凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤备课讲稿
凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤
凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤实验目的：凝血酶滴定法测定水蛭素活性含量实验仪器和试剂：电子天平 酸度计 离心机 移液器 45度试管架 三羟甲基氨基甲烷（Tris ） 盐酸（Hcl ） 生理盐水 蒸馏水 凝血酶 纤维蛋白原及常用玻璃仪器实验步骤：1、称取1.21g 三羟甲基氨基甲烷加蒸馏水充分溶解，定溶到50ml ，浓度为0.2mol/L 。
2、用移液器取429ul 盐酸加蒸馏水充分溶解，定溶到50ml ，浓度为0.1ml/L 。
3、从1去25ml ，从2取40ml 混合调PH 到7.4（用1或2调），加蒸馏水定溶到100ml 。
4、称取样品1g 放入试管加生理盐水5ml 充分溶解30分钟。
5、把4放入离心机离心10分钟，4000转/分。
6、取3（Tris 缓冲液）1.6ml ，稀释纤维蛋白原0.008g ，浓度0.5%。
7、用生理盐水配制40u/ml 的凝血酶溶液。
8、从5取上清液100ul 。
9、从6取200ul 加入8充分摇匀后，吹一小气泡。
10、从7每分钟取5ul 加入9迅速摇匀后，匀速转动试管，观察反应，溶液上的小气泡随液面转动时视为反应的终点（记录好滴加凝血酶的次数）。
11、计算公式为：2211V C V C U其中C1=凝血酶的浓度C2=样品的浓度V1=滴加凝血酶的体积V2=取样的体积注：1、滴加次数超过5次还不凝固的，应按一定倍数稀释样品。
2、为了提高滴定的准确度可梯度配用不同浓度的凝血酶溶液。
3、为了提高滴定的准确度同时也可在临近凝固的下一次滴加凝血酶5u/次，改为4u/次，3u/次，2u/次，1u/次。
4、如果样品是溶液，直接取样100ul检测，检测步骤和计算方法不变。
5、如果样品是可溶性粉状物，加溶液溶解后，取溶液100ul检测，检测步骤和计算方法不变。
水蛭粉中天然水蛭素的测定方法
产品中天然水蛭素的测定方法（《中国药典》2010年版1部规定的测定方法）方法提要（凝血酶滴定法）水蛭素能与凝血酶直接结合，使凝血酶失活，其结合比例为1:1，抗凝血酶单位以ATU 表示，即每消耗一个凝血酶单位(U)相当于一个抗凝血酶单位(ATU) 。
仪器设备0.75cm×10cm小试管；微量移液器（1～500μl、1～5ml）；45 度角试管架；秒表；恒温水浴箱；分析天平，感量0.0001克；pH测试仪；普通玻璃仪器。
试剂（人）纤维蛋白原；凝血酶； 0.2 mol/L的 Tris-Hcl缓冲液（pH7.4）；0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液；0.1mol/L盐酸溶液；氯化钠；0.9％生理盐水。
溶液的配制1、Tris-HCl缓冲液（pH7.4）的配制将0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液约25 ml、0.1mol/L盐酸溶液约40ml和氯化钠0.8766g混合、溶解，调节pH值至7.4，然后加蒸馏水定容100ml(含0.15 mol 氯化钠)即成Tris-HCl缓冲溶液，备用。
2、0.5％（人）纤维蛋白原的配制用上述已配制好的Tris-HCl缓冲溶液溶解（人）纤维蛋白原，配成0.5%纤维蛋白原溶液（以凝固物计，现用现配），备用。
3、凝血酶溶液的配制用0.9％生理盐水配制成凝血酶浓度为40 U/ml的溶液（现用现配），备用。
分析步骤取1g样品粉末（过三号筛），精密称定，精密加入0.9％氯化钠溶液5ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清夜100μl置试管中，加入0.5％（人）纤维蛋白原溶液200μl、摇匀，用移液器在试管内的溶液中吹一小气泡作为观察标记（注意避免产生其它气泡），接着加入已配制好的凝血酶溶液，轻轻摇匀（3～5s，下同）、计时，然后将试管插入位于37℃恒温水浴箱的45 度角试管架中，轻轻旋转并观察气泡随液面转动情况，如气泡随液面转动即为反应终点，否则按每分钟滴加5μl凝血酶溶液至凝固（如滴加凝血酶溶液次数超过5次不凝固者应稀释样品，直至在3～5次为止）。
凝血酶活性测定法
凝血酶活性测定法取人凝血酶原复合物溶液0.2ml，加0.5%（g/ml）纤维蛋白原溶液0.2ml，在37℃放置24小时，不得有任何凝块或纤维蛋白出现。
测定时应同时做阴性及阳性对照。
