;王印;姚学萍;杨泽晓5.副猪嗜血杆菌荧光定量PCR的建立和临床应用 [J], 庞琳琳;马志永;袁万哲;魏建超;赵秋华;王欣;张俊杰;郭爽;李蓓蓓;刘珂;邵东华;邱亚峰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌的鉴别诊断及血清型鉴定
猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌的鉴别诊断及血清型鉴定张培君;PatBlackall;等【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2002(036)010【摘要】利用PCR技术、琼脂扩散试验、糖发酵试验和间接血凝试验(IHA)对野外分离到的可疑猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌进行了诊断和血清型鉴定.PCR鉴定分离物HS1580为副猪嗜血杆菌,分离物HS1582为猪胸膜肺炎放线杆菌;生化试验表明分离物HS1581和HS1582为猪胸膜肺炎放线杆菌;血清型鉴定分离物HS1580不属于被检的14个血清型之列,HS1581为App血清15型,HS1582为App血清7型.试验结果表明,综合使用PCR等技术可快速、准确地对这两种传染性细菌进行鉴别诊断和血清型鉴定.【总页数】4页(P18-20,28)【作者】张培君;PatBlackall;等【作者单位】北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京,100089;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京,100089;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京,100089;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京,100089;澳大利亚昆士兰州动物研究所,Qld 4105,Australia【正文语种】中文【中图分类】S852.619【相关文献】1.复合PCR鉴定胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌方法的建立及初步应用 [J], 贺英;赵萍;储岳峰;高鹏程;逯忠新;赵海燕2.猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌和多杀性巴氏杆菌的生化及分子鉴定 [J], 仇保丰;宋鸿雁;刘文斌;蔡宝亮;邵义祥;高逢结;顾炳泉;李建3.猪胸膜肺炎放线杆菌与副猪嗜血杆菌分离鉴定和药敏试验 [J], 张欣;崔敏;罗满林4.89株副猪嗜血杆菌临床分离株血清型、基因型鉴定与分析 [J], 王迪;陈章;邢刚;何长生;刘晓露;魏建忠;孙裴;刘雪兰;李郁5.镇江地区副猪嗜血杆菌分离鉴定血清型及耐药性检测 [J], 朱孟玲;刘庆新;孙智远;徐云明;章琰;王永娟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立及初步应用的开题报告
副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立及初步应用的开题报告标题：副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立及初步应用一、研究背景和意义副猪嗜血杆菌（A. pleuropneumoniae）是引起猪严重呼吸道疾病的重要病原菌之一。
该病的发病率和死亡率较高，对养殖业造成了严重的经济损失。
