实验九甲醛滴定法测定氨基酸
氨基氮含量的测定—甲醛滴定法
氨基氮含量的测定—甲醛滴定法中性甲醛制备：量取200ml甲醛溶液至400ml烧杯中，用磁力搅拌器搅拌，边搅边用0.1mol/LNaOH溶液滴定至pH8.1。
取样品处理液1.0mL置于200mL烧杯中，加64mL去CO2水，开动磁力搅拌器，用0.1mol／L氢氧化钠标准溶液滴定至pH8.2；加入20.0mL中性甲醛溶液，摇匀。
再用0.1mol／L氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积V l；取65ml水先用0.1mol／L氢氧化钠溶液调至pH 8.2，再加入20.0mL中性甲醛溶液，用0.1mol／L氢氧化钠标准溶液滴定至pH 9.2，作为试剂空白试验。
按照下列公式计算：氨基酸态氮(g／L) =(V1-V0)×C×1.4/V式中：V1——测定样品加入甲醛后消耗0.1mol／L Na0H溶液的体积(m1)；V o——测定空白加入甲醛后消耗Na0H标准溶液的体积(m1)；C——标定的氢氧化钠标准溶液物质的量浓度[C(NaOH)](mol／L)；V——样品体积(m1)；0.014——C(NaOH)=lmol／L氢氧化钠标准溶液lmL相当的氮克数。
方法来自：赵新淮，冯志彪。
蛋白质水解物水解度的测定。
食品科学，1994,11公式来自：徐鑫，何佳易。
小黄鱼抗氧化肽制备条件的响应面优化。
食品科学，2011,32（21）：165—170。
标准NaOH溶液的配制：称取110克氢氧化钠，溶于100毫升去二氧化碳的水中，置于300毫升锥形瓶中，不时振荡，溶解后用橡皮塞塞紧并静置数日直到碳酸钠全部沉到底部时，倾出上面清澈液备用。
取以上氢氧化钠浓溶液5.5毫升，加水至1000毫升，混匀，制成0.1mol/l氢氧化钠溶液。
标准氢氧化钠浓溶液的标定：准确称取水解度=游离氨基酸/总氮×100﹪。
关于氨基酸的定量分析
• 再在冰浴中冷却3 min 以上,加碘化钾5mL , 立即用硫代硫酸钠标准滴定溶液滴定至淡 黄色,加入淀粉溶液2 mL ,继续滴定至蓝色 消失为终点,同时做空白试验。
x(v1 v2)c0.02403100 m 25 100
有吸收的衍生试剂。该方法的基本原理是 经阳离子交换柱分离出的氨基酸与茚三酮 混合,经加热反应后,一级胺与之生成蓝紫 色化合物,二级胺与之生成黄色化合物。两 种衍生物使用双通道紫外检测器同步检测, 检测波长分别为570nm 和436nm。
C OH
C
C
OH
O
茚三酮
O
C OH
C
C
OH
O
COOH
H 3N
C
关于氨基酸的定量分析
氨基酸的分析方法
化学分析法——甲醛滴定法 甲醛滴定法用于氨基氮的
测定, 可以测出样品中总氨基酸 的含量,其原理是在中性或弱碱 性水溶液中,氨基酸的α—氨基与醛类反应生成
Schiff碱:α—氨基酸与甲醛反应生成亚 甲基亚氨基衍生物
H
R C C O O
N H 3
H C H O
O H
H
பைடு நூலகம்
R
O
C OH
C
C
H
NH3
CO2
O
O
C OH C
C OH
O
O C
C C O
O
C
NC
H
C
O
紫色化合物
RCHO
H
O C
CN C O
亮黄色化合物
8第六章 氨基酸定量测定
1.原理： 强离子交换树脂－二乙烯苯树脂： 交联度大，8-12％。 树脂的结构紧密，孔隙度小，适用于分子较小的氨 基酸的分离。选用Na型的树脂。
吸附：一般在pH2.2溶解样品，由于pH比较低，氨 基酸的H＋解离被抑制，氨基酸带正电荷，可以与阳 离子交换树脂发生交换。
样品 液
分离 柱
M
Na+
pK1
COOCH2(CH2)4+NH3
+NH 3
pK2 9.0
COO CH2(CH2)4+NH3 NNH2 NH2
赖氨酸的等当电＝（ pK1＋pK2）/ 2 = 9.75
洗脱：当pH2.2，3.3，4.9等缓冲液相继流经树脂时， 随着pH逐渐升高，氨基酸失去正电荷，与树脂结合 减弱，从树脂上脱落下来。由于氨基酸的氨基不同， 因此与柱子的结合能力不同。 酸性氨基酸带的正电荷少，等电点比较低，碱性氨 基酸带的正电荷多，被置换下来的pH比较高。
吹数分钟(或置于70～80℃烘