阴性对照：0.2ml生理盐水加入0.5%(g/ml)纤维蛋白原溶液0.2ml，在37℃放置4小时，不得有任何凝块纤维蛋白出现。
阳性对照：取0.2ml0.5IU/ml凝血酶，加入0.5%(g/ml)纤维蛋白原溶液0.2ml，在37℃放置24小时，应有凝块或纤维蛋白出现。
注：含肝素的样品应根据肝素含量，用适量的硫酸鱼精蛋白中和样品内的肝素后再取样检查。
附录2 冻干人凝血酶原复合物效价测定法1 试剂1.1标准血浆用3.8%枸橼酸三钠作抗凝剂，按1∶10比例采集全血（1份抗凝剂+9份全血）。
4℃2000r/min离心20分钟，分离血浆。
取30份新鲜正常人血浆等量混合后，分装于小塑料管内（0.5ml/支）。
置-30℃冰箱保存备用。
从采血到血浆冻结完毕不超过4小时。
用时在37℃水浴中融化，然后置冰浴中备用，亦可制成冻干品。
1.2 基质血浆用1.34%草酸钠人和抗凝剂，按1∶10比例采集健康人血（1份草酸钠+9份全血）10℃以下2000r/min离心20分钟，分离血浆，然后按10%（W/V）加入BaSO4，在37℃水浴内搅拦吸附15分钟，10℃以下2000r/min离心30分钟，取上清分装（3ml/支）。
-30℃保存备用。
从采血到血浆冻结不超过6小时。
使用时在37℃水浴中融化，然后置冰浴中备用。
1.3 凝血活酶溶液取干兔脑粉120mg，加2ml生理盐水，加0.1ml1.34%草酸钠溶液，放入45～50℃水浴中搅拌15分钟，2000r/min离心5分钟，取上清液置冰浴中备用。
当日配制当日使用，或存放于-30℃1个月内使用。
1.40.025mol/LCaCl2溶液称2.775g无水氯化钙（分子量110.98，AR），加水溶解至1000ml。
常见凝血项目检测及临床意义ppt幻灯片课件
– FIB水平升高
• 炎性综合征，糖尿病，肥胖，血栓性相关性疾病。
15
D-Dimer
• 交联纤维蛋白的特异性降解产物(FnDPs) • 继发性纤溶特有代谢产物，反映凝血与纤溶激活的标志物。 • 生理性：抗血栓； • 降解纤维蛋白/原； • 降解凝血因子（ FV、FVIII、FX、FVII、FXI、 FXIII）； • 病理性：症和低（无）纤 维蛋白原血症；
2、获得性凝血因子缺乏：DIC、原发性纤溶亢进、 肝病阻塞性黄疸和维生素K缺乏症；
3、血循环中有抗凝物质：口服抗凝剂如肝素和抗凝 血因子抗体Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ抗体。
二、PT缩短：先天性因子Ⅴ增多症、口服避孕药、 高凝状态和血栓性疾病。
三、口服抗凝剂的检测：据报道，在口服抗凝剂过程 中，维持PT在正常对照的1-2倍最为适宜。
11
TT
• TT是一评估纤维蛋白形成过程的检测项目，TT同 样也是一用于补充PT和APTT的筛选实验。
• 原理：在预定量凝血酶作用下，正常血浆会在有 限的和稳定的时间内发生凝固。
12
TT
• TT延长表示 – FIB异常 • 质量（异常纤维蛋白原血症） • 数量： – 先天性低或无纤维蛋白原血症； – 获得性低纤维蛋白原血症（肝病，DIC）； – 存在肝素、水蛭素； – 存在FDP。
水蛭素的提取及含量测定
表 １ 氯 化钠 溶 液诱 导 结 果
１
实验 仪 器 、 料 及 试 剂 材
本 实 验 所 用 水 蛭 购 于 山东 省 济 宁 市 ， 佳 木 斯 大 学 药 学 经 院生药学教研室主任刘娟教授鉴定 。 Ｂ Ｚ ２ 自动 双 重 纯 水 蒸 馏 仪 （ 海 之 信 仪 器 有 限 公 Ｓ一 型 上 司 ） ５ Ｌ微 量 进 样 器 （ 海 安 亭 微 量 进 样 器 厂 ） １／ 微 量 ， 上 ，０ Ｌ ￣ 进样 器 （ 海 安 亭 微 量进 样 器 厂 ） 酶示 板 。 上 ， 凝 血 酶 （ 京 生 物 制 品 研 究 所 ） 纤 维 蛋 白 原 （ 海 市 生 北 ； 上 物 制 品 研 究所 ） 双 重 蒸 馏 水 （ ； 自制 ）Ｌ一精 氨 酸 （ 京 生 物 制 ； 北 品研 究 所 ） 牛 肠 系 膜 （ 木 斯 肉 联 厂 ） 氯 化 钠 （ 析 纯 ） 生 ； 佳 ； 分 ； 理 盐 水 （ 龙 江 省 肇 东 市 华 富 药业 有 限 责 任 公 司 ） 黑 。
２ 实 验 方 法
２ １ ． 诱 导 法
表２ 氯化钠＋Ｌ 精氨酸诱导结果 （ 一 Ｕ一４ ） Ｏ
本 实 验对 活 体 的诱 导 有 两 种 方 法 ， 种 用 不 同 浓 度 的氯 一
关 键 词 ： 蛭 素 ； 生诱 导 ； 血 酶 滴 定 水 仿 凝 中 图分 类 号 ； ８ 文 献 标 识 码 ： Ｒ２ ４ Ａ 文章 编 号 ： ０ ８ １ ４ ２ １ ） ４ ０ ８ —０ １ ０ —０ ０ （ ０ Ｏ ０ — ０ ７ １