目前，临床诊断主要依靠临床症状和病原学检测，但这种方法存在着诊断不准确、耗时长等缺点。
因此，建立一种快速、灵敏、特异的检测方法是十分必要的。
PCR技术（聚合酶链式反应）是近年来广泛应用于病原菌检测的一种分子生物学技术，其具有快速、高灵敏度、高特异性等优点。
因此，采用PCR技术检测副猪嗜血杆菌的方法，可以提高病猪的临床诊断效率，促进副猪嗜血杆菌的防控工作。
二、研究内容和技术路线本研究旨在建立一种可靠的PCR检测方法，快速、高效地检测副猪嗜血杆菌。
具体研究内容如下：1. 筛选合适的引物和探针，确定PCR检测体系；2. 优化PCR反应体系，调整反应条件；3. 优化PCR产物分离及检测方法，确保检测结果准确；4. 建立PCR检测方法的标准曲线，并评估其特异性和灵敏度；5. 对不同来源的临床样本进行PCR检测，验证该方法的可行性和准确性。
技术路线如下：三、可行性分析PCR技术具有高灵敏、高特异性，且易于自动化处理，因此本项目的研究技术路线具有较高的可行性。
而该方法的建立及初步应用，对于副猪嗜血杆菌的迅速准确定性诊断，将具有重要的现实应用价值。
四、预期成果本研究预期建立一种快速、准确、灵敏的副猪嗜血杆菌PCR检测方法，并应用于猪场临床样本的检测，评估该方法的可靠性和实用性。
该研究的结果，将为副猪嗜血杆菌的临床诊断提供新的方法和手段，也将为猪业健康发展贡献一份力量。
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（ 西 南 民族 大 学 生 命 科 学 与技 术 学 院 ， 四Ｊ Ｉ ｌ 成都 ６ １ ０ ０ ４ １ ）
摘
要： 针对 副猪 嗜血杆 菌（ Ｈｐ ｓ ） １ ６ Ｓ ｒ Ｒ ＮＡ序 列和猪 传 染性 胸膜放 线杆 菌 （ Ａｐ ｐ ） Ａｐ ｘ ｌ Ｖ Ａ 基 因序 列各设
１ 材 料 与 方法
１ ． １ 材料
热、 咳嗽 、 呼吸 困难 、 消瘦 、 跛行 、 共济 失调 和被 毛粗 乱 等， 剖 检病理 变化 表 现 为 胸膜 炎 、 肺炎、 心包 炎 、 腹 膜 炎、 关 节炎 和脑 膜炎等 ； 主要危 害 ２ 周 龄～８ 周 龄 的仔 猪， 发病 率 一 般 为 １ ０ ～１ ５ ， 病死率可达 ５ Ｏ 以 上＿ Ｉ ］ 。猪胸 膜 肺 炎 放 线杆 菌 （ Ａｃ ｔ ｉ ｎ ｏ ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｐ ｌ ｅ ｕ ｒ ｏ － ｐ ｎ ｅ ｕ ｍ ｏ ｎ ｉ ａ ｅ ， Ａ ｐ ｐ ） 是 猪传 染 性 胸 膜 肺 炎 （Ｐ ｏ ｒ ｃ ｉ ｎ ｅ ｉ ｎ ～
该 方法对参 考菌株和 临床 分 离株 全部检 出 ， ３ ６份 临床 样 本 中检 出 Ｈｐ ｓ １ ８份 ， Ａ ｐ ｐ为 阴性 ， 与 单项 Ｐ Ｃ Ｒ检 测结
果 一致 ， 人 工感染组 织样 本也均能检 出。表 明该方 法适 用于 Ｈｐ ｓ 和Ａ ｐ ｐ的临床 快速检测 。 关键词 ： 副猪 嗜血杆 菌 ； 猪传 染性胸 膜放 线杆 菌； 双重 Ｐ Ｃ Ｒ方 法
（ ＨＳ Ｌ Ｏ ７ ７ ） 、 １ ２型 （ ＨＳ Ｌ Ｏ ７ ５ ） 、 １ ３型 （ ＨＳ Ｌ Ｏ ７ ９ ） 、 １ ４ 型
（ ＨＳ １ ０ ８ ０ ） 、 １ ５型 （ ＨＳ Ｌ Ｏ ８ １ ） 、 １ ０ ｏ株 Ｈｐ ｓ 临 床 分 离 株
（ ｓ ｗｕＮ ０ ５ ０ ～Ｓ ＷＵＮ１ ５ １ ） ， Ａｐ ｐ参 考 菌 株 血 清 １型
ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｕ ｓ ｐ ｌ ｅ ｕ ｒ ｏ ｐ ｎ ｅ ｕ ｍｏ ｎ ｉ ａ ） 的致病 菌 ， 以急 性 出血 和 慢
１ ． １ ． １ 菌株 与 毒 株