箱中烘干)即可观察到紫红色
的氨基酸斑点，脯氨酸例外，
为黄色斑点。
用铅笔圈出氨基酸斑点，量出溶剂前沿的距离及 各斑点中心与起点之间的距离，并计算各氨基酸 的Rf值。
原点到层析点中心的距离
Rf＝ 原点到溶剂前沿的距离
标准氨基酸薄层层析色谱
氨基酸的性质与Rf之间的关系
层析的分离是基于氨基酸的非极性性质。 物质的极性越小（即非极性越大）,在有机溶剂中分 配就越多，迁移率Rf就越大；
混合样
加样
洗脱剂
分离结果
影响电离的基团：氨基、羧基、胍基、咪唑基、酚基。
洗脱顺序： 酸性氨基酸，中性氨基酸，芳香族氨基 酸，碱性氨基酸 日立832型氨基酸分析仪的洗脱顺序： 天门冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙，半胱，缬，蛋， 异亮，亮，酪，苯丙，赖，氨，组，精
甲醛滴定法测定溶液中的氨基酸含量
甲醛滴定法测定氨基酸含量一、目的掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点二、原理水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。
甲醛可与氨基酸上的—N+H3结合，形成—NH—CH2OH、—N(CH2—OH)2等羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定N+H3放出H+，测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。
若样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法滴定的结果算出氨基酸的含量。
若样品中含有多种氨基酸（如蛋白质水解液），测不能由此法算出氨基酸的含量。
脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不稳定，导致滴定后结果偏低；酪氨酸含酚基结构，导致滴定结果偏高。
三、材料、试剂与器具（一）试剂1、1%酚酞酒精溶液称1g酚酞溶于100ml 95%酒精中。
2、%溴麝香草酚蓝溶液取溴麝香草酚蓝溶于100ml 20%乙醇溶液中。
3、氨基酸溶液4、标准L 氢氧化钠溶液5、中性甲醛溶液取甲醛溶液50ml，加1%酚酞指示剂2滴，滴加L NaOH溶液，使溶液呈微粉红色，临用前中和。
（二）实验器具1、锥形瓶2、碱式滴定管3、移液管洗耳球4、天平5、容量瓶6、试剂瓶7、量筒8、玻棒与烧杯四、操作步骤1、取3只50ml锥形瓶，按下表加入试剂。
2、混匀后用标准L氢氧化钠溶液滴定至紫色（~）3、结果计算氨基酸溶液中含氨基酸的百分比浓度为C=（V1-V2）×C0×氨基酸分子量/（10×V样）式中：C：总酸含量（g/100ml）V1为滴定样品消耗标准氢氧化钠的体积（ml）；V2为滴空白消耗氢氧化钠的体积（ml）；C0：标准氢氧化钠准确浓度(mol/L)V样：样品体积(ml)4 、氢氧化钠标准溶液的标定五、注意事项（1）利用甲醛滴淀法可以用来测定蛋白质的水解程度。
随着蛋白质水解度的增加，滴定值也增加，当蛋白质水解完成后，滴定值不再增加。
（2）氨与甲醛反应方程①铵根与甲醛反应生成六次甲基四胺盐及强酸：（氨的部分电离产生少量铵根，但由第二个反应大量消耗铵根后，氨电离方程就强烈地偏向右边了）②反应生成的六次甲基四胺盐及3个氢离子都可以跟碱反应，而溶液中正好有还未反应的氨水，因而第二个反应，中和反应发生(CH2)6N4H+ + NH3 = (CH2)6N4 + NH4+H++NH3=NH4+这第二组反应就是一个释放出中和热的过程，所以溶液就热起来。
氨基酸分析的检测方法评述
文章编号:1004-7964(2004)03-0039-05收稿日期:2003-11-05基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)经费资助,课题编号:2001AA647020四川大学青年基金,课题编号:H2002[9-057]第一作者简介:戴红,女,1966年出生,副教授。
主要研究方向:分析检验。