水 蛭 素 是 从 水 蛭 中 提 取 的 一 种 酸 性 多 肽 ， 临 床 上 多 用 在 于 治 疗 不 稳 定 性 心 绞 痛 （ Ａ） 急 性 心 肌 梗 死 （ ） 血 管 形 ＵＳ ， ＡＭ ， 成术 ， 血液 透 析 ， 外 循 环 ， 移 植 （ Ｒ Ｔ）弥 漫性 血 管 内 凝 体 肾 Ｃ Ｒ ， 血 （Ｉ 等病症 。 Ｄ Ｃ） 天 然 水 蛭 索 的 分 离 与 纯 化 主 要 包 括 从 活 体 水 蛭 素 和 干 水 蛭 中分 离 提 取 水 蛭 素 。 统 的 水 蛭 素 的 获 得 是 对 水 蛭 的 一 传 次性 掠夺， 本 实验 采用诱 导方 法对活 体水蛭 素 的提取 ， 而 避 免 了 传 统 方 法 对 水 蛭 的 一 次 性 掠 夺 ， 护 了 水 蛭 的 野 生 资 保 源 ， 带 动 了水 蛭 养 殖 业 的 发 展 。 内 曾 报 道 了 一 种 能 利用 又 国 水 蛭 反 复 吸 血 并 用 其 嗉 囊 消 化 液 为 原 料 ， 不 杀 死 水 蛭 又 能 既 提取批量水蛭素的方法 。 水 蛭 素 的 含 量 测 定 方 法 有 多 种 ， 生 物 底 色 法 、 血 酶 如 凝 滴 定 法 、 散 射 法 、 联 免 疫 法 吸 附测 定 法 、 位 素 标 记 示踪 光 酶 同 法 等 。 实 验 采 用 凝 血 酶 滴 定 法 ，９０ Ｍａｋ ｒｔ 道 了 本 １７ 年 ｒｗａｄ 报 凝 血 酶 滴 定 法 ， 原 理 是 根据 水 蛭 素 与 凝 血 酶 结 合 比例 为 １ 其 ： １ｍｏ／ １和 １ ５ ｇ ｇ 。 血 酶 的 国 际 单 位 ＮＩ 水 蛭 素 的 （ ｌｍｏ） ： （／ ） 凝 Ｈ， 活 性 以 抗 凝 血 酶 活 力 单 位 ＡＴＵ 表 示 ， 个 ＡＵＴ 等 于 中 和 一 个 ＮＩ 凝 血 酶 的水 蛭 索 量 。 Ｈ
水蛭
水蛭现代医疗中的水蛭工作在一线受到水蛭素的启发，已经逐渐退出手术台的水蛭又重返战场。
尤其到20世纪８０年代初，随着再植技术和显微外科的发展，西医内外科都采用活体水蛭吸血法来为病人疗伤，水蛭更成了医生的得力助手。
例如在断肢再植的手术中，主动脉一旦缝合成功，血液就可流入人体组织，然后面临的即是恢复静脉机能，以便使血液能够进入循环系统，否则手指就会因淤血而肿胀，直至坏死。
以往再植手术中若出现局部瘀血、肿胀问题，都会令医生费上一番周折，还可能各种方法用尽，也很难奏效，导致手术失败。
而有了水蛭助手后，在这类手术中，医生就会把活体水蛭放在手术的伤口处，不用任何命令，它们就会全力以赴，将伤口处的污血吸得一干二净。
同时，水蛭唾液中的天然水蛭素也会大展威力，扩张血管，阻止血栓的形成，促进静脉系统的恢复，使静脉血管瞬间通畅，大大提高手术成功率。
而且不用担心由此会引发什么感染，因为它们唾液中含有的特殊防腐剂本身就能够预防伤口感染。
另外，在吸血时分泌的化学物质又能刺激伤口增加对植体的血流量，防止新肢因缺乏新鲜血液而坏死。
如果手术后伤口处仍有肿胀淤血现象，那就如法炮制，再取几只水蛭来就可以了。
1987年，中国科学院水生动物研究所水蛭课题组与湖北医学附属第三医院骨科协作，在我国首先应用医蛭治疗断指再植术后瘀血，取得了巨大成功，此后多家医院都开始引入水蛭疗法，水蛭多次出现在再植或移植手指、脚趾、耳朵、鼻子等手术中，至今已成功了无数例。
近年来，随着水蛭名气的增大，整形外科也出现了水蛭的身影。
医生们利用水蛭消除手术后血管闭塞区的瘀血，减少坏死发生，以此提高组织移植和隆胸等手术的成功率。
击败关节疼痛水蛭可以缓解疼痛，这在1500年前就被医生们发现了，只是那个时候对水蛭的应用已经到了痴迷的地步，以致于在人们觉醒之后，对水蛭的一切作用都产生了怀疑，缓解疼痛也被认为是夸大其辞，而原本就是不可能的。
但在现代医学对它重新进行研究之后，却发现，水蛭有极强的抑痛作用，这并非是古人胡乱编造。
凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤
创作编号：GB8878185555334563BT9125XW创作者：凤呜大王*凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤实验目的：凝血酶滴定法测定水蛭素活性含量实验仪器和试剂：电子天平酸度计离心机移液器45度试管架三羟甲基氨基甲烷（Tris）盐酸（Hcl）生理盐水蒸馏水凝血酶纤维蛋白原及常用玻璃仪器实验步骤：1、称取 1.21g三羟甲基氨基甲烷加蒸馏水充分溶解，定溶到50ml，浓度为0.2mol/L。