Ｈｐ ｓ菌 株 参 考 血 清 １型
（ ＨＳ ８ ２ ） 、 ２型 （ ＨＳ ８ ３ ） 、 ３型 （ Ｈ￥ ８ １ ） 、 ４型 （ Ｈ￥ ７ ９ ） 、 ５型 （ ＨＳ ８ ０） 、６ 型 （ＨＳ Ｌ Ｏ ７ ２） 、７ 型 （ＨＳ Ｌ Ｏ ７ ３） 、８ 型 （ ＨＳ １ ０ ７ ３） 、９ 型 （Ｈ￥ ５ ０） 、１ ０型 （ Ｈ￥ １ ０ ７ ６ ） 、１ １ 型
计 一对 引物 ， 分别 能扩 增大 小为 ８ ２ ２ ｂ ｐ和 ３ ４ ６ ｂ ｐ的 目的基 因片段 ， 建 立快速 鉴定 Ｈｐ ｓ 和 Ａ ｐ ｐ的双 重 Ｐ Ｃ Ｒ 方
法。特异性 试验表 明 ， 该方 法对 波氏杆 菌、 巴氏杆 菌 、 大肠 埃 希 菌、 沙 门菌、 金 黄 色葡 萄球 菌、 猪 圆环病 毒 ２型 、 猪 流感病毒 、 猪 繁 殖与呼吸综合征 病毒 的扩增结果 均为 阴性 。敏 感性试验表 明 ， 该方法与单 项 Ｐ Ｃ Ｒ的敏 感性一
（ Ｃ Ｖ Ｃ Ｃ ２ ６ １ ） 、 血 清 ４型 （ Ｃ Ｖ Ｃ Ｃ ２ ６ ２ ） 、 血 清 ５ 型
（ Ｃ Ｖ Ｃ Ｃ ２ ６ ３ ） 、 血 清 ６型 （ Ｃ ＶＣ Ｃ ２ ６ ４ ） 、 血 清 ７ 型 （ Ｃ Ｖ Ｃ Ｃ ２ ６ ５ ） 、 血 清 ８型 （ Ｃ Ｖ Ｃ Ｃ ２ ６ ６ ） 、 血 清 ９ 型 （ Ｃ Ｖ Ｃ Ｃ ２ ６ ７ ） 、 血 清 ｌ Ｏ型 （ Ｃ Ｖ Ｃ Ｃ ２ ６ ８ ） 、 血 清 １ １型 （ Ｃ ＶＣ Ｃ ２ ６ ９ ） 、 血清 １ ２型 （ Ｃ ＶＣ Ｃ ２ ７ ０ ） ， １ ５株 Ａｐ ｐ临 床
（ Ｃ Ｖ Ｃ Ｃ ２ ５ ９ ） 、 血 清 ２型 （ Ｃ ＶＣ Ｃ ２ ６ ０ ） 、 血 清 ３ 型
性纤 维素性坏死 性胸膜炎 病变 为 主要特 征 ， 慢 性症 状 表现 为可造成猪 生长缓慢 的肺 损伤 ， 给世 界各 地养 猪
业造 成严重经济 损失口 ］ 。在 临床诊 断 中 ， 很难 通过 临
感性试 验 ， 建立 了可快 速鉴别来自 测 副猪 嗜血杆 菌 和猪
普通猪 上呼 吸道 的一种共 栖菌 ， 能在 特定 条件 下侵 入 机体 而引起严重 的全身性 疾病 ， 以纤 维素性 多 发性 浆
膜炎、 关节 炎 和 脑 膜 炎 为 特 征 。主要 临 诊 症 状 为 发
传染性 胸膜放线杆 菌的双重 Ｐ Ｃ Ｒ方法 。
致， 最低 可检 测核 酸浓度 Ｈｐ ｓ ３ ８ ｐ ｇ ／ ｍＬ， Ａ ｐ ｐ ３ ． ８ ｐ ｇ ／ ｍＬ ￣ 最低检 测细 菌含量 Ｈｐ ｓ ８ ． ９ ｃ ｛ ｕ ， Ａ ｐ ｐ ２ ６ ． ９ ｃ ｆ ｕ 。利 用
该 方法检 测 Ｈｐ ｓ 和 Ａｐ ｐ参考 菌株 、 临床分 离株 、 ３ ６ 份 临床 肺组 织样 本和人 工感染的猪肺组 织样本 。结果 显示 ，
中 图分 类 号 ： ￥ ８ ５ ２ ． ６ １ ９ 文献 标 识 码 ： Ａ 文章 编 号 ： １ ０ ０ ７ — ５ ０ ３ ８ （ ２ ０ １ ３ ） １ ２ — ０ ０ ２ ９ — ０ ５
副猪 嗜 血 杆 菌 （ Ｈａ ｅ ｍｏ ｐ ｈ ｉ ｌ ｕ ｓ ｐ ａ ｒ ａ ｓ ｕ ｉ ｓ ，Ｈｐ ｓ ） 是
动物 医学 进展 ， ２ ０ １ ３ ， ３ ４ （ １ ２ ） ： ２ ９ － ３ ３
Ｐｒ ｏ ｇｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ Ｖｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ ｒ ｙ Ｍｅ ｄｉ ｃ ｉ ｎｅ
副猪 嗜血 杆 菌 和 猪 传 染 性 胸 膜 肺 炎 放线杆 菌双重 Ｐ Ｃ Ｒ 检 测 方 法 的建 立及 应 用