氨基酸分析的检测方法评述戴红,张宗才,张新申(皮革化学与工程教育部重点实验室(四川大学),四川成都610065)摘 要:对氨基酸分析常用的化学方法、电化学方法、分光光度法(包括可见光分光光度法,紫外光分光光度法和荧光分光光度法)等检测方法进行综述,以期为提高氨基酸分析的灵敏度、准确性,为快速、高效的氨基酸分析方法的建立提供参考。
关键词:氨基酸;检测;分析中图分类号:Q517;Q503 文献标识码:ADetermination M ethods of Amino A cids A nalysisDA I Hong ,ZHA N G Zong 2cai ,ZHA N G Xi n 2shen (Key L aboratory of L eather Chemist ry and Engi neeri ng(S ichuan U niversity ),M i nist ry of Education ,Chengdu 610065,Chi na )Abstract :Determination methods for amino acids ,including chemistry determination ,elec 2tric 2chemistry determination ,spectrophotometer determination and conductivity detection method were reviewed for the sake of improving the analysis sensitivity and accuracy.The paper aimed at providing useful reference to building a fast and effective amino acids aualytic methods.K ey w ords :amino acid ;analysis ;determination 氨基酸是蛋白质的基本结构单位和生物代谢过程中的重要物质,氨基酸分析技术对蛋白质化学、生物化学和整个生命科学研究以及产品开发、质量控制和生产管理等具有重要意义,广泛地应用于化工、轻工、食品加工、医药卫生行业的医药、食品、保健品等的分析,并且用于皮革化学鞣革机理的研究中[1,2,3]。
甲醛滴定法测定溶液中的氨基酸含量.docx
甲醛滴定法测定氨基酸含量一、目的掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点二、原理水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。
甲醛可与氨基酸上的一N%3结合，形成一NH —CH Q OH、一N （CH2—0H）2等羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定N+H3放出H+,测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。
若样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法滴定的结果算出氨基酸的含量。
若样品中含有多种氨基酸（如蛋白质水解液），测不能由此法算出氨基酸的含量。
脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不稳定，导致滴定后结果偏低；酪氨酸含酚基结构，导致滴定结果偏高。
三、材料、试剂与器具（一）试剂1、1%酚酞酒精溶液称Ig酚酞溶于IOOmI 95%酒精中。
2、0.5%溴麝香草酚蓝溶液取0.5溴麝香草酚蓝溶于100ml 20%乙醇溶液中。