2、用移液器取429ul盐酸加蒸馏水充分溶解，定溶到50ml，浓度为0.1ml/L。
3、从1去25ml，从2取40ml混合调PH到7.4（用1或2调），加蒸馏水定溶到100ml。
4、称取样品1g放入试管加生理盐水5ml充分溶解30分钟。
5、把4放入离心机离心10分钟，4000转/分。
6、取3（Tris缓冲液）1.6ml，稀释纤维蛋白原0.008g，浓度0.5%。
7、用生理盐水配制40u/ml的凝血酶溶液。
8、从5取上清液100ul。
9、从6取200ul 加入8充分摇匀后，吹一小气泡。
10、从7每分钟取5ul 加入9迅速摇匀后，匀速转动试管，观察反应，溶液上的小气泡随液面转动时视为反应的终点（记录好滴加凝血酶的次数）。
11、计算公式为：2211V C V C U其中C 1=凝血酶的浓度C 2=样品的浓度V 1=滴加凝血酶的体积V 2=取样的体积 注：1、滴加次数超过5次还不凝固的，应按一定倍数稀释样品。
2、为了提高滴定的准确度可梯度配用不同浓度的凝血酶溶液。
3、为了提高滴定的准确度同时也可在临近凝固的下一次滴加凝血酶5u/次，改为4u/次，3u/次，2u/次，1u/次。
4、如果样品是溶液，直接取样100ul 检测，检测步骤和计算方法不变。
5、如果样品是可溶性粉状物，加溶液溶解后，取溶液100ul 检测，检测步骤和计算方法不变。
创作编号：GB8878185555334563BT9125XW创作者： 凤呜大王*。
不同炮制方法对水蛭中氨基酸及抗凝血酶活性的影响
［ 基金项 目］ 湖 南 省 属科 研 机 构 技 术 创 新发 展 专 项 资 助 （ ２ ０ １ ２ Ｔ Ｆ １ ０ ０ ５ ） 。
［ 作者简介 ］ 王雨林（ １ ９ ６ ６ 一 ） ， 男， 湖南 株 洲 人 ， 助 理 研 究员 ， 主要从事新药开发。 （ 通讯作者 ］ 谢 谊 ， 女， 助理 研 究 员 ， Ｅ — ｍ ａ ｉ ｌ ： ８ ５ ４ ２ １ ７ ８ ２ ７ ＠ｑ ｑ ． ｃ ｏ ｎ。 ｒ
ｔ ｉ ｔ ｈ ｒ ｏ ｍｂｉ ｎ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｉ ｎ Ｌｅ ｅ ｃ ｈ ｗａ ｓ ｒ ｅ ｄ ｕｃ ｅ ｄ ｂ ｙ ｈ ｉ ｇ ｈ ｔ ｅ ｍｐｅ ｒ ａ ｔ ｕ ｒ ｅ ｐ ｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ ｇ ．
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水蛭素可利用性分析
显示 ，脑 出血同时及 其后 ３ ｈ给予水蛭 素可显著降低大 鼠神经功能缺损 ，９ｈ后给予水 蛭素仍 可减轻局 部脑组 织水含量 ，表 明脑出血早期局部应用水蛭素可减轻血肿
是我国传统名贵中药材 。在提取的有效成分 中最重要
的 是 水 蛭 素 ，其 化 学 结 构 为 ６ 个 氨 基 酸 的 单 肽 ５
有效剂量低 ，１５ ／ ｇ即可完全 对抗 ＤＣ，作用 强度为 ２ ｋ ｇ Ｉ 肝素的 ２倍 以上。瘀血 、脂质代谢紊乱常见于 肾脏疾病
（ Ｗ． ０ ０ 。据报 道 ，水 蛭 素 至 少有 １ Ｍ． ７ ０ ） ０种 异 构体 ， 均具有较强 的生理活性 。从水蛭素的药理作用 、剂量及
安 全 性 、稳 定 性 方 面 ，对 水 蛭 素 的 可 利 用 性 进 行 了 分 析 ， 旨为相 关 研究 提供 参 考 。
病人 ，而水蛭素能够降低蛋 白尿 ，改善 肾功能 ，降低血
脂 ，具 有 抗 凝 、抗 血 栓 形 成 、改 变 血 液 流 变 性 、抗 炎 、 抗 增 殖 和 抗 纤 维化 等 多种 药 理 活 性 。
ｆ ｒｔ ｅ ｒ ｌ ｖ ｎ ｅ ｅ ｒ ｈ ｏ ｈ ｅ ｅ ａ ｔｒ ｓ ａ ｃ ．
Ｋｅ ｒ ｓ Ｈｉｕ ｉ Ａｎｉ ｒ ｍｂ ｎ； Ｓ ｃ ｒｔ Ａｎ ｌｓｓ ｙ ｗｏ ｄ ： ｒ ｄｎ； ｔｔ ｏ ｉ ｈ ｅ ｕ ｙ； ｉ ａｙ ｉ
１８ ８４年 Ｈ ｙｒｆ首 先 发 现 医用 水 蛭 提 取 物 中含 有 抗 ａｃａ ｔ
生物研究水蛭实验报告(3篇)
第1篇实验名称：水蛭吸血机制与抗凝血成分研究实验者：[你的姓名]学号：[你的学号]实验组号：[你的实验组号]组内编号：[你的组内编号]合作者：[合作者姓名]实验日期：[年/月/日]实验地点：[实验地点]一、前言水蛭是一种古老的环节动物，以其吸血习性而闻名。
在长期的进化过程中，水蛭发展出了一套独特的吸血机制，并产生了一系列具有抗凝血作用的生物活性物质。
本研究旨在探讨水蛭的吸血机制，并分析其抗凝血成分的活性。
二、实验目的1. 观察水蛭的吸血过程，分析其吸血机制。
2. 提取水蛭唾液中的抗凝血成分，并进行活性分析。
3. 探讨水蛭抗凝血成分在医学领域的应用前景。
三、实验材料与方法1. 实验材料- 水蛭：购自当地水蛭养殖场。
- 实验动物：小鼠。
- 实验试剂：生理盐水、抗凝血酶、凝血酶、水蛭素等。
- 实验仪器：显微镜、离心机、分光光度计等。
2. 实验方法（1）观察水蛭吸血过程：将水蛭置于装有生理盐水的培养皿中，观察其吸血行为，并记录吸血时间和吸血量。
（2）提取水蛭唾液：将水蛭置于生理盐水中，轻轻挤压其头部，收集唾液。
（3）抗凝血成分活性分析：将收集到的唾液进行离心处理，取上清液作为抗凝血成分。
（4）凝血时间测定：取一定量的抗凝血成分，加入凝血酶和生理盐水，观察凝血时间。
（5）抗凝血酶活性测定：取一定量的抗凝血成分，加入抗凝血酶和生理盐水，观察凝血时间。
四、实验结果1. 观察水蛭吸血过程：水蛭在吸血过程中，先通过头部吸附在宿主体表，然后分泌唾液，溶解血管壁，使血液流入其口腔。
吸血时间为20-30分钟，吸血量为10-20毫升。
2. 提取水蛭唾液：收集到的唾液呈淡黄色，透明，无异味。
3. 抗凝血成分活性分析：凝血时间测定结果显示，水蛭唾液中的抗凝血成分能够显著延长凝血时间，说明其具有一定的抗凝血活性。
4. 抗凝血酶活性测定：抗凝血酶活性测定结果显示，水蛭唾液中的抗凝血成分能够有效抑制抗凝血酶的活性，说明其具有一定的抗凝血酶活性。
水蛭素的提取及含量测定
水蛭素的提取及含量测定HEIL0NGJIANGMEDICINEANDPHARMACYAug.2010,V o1.33No.4?87?水蛭素的提取及含量测定田丽华,刘娟,刘利成(1.佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯154007;z.佳木斯大学生药学研究生,黑龙江佳木斯154007)关键词:水蛭素;仿生诱导;凝血酶滴定中图分类号;R284文献标识码:A文章编号:1008—0104(201O)04—0087—01水蛭素是从水蛭中提取的一种酸性多肽,在临床上多用酶的分子表面有一个富含碱性氨基酸的纤维蛋白原识别位于治疗不稳定性心绞痛(USA),急性心肌梗死(AM),血管形点(FRS).而水蛭索的C 端含有较多的酸性氨基酸,可以结成术,血液透析,体外循环,肾移植(CRRT),弥漫性血管内凝合在FRS上,阻止凝血酶与其底物血纤维蛋白原的相互作血(DIC)等病症.用,从而达到抗凝血的目的.天然水蛭索的分离与纯化主要包括从活体水蛭素和干2.2.2凝血酶滴定过程水蛭中分离提取水蛭素.传统的水蛭素的获得是对水蛭的一次性掠夺,而本实验采用诱导方法对活体水蛭素的提取,避免了传统方法对水蛭的一次性掠夺,保护了水蛭的野生资源,又带动了水蛭养殖业的发展.国内曾报道了一种能利用水蛭反复吸血并用其嗉囊消化液为原料,既不杀死水蛭又能提取批量水蛭素的方法.水蛭素的含量测定方法有多种,如生物底色法,凝血酶滴定法,光散射法,酶联免疫法吸附测定法,同位素标记示踪法等.本实验采用凝血酶滴定法,1970年Markwardt报道了凝血酶滴定法,其原理是根据水蛭素与凝血酶结合比例为1:1(mol/mo1)和1:5(g/g).凝血酶的国际单位NIH,水蛭素的活性以抗凝血酶活力单位ATU表示,一个AUT等于中和一个NIH凝血酶的水蛭索量.1实验仪器,材料及试剂本实验所用水蛭购于山东省济宁市,经佳木斯大学药学院生药学教研室主任刘娟教授鉴定.BSZ一2型自动双重纯水蒸馏仪(上海之信仪器有限公司),5L微量进样器(上海安亭微量进样器厂),10/~L微量进样器(上海安亭微量进样器厂),酶示板.凝血酶(北京生物制品研究所);纤维蛋白原(上海市生物制品研究所);双重蒸馏水(自制);L一精氨酸(北京生物制品研究所);牛肠系膜(佳木斯肉联厂);氯化钠(分析纯);生理盐水(黑龙江省肇东市华富药业有限责任公司).2实验方法2.1诱导法本实验对活体的诱导有两种方法,一种用不同浓度的氯化钠溶液组成的诱导系统,对活体水蛭进行诱导,收集水蛭唾液腺分泌物,测定水蛭素含量,比较结果.