3、氨基酸溶液4、标准0.100mol∕L氢氧化钠溶液5、中性甲醛溶液取甲醛溶液50ml ,加1%酚酞指示剂2滴，滴加0.1mol∕L NaoH 溶液，使溶液呈微粉红色，临用前中和 （二）实验器具 1、锥形瓶 3、移液管洗耳球 5、容量瓶 7、量筒 四、操作步骤1、取3只50ml 锥形瓶，按下表加入试剂(pH8.7~9.0)2、碱式滴定管 4、天平 6、试剂瓶 8玻棒与烧杯3、结果计算氨基酸溶液中含氨基酸的百分比浓度为式中：C=（V1-V2）× C0×氨基酸分子量/（10× V样）C:总酸含量（g∕100ml）V i为滴定样品消耗标准氢氧化钠的体积（ml）; V2为滴空白消耗氢氧化钠的体积（ml）；C o :标准氢氧化钠准确浓度（mol∕L）V样：样品体积（ml）4、氢氧化钠标准溶液的标定4 1 κm标准is定落液4.1.1配制⅛⅛ no g⅛S'⅛钠需于IOQmL无二敦化晞⅛水中滞匀琏人聚乙烯容界中•密闭放置至溶液清氐按表1倾定佣酬管量取上翩孰用无二輸斛水解至IQ伽L,齣.表1标定按表2的规定称取于105Γ-110t电烘箱中十煥至国重的工作基准试剂命苯二屮酸爼銅厠无二水溶絹加2⅛≡ao示椒10 XLh用吃制⅛τ⅛s¾⅛⅛溶發滴定至酒液呈粉虹色供保痔30S4同时做零白试蜃。
氨基酸态氮测定甲醛值法
V2——试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升（ml）
V3——试样稀释液取用量，单位为毫升（ml）
C——氢氧化钠标准溶液的Байду номын сангаас度，单位为莫尔每升（mol/l）
0.014——与1.00ml氢氧化钠标准溶液[C（NaOH）=1.000mol/l]相当的氮的质量，单位为克（g）
计算结果保留两位有效数字。
6精密度
在重复性条件下获得得到两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
吸取10.0ml，置于200ml烧杯中，加60ml水，开动磁力搅拌器，用氢氧化钠标准溶液[C（NaOH）=0.050mol/l]滴定至酸度计指示pH8.2，记下消耗氢氧化钠标准溶液的毫升数，可计算总酸含量。
加入10.0ml甲醛溶液，混匀。再用氢氧化钠标准滴定溶液继续滴定至PH9.2，记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。
氨基酸态氮测定甲醛值法
1原理
利用氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定后定量，以酸度计测定终点。
2试剂
甲醛（36%）：应不含聚合物、氢氧化钠标准溶液[C（NaOH）=0.050mol/l]
3仪器
酸度计、磁力搅拌器、10ml微量滴定管
4分析步骤
称取约5.0g已研磨均匀的试样置于100ml烧杯中，加入蒸馏水50ml充分搅拌（必要时加热），移入100ml容量瓶中，用少量水分次洗涤烧杯，洗液并入容量瓶中，并加水至刻度，混匀。
同时取80ml水，先用氢氧化钠标准溶液调节至PH为8.2，在加入10.0ml甲醛溶液，用氢氧化钠标准溶液滴定至PH9.2，同时做试剂空白试验。
氨基酸的定量测定
试剂：40%中性甲醛溶液（以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠溶液将 40%甲醛中和至淡蓝色）
1g/L百里酚酞乙醇溶液 1g/L中性红50%乙醇溶液 0.1mol/L氢氧化钠标准溶液
说明： ①本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定 ②浑浊和色深样液可不经处理而直接测定
3、茚三酮比色法
原理：氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨 酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。 该蓝紫色化合物的颜色深浅 与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为750nm，故据此可以测定样品中 氨基酸含量。
仪器：可见分光光度计
试剂： ①20g/L茚三酮溶液 ②pH8.04磷酸盐缓冲溶液 ③氨基酸标准溶液（200μg/mL）
3、茚三酮比色法
操作方法： ①标准曲线绘制：准确吸取200μg/mL的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、 1.5、2.0、2.5、3.0mL（相当于0、100、200、300、400、500、600μg氨 基酸），分别置于25mL容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为4.0mL，然 后加入茚三酮和磷酸盐缓冲溶液各1mL，混合均匀，于水浴上加热15min， 取出迅速冷却至室温，加水至标线，摇匀。静置15min后，在570nm波长下， 以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克数为横坐 标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。
氨基酸的定量测定
一、氨基酸的一般定量测定
1、甲醛滴定法 2、电位滴定法 3、茚三酮比色法 4、非水溶液滴定法 5、邻苯二甲醛法 6、三硝基苯磺酸法 7、乙酰丙酮法
甲醛滴定法测定氨基氮
氨基氮的测定-甲醛滴定法原理:氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：－NH3是弱酸，完全解离时PH为11－12或更高，若用碱滴定－NH3所释放的H＋来测定氨基酸，一般指示剂变色域小于10，很难准确指示滴定终点。
常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右移，促使－NH3释放H＋，使溶液的酸度增加，滴定中和终点移至酚酞的变色域内（PH9.0左右）。
因此可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。
如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。
如样品为多种氨基酸的混合物如蛋白质水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。
但此法简便快速，常用来测定蛋白质的水解程度，随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时，表明水解作用已完全。
操作步骤：1.称取105℃干燥至恒重的硫酸铵（132.14）（分析纯）2.317置于50mL容量瓶中用水溶解并稀释至刻度。
2.摇匀分别吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL于六个250mL的三角瓶中，三角瓶中提前分别加水50mL，加甲基红指示剂2滴，用0.1moL/L的氢氧化钠调至中性。
再加18%的中性甲醛（加两滴酚酞用氢氧化钠调至淡粉色），放置10分钟，再加入两滴酚酞指示剂。
3.用0.1N的氢氧化钠滴定至出现橘红色为终点，记录氢氧化钠的消耗量。
CV×0.014W ×100%C:0.1N氢氧化钠滴定液浓度(mol/L)。
V:消耗氢氧化钠滴定液体积(mL)。
W:称取硫酸铵重量(g)。
4.以含氮量为横坐标，以氢氧化钠消耗体积为纵坐标做曲线,并计算回归方程及相关系数r，r在0.9990-1.0010间试剂配制：1）18%甲醛：市售甲醛为36%--37%，甲醛：蒸馏水=1:12) 甲基红指示剂：（0.1%）取甲基红0.1克，加无水乙醇100mL溶解即得.3)1%酚酞指示剂：取酚酞1克加无水乙醇100mL溶解即得4)0.1N的盐酸滴定液：取浓盐酸9mL加水适量定容至1L。
氨基酸总量测定方法
氨基酸总量测定方法咱今儿就来讲讲氨基酸总量测定方法，这可是个很有意思的事儿呢！你想想啊，氨基酸就像是我们身体里的小宝贝，它们的数量和状态对我们可重要啦！要说测定氨基酸总量，那方法可不少呢。
就好像我们要去一个地方，有好多条路可以走。
比如说茚三酮比色法，这就像是走一条大家都比较熟悉的大道，可靠又实用。
把样品和茚三酮试剂一混合，经过一系列反应，就能通过颜色的变化来大致知道氨基酸的量啦。
这多神奇呀！还有甲醛滴定法，这就好比是找到了一个特别的窍门。
利用甲醛和氨基酸的反应，然后通过滴定来确定数量。
是不是感觉很有意思呢？就像解开一个小小的谜题。
再说说电位滴定法吧，这就像是有个特别精准的仪器在帮我们把关，能非常准确地测量出氨基酸的量呢。
那我们在实际操作的时候可得注意一些小细节哦！就像做饭要掌握好火候一样，不能马虎。