另一种是用氯化钠和L一精氨酸组成的诱导系统,对活体水蛭进行诱导,测定水蛭素含量,比较结果.2.1.1不同浓度的氯化钠溶液诱导配制浓度为0.9%的氯化钠溶液(即生理盐水),分别稀释至浓度为0.45和0.225的氯化钠溶液(即1/2生理盐水和1/4生理盐水),装入3个小试剂瓶里,用牛肠系膜封口组成诱导系统,对活体水蛭进行诱导,观察水蛭的反应,收集其唾液,分别用凝血酶滴定法进行含量测定,选择最佳诱导条件.2.1.2氯化钠加L一精氨酸诱导配制150mm的氯化钠溶液,分别装于5个小试剂瓶中,分别加人lmmol,2mmol,4mmol,6mmol的L一精氨酸,用牛肠系膜封口组成诱导系统,对活体水蛭进行诱导,观察水蛭的反应,收集其唾液,分别用凝血酶滴定法进行含量测定,选择最佳诱导条件.2.2凝血酶滴定法2.2.1凝血酶滴定法原理本实验对水蛭索的含量采用凝血酶滴定法,其原理是:凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶,在止血时起中心作用,在凝血具体方法如下:配制不同梯度(2ONIH/mL,4ONIH/mL,8ONIH/mL,100NIH/mL)的凝血酶溶液,采用逐步缩小活性范围,多次换管重滴的浓度梯度法,对水蛭索含量进行测定, 在酶示板小孔中加200p.L0.5的纤维蛋白原(0.05mol/L) Tris—HCL缓冲液(pH7.4)再加入10—1OOL水蛭素溶液,充分混均.用微量注射器吸取标准的凝血酶溶液(2ONIH单位)5L(即0.1NIH单位),若在lmin内纤维蛋白原发生凝固,即说明已经达到滴定终点.若没有发生凝固,则换取4ONIH/mL单位的凝血酶溶液进行滴定,若仍没有凝固,则逐步扩大范围直至确定活性范围.3结果表1氯化钠溶液诱导结果表2氯化钠+L一精氨酸诱导结果(U一4O)4结论通过应用仿生诱导的方法对活体水蛭进行诱导后比较发现,当诱导溶媒为不同浓度氯化钠溶液时,其最佳的提取浓度为0.9,也就是生理盐水组的提取效果较好.当诱导溶媒为氯化钠+L一精氨酸时.发现150mLNaC1加4mL一精氨酸组的效果最好,能够得到最大剂量的水蛭素.综合两种诱导溶媒发现,诱导溶媒为氯化钠+L一精氨酸的效果较好.本实验对水蛭素含量测定采用改进后的凝血酶滴定法,即逐步缩小活性范围,多次换管重滴的浓度梯度法,对水蛭分泌的唾液进行含量测定时,具有节省时间,重复性和准确度都较好的优点.(收稿日期:201O—O4—07)黑龙江省研究生创新基金科研项目,项目编号:YJSCX2OO8—063HLJ 作者简介:田丽华(196O～)女,黑龙江佳木斯人,高级实验师.。
抗凝血酶效价测定法综合考察水蛭的提取工艺_胡瑞标
表 1 提取溶剂选择结果（ n = 3，x珋± s ）
提取溶剂
提取物的抗凝血活性（ U /g）
浸膏得率（ % ）
50% 乙醇 60% 乙醇 70% 乙醇
蒸馏水 生理盐水
182． 21 ± 1． 25 203． 37 ± 1． 65 229． 42 ± 1． 84 280． 29 ± 1． 76 270． 26 ± 1． 68
参考《中国药典》2010 版水蛭含量测定项下操作。取 相当于 1g 水蛭药材的浸膏，精密称定，精密加入 0． 9% 氯 化钠溶液 5mL，充分搅拌，浸提 30min，并时时振摇，离心， 取上清液 250μL 置 1mL 容量瓶，加 0． 9% 氯化钠溶液稀释 至刻度，摇 匀，静 置。取 稀 释 液 100μL，置 试 管 中，加 入 0． 5% （ 牛） 纤维蛋白原（ 以凝固物计） 的三羟甲基氨基甲烷 盐酸缓冲液（ 临用配制，0． 2mol / L 三羟甲基氨基甲烷 25mL 与 0． 1mol / L 盐酸溶液约 40mL，加水至 100mL，调节 pH 值 至 7． 4） 200μL，摇匀，置水浴（ 37 ± 0． 5） ℃ 温浸 5min，缓缓 滴加每 1mL 中含 10 单位的凝血酶溶液（ 每 4min 滴加 1 次， 每次 2μL，边滴加边轻轻摇匀） 至凝固，记录消耗的凝血酶 溶液的体积，计算其抗凝血活性成分。计算方法如下。
Comprehensive Study on the Extraction of Hirudo by Determinating the Antithrombase Activity
15898430_重组水蛭素的原核表达及分离纯化
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收 稿 日 期 0&%/!&(!&( 基 金 项 目 国 家 1(* 重 点 项 目 课 题 0&%*KK%&02&)广 西 科 技 开 发 项 目 桂 科 攻 %2J1&%*!0 作 者 简 介 黄 孔 威 %JJ)!男 福 建 邵 武 人 硕 士 研 究 方 向 分 子 生 物 学 B!3D$E1J*J(1J/J!NN',#3 通 信 作 者 刘 庆 友 %J/(!男 山 东 巨 野 人 博 士 研 究 员 研 究 方 向 转 基 因 动 物 B!3D$ENOE$P0&&0!%0(',#3
水蛭入药历史 悠 久!早 在 中 国 的 东 汉 及 西 方 的 培养基购自北京陆 桥 技 术 有 限 责 任 公 司(限 制 性 核
古希腊时期就有其入药的记载'水蛭中起治疗功效 酸内切酶 E5;#和 F";#&6)@QK 连接酶&胶回收