比如试剂的选择，一定要挑质量好的呀，不然怎么能得出准确的结果呢？还有操作步骤，一步都不能错哦，不然就像走在路上迷路了一样。
你说，要是我们不认真对待这些方法，那不是就像闭着眼睛走路吗？能走到目的地才怪呢！所以呀，我们得好好琢磨这些方法，就像对待宝贝一样。
在测定的过程中，每一个环节都很关键呢。
从样品的处理到最后的数据分析，都需要我们细心再细心。
这可不是闹着玩的事儿呀！而且呀，不同的样品可能需要不同的方法来测定氨基酸总量呢。
这就好像不同的人穿不同的衣服才合适一样。
你总不能给一个大人穿小孩的衣服吧？总之呢，氨基酸总量测定方法是个很有学问的事儿，我们可得好好研究研究。
只有这样，我们才能真正了解氨基酸的奥秘，才能更好地为我们的健康服务呀！这可不是开玩笑的哦！。
氨基酸的定量测定解读
1、甲醛滴定法 操作方法：吸取含氨基酸20~30mg的样品溶液2份，分别置于 250mL锥形瓶中，各加50mL蒸馏水，其中一份加入3滴中性红 指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红色变为琥 珀色为终点；另一份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20mL， 摇匀，静置1min，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝 色为终点。分别记录两次所消耗的氢氧化钠标准溶液体积。
②样品测定：吸取澄清的样品溶液1～4mL，按标准曲线制作步骤，在相同 条件下测定吸光度A值，测得的A值在标准曲线上可查得对应的氨基酸质量。
3、茚三酮比色法
结果计算：
m 100 氨基酸含量= （mg/100g） m1 1000
式中：m——从标准曲线上查得的氨基酸的含量，μg m1——测定的样品溶液相当于样品的质量，g
氨基酸的定量测定
一、氨基酸的一般定量测定
1、甲醛滴定法 2、电位滴定法 3、茚三酮比色法 4、非水溶液滴定法 5、邻苯二甲醛法 6、三硝基苯磺酸法 7、乙酰丙酮法
二、个别氨基酸的定量测定
1、赖氨酸的测定 2、色氨酸的测定 3、苯丙氨酸的测定 4、酪氨酸的测定 5、脯氨酸的测定 6、羟脯氨酸的测定 7、胱氨酸的测定 8、谷氨酸的测定
3、茚三酮比色法
注意事项： ①通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎样品5～10g或吸取样液 样品5～10mL置于烧杯中，加入50mL蒸馏水和5g左右活性炭，加热煮沸， 过滤，用30～40mL热水洗涤活性炭，收集滤液于100mL容量瓶中，加水 至标线，摇匀备测。 ②茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红 色，使用前须进行纯化，方法如下： 取10g茚三酮溶于40mL热水中，加入1g活性炭，摇动1分钟，静置30 分钟，过滤，将滤液放入冰箱中过夜，即出现蓝色结晶，过滤，用2mL 冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，装瓶备用。
实验二_氨基酸的甲醛滴定报告
• 4、为什么计算氨基酸含量可只计算氨基氮？
• 值 日
• 实验报告
H
C
N（CH2OH）2
COO-
COO-
三、试剂
• 1、中性甲醛 • 2、0.5%酚酞乙醇溶液 • 3、标准的氢氧化钠液
• 4、0.01N Gly液
• 5、未知浓度的Gly液
四、主要的器材
如何正确使用滴形瓶3 个，编号，向第 1、2号两瓶内各加入2 毫升0.01N标准甘氨酸溶 液及1-2滴酚酞指示剂。向第3号瓶内加入2毫升蒸馏水及1-2滴指示剂作为对照 混匀后，用0.01N标准氢氧化钠溶液滴定第1号瓶内的溶液至微红色，并保留作 为掌握滴定终点的颜色标准。向第2、3号瓶内加入4毫升中性甲醛溶液混匀， 分别用0.01N标准氢氧化钠溶液将它们滴定至第1号瓶颜色，将每个编号都重复 操作2次，并求出甘氨酸氨基氮的平均回收率。
•
编号
1 2ml
2 2ml
3 /
试剂
0.01M Gly液
蒸馏水
酚酞 0.01N NaOH液 中性甲醛
/