的主要成分为水蛭 素"H$>P"$-#!它 由 医 用 水 蛭 唾 液 试剂盒 均 购 自 A38:D公 司(V?D$-!;>88试 剂 盒 购 自
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海南水蛭中水蛭素的抗凝活性研究
海南水蛭中水蛭素的抗凝活性研究刘腾;符乃光;李泽友【摘要】Objective To analyze the species of Hainan leeches and the anticoagulant activity of hirudin. Methods The morphological characteristics and thin-layer chromatogram of Hainan leech were observed. Then anti-coagulant activity was measured with the method of thrombin titration. Results Hainan leeches were Hirudinaria ma-nillensis. The anticoagulant activity of Hainan Leech hirudin was 1 174.8 U/g of whole body, 6 521.7 U/g of the head and 308.6 U/g of the body. Conclusion Hainan leeches have very good anticoagulant activity, which deserve further research and development.%目的：分析海南水蛭的品种及其中水蛭素的抗凝作用。
方法观察海南水蛭的形态特征、薄层色谱图，并采用凝血酶滴定法测定其抗凝活性。
结果海南水蛭为菲牛蛭，水蛭素的抗凝活性分别为：全身1174.8 U/g、头部6521.7 U/g、身体308.6 U/g。
结论海南水蛭具有很好的抗凝血活性，值得进一步研究开发。
【期刊名称】《海南医学》【年(卷),期】2015(000)016【总页数】3页(P2345-2346,2347)【关键词】海南水蛭;水蛭素;薄层色谱;凝血酶【作者】刘腾;符乃光;李泽友【作者单位】海南医学院药学院，海南海口 571199;海南医学院药学院，海南海口 571199;海南医学院药学院，海南海口 571199【正文语种】中文【中图分类】R282.74中药水蛭具有抗凝血、抗肿瘤、提高免疫力、降血脂等多种药理活性，临床上用于治疗多种疾病[1]。
纤维蛋白原_凝血酶时间法用于水蛭质量控制方法的研究_苏斌
现行的水蛭质量控制标准为凝血酶滴定法［1］， 该方法需人为地判断滴定终点，但不同实验人员对 凝固终点的判断标准不同，存在较大误差，同时在滴 定的过程中，每滴加 1 滴凝血酶，就需要震摇 1 次， 前期形成的纤维蛋白原被破坏，导致滴加过量的凝 血酶才能凝固，特别是对于日本医蛭，凝血酶的滴加 量会达到原反应体系体积的一半，改变了反应体系， 导致测定结果不准确，重复性差，因此现行的水蛭质 量控制方 法 准 确 度 和 客 观 性 存 在 不 足，需 要 进 行 改进。
Ｒesearch on the method of fibrinogen － thrombin time by coagulometer for quality control oNG Zhi － bin2* ，GUO Yu － dong2 ，SONG Cheng － cheng1 ， HU Yu － chi，WANG Bi － song，JIN Jia － jin1
（ 1． School of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China； 2． Beijing Institute for Drug Control，Beijing 100035，China）
2010 年版中国药典（ ChP 2010） 规定水蛭（ Hirudo） 的来源为蚂蟥（ Whitmania pigra Whitman） 、水蛭 （ Hirudo nipponica Whitman，该基源又称为日本医蛭） 和柳叶蚂蟥（ Whitmania acranulata Whitman） ，具有破 血、逐瘀、通经的功效［2］，临床上用于治疗血瘀证，现 代药理学研究表明，水蛭有较强的抗凝血、抗血栓作 用，能延长活化部分凝血酶时间（ APTT） 、凝血酶时间 （ TT） 和抑制血小板聚集等作用［3 －4］。本实验建立了 水蛭标准品和 Fibg － TT 法反应体系，以水蛭作为标 准品测定供试品的效价，并对该方法进行了实验室内 的方法学考察，结果发现，该方法重复性、准确度、中 间精密度和方法适用性均较好，效价测定结果可靠， 可用于考察不同批次水蛭的效价，为水蛭质量控制提 供依据。 1 仪器及材料 1. 1 实验仪器 ACLELTTE PＲO 全自动血凝分析 仪（ Instrumentation Laboratory Company） ，DT5 － 1 离 心机（ 北京时代北利离心机有限公司） ，pH 测试仪 （ Mettler Toledo） ，BS224S 赛多利斯天平（ 塞多利斯 科学仪器北京有限公司） 等。 1. 2 材 料 纤 维 蛋 白 原 （ 牛 血） （ 批 号 140626 － 201009） 和凝血酶（ 批号 140625 － 201310） ，购自中 国食 品 药 品 检 定 研 究 院； 0. 9% 生 理 盐 水 （ 批 号 120412403） ，石家庄四药有限公司； 三羟甲基氨基甲 烷（ 批号 20111020） ，国药集团化学试剂有限公司； 浓盐酸（ 批号 20120210） ，北京现代东方精细化学品 有限公司； 脉血康胶囊 （ 批号 20120502、20120403、 20120404） ，贵 州 信 邦 制 药 有 限 公 司； 水 蛭 （ 批 号
BAEE法测定重组水蛭素的生物活性
BAEE法测定重组水蛭素的生物活性
胡醒;吴海燕;盛甜;刘军;相秉仁
【期刊名称】《中国生化药物杂志》
【年(卷),期】2008(029)004
【摘要】目的建立重组水蛭素的生物活性测定方法. 方法用BAEE(N.苯甲酰-L-精氨酸乙酯)作底物,通过测定反应体系中未被水蛭素抑制的凝血酶的量,来间接测定水蛭素抗凝血酶的活力. 结果重组水蛭素的生物活性测定曲线在3.2～12.8 ATU之间线性关系良好,回归方程为Y=-0.034 8 X+0.7,r=0.999 3. 结论 BAEE法经济、便捷、准确可靠、重现性好,适宜作为该品种的生物活性测定方法.
【总页数】3页(P265-267)
【作者】胡醒;吴海燕;盛甜;刘军;相秉仁
【作者单位】中国药科大学分析测试中心,江苏,南京,210009;常州千红生化制药有限公司,江苏,常州,213022;常州千红生化制药有限公司,江苏,常州,213022;常州千红生化制药有限公司,江苏,常州,213022;中国药科大学分析测试中心,江苏,南
京,210009
【正文语种】中文
【中图分类】R392
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凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤
凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤
实验目的：凝血酶滴定法测定水蛭素活性含量
实验仪器和试剂：电子天平酸度计离心机移液器 45度试管架
三羟甲基氨基甲烷（Tris）盐酸（Hcl）生理盐水蒸馏水凝血酶纤维蛋白原及常用玻璃仪器
实验步骤：
1、称取1.21g三羟甲基氨基甲烷加蒸馏水充分溶解，定溶到50ml，浓度为0.2mol/L。
2、用移液器取429ul盐酸加蒸馏水充分溶解，定溶到50ml，浓度为0.1ml/L。
3、从1去25ml，从2取40ml混合调PH到7.4（用1或2调），加蒸馏水定溶到100ml。
4、称取样品1g放入试管加生理盐水5ml充分溶解30分钟。
5、把4放入离心机离心10分钟，4000转/分。
6、取3（Tris缓冲液）1.6ml，稀释纤维蛋白原0.008g，浓度
0.5%。
7、用生理盐水配制40u/ml的凝血酶溶液。
8、从5取上清液100ul。
9、从6取200ul加入8充分摇匀后，吹一小气泡。
10、从7每分钟取5ul加入9迅速摇匀后，匀速转动试管，观察反应，溶液上的小气泡随液面转动时视为反应的终点（记录好滴加凝血酶的次数）。
11、计算公式为：2
211V C V C U
其中
C 1=凝血酶的浓度
C 2=样品的浓度 V 1=滴加凝血酶的体积
V 2=取样的体积
注：
1、滴加次数超过5次还不凝固的，应按一定倍数稀释样品。
2、为了提高滴定的准确度可梯度配用不同浓度的凝血酶溶液。
3、为了提高滴定的准确度同时也可在临近凝固的下一次滴加凝血酶5u/次，改为4u/次，3u/次，2u/次，1u/次。
4、如果样品是溶液，直接取样100ul 检测，检测步骤和计算方法不变。
5、如果样品是可溶性粉状物，加溶液溶解后，取溶液100ul 检测，检测步骤和计算方法不变。