2滴 微红（作参照） /
/
2滴 / 4ml
2ml
2滴 / 4ml
0.01N NaOH液
/
滴定（计数）
滴定（计数）
甘氨酸氨基氮回收率=
实际测出量 100 加入理论量
2．取未知浓度的甘氨酸溶液2毫升，按照上述方法进行测 定平行做2份，并计算出每毫升该种甘氨酸溶液中含有氨基 氮的平均毫克数。
氨基氮(毫克/毫升)=（V2-V3)*0.14008/2
注意事项
• 1、滴定管的清洁与检查 • 2、尽量要求数据准确 • 3、参比颜色
思考题与实验报告
• 1、甲醛滴定时，加入的氢氧化钠溶液滴定的是氨基酸的氨基或羧 基？为什么？
甲醛滴定法测定食品中的氨基酸酸含量
食品中氨基酸含量的测定————甲醛滴定法一、原理氨基酸是具有氨基和羧基的氨基酸，在溶液中以两性离子形态存在，当向溶液中加入碱时，氨基上的氢离子解离出来与羟基结合生成水。
使溶液ph不会急剧上升，但当氨基上的氢离子全部解离时则溶液的pH急剧上升，氨基上氢离子的解离常数值通常在9以上，滴定终点pH在12以上，没有适当的指示剂，为此，可用甲醛与氨基酸作用，氨基上的两个氢原子被甲醛取代生成氨基酸的二羟甲基衍生物。
由于氨基上的氢被取代，氨基上氢离子的解离常数降至7左右，滴定终点pH在9左右，这样就可以用酚酞做指示剂，用氢氧化钠标准溶液滴定氨基上的氢离子。
此法滴定的是α-氨基的含量，准确度仅达氨基酸理论含量的90%。
二、材料仪器与试剂1、材料：白豆油或浅色饮料，色深样品需进行脱色处理2、仪器：锥形瓶、滴定管、10ml量筒和移液管，20ml量筒或移液管，100ml 容量瓶。
3、试剂：中性甲醛，酚酞指示剂（0.5%）（0.5克酚酞定容100毫升），0.01N 氢氧化钠溶液。
三、操作步骤1、制样：根据样品颜色及氨基酸含量将样品进行适当稀释，一般吸取20ml样品，稀释定容到100m l。
色泽深的样品先加入50ml水和活性炭5g，加热煮沸，过滤，用30ml水洗涤活性炭，洗涤水与滤液合并，然后转移至100ml容量瓶中定容至刻度。
固体样品需粉碎后称取5~10g，加50ml水和活性炭5g，加热煮沸，过滤，用30ml水洗涤活性炭，洗涤水与滤液合并，然后转移至100ml容量瓶中定容至刻度。
2、测定：准确吸取已稀释的样品溶液10ml于三角瓶中，加入10ml中性甲醛，滴加2~3滴酚酞指示剂，用0.01mol/L氢氧化钠溶液滴定至溶液呈微红，30秒不褪色（8.2～10.0）即为终点。
3、空白滴定：用去除二氧化碳的蒸馏水替代样品进行滴定。
四、计算氨基氮（mg/ml或g样品）=[（V-V O）×C×0.14008]/10×100M或VC----氢氧化钠的当量浓度V-----滴定样品时消耗的氢氧化钠溶液的体积（ml）V O------滴定空白时消耗的氢氧化钠溶液的体积（ml）0.14008----氮的毫克当量。
甲醛滴定法测定氨基酸的原理
甲醛滴定法测定氨基酸的原理嘿，你知道吗？甲醛滴定法测定氨基酸，那可真是个神奇的事儿！咱先说说啥是氨基酸。
氨基酸就像是生命的小砖块，构建起了我们身体的各种重要物质。
没有氨基酸，咱可就没法正常运转啦！那怎么才能准确地测定氨基酸呢？这时候甲醛滴定法就闪亮登场了。
甲醛滴定法到底是咋回事呢？简单来说，就是利用甲醛和氨基酸的特殊反应来进行测定。
这就好比一场奇妙的化学反应舞会，甲醛和氨基酸在这个舞池中相遇，然后发生一系列的变化。
甲醛就像是一个神秘的魔术师，它能和氨基酸发生一些特别的反应。
当甲醛加入到含有氨基酸的溶液中时，会发生什么呢？氨基酸的氨基会和甲醛结合，形成一种新的化合物。
这就像是两个小伙伴手拉手，组成了一个新的团队。
这种新的化合物有啥特点呢？它的碱性会增强。
为啥会增强呢？这就像是给一个原本不太起眼的人穿上了一件闪亮的外套，一下子变得更加引人注目了。
碱性增强后，我们就可以用碱来滴定它了。
滴定的过程就像是一场精准的游戏。
我们小心地滴加碱液，看着溶液的变化。
就好像是在小心翼翼地走钢丝，一步一步都要非常谨慎。
当溶液的酸碱度达到一定的值时，我们就知道了氨基酸的含量。
你想想，这多神奇啊！通过这么一个看似简单的方法，就能准确地测定出氨基酸的含量。
这对于科学家们来说，可真是个了不起的工具。
在实际应用中，甲醛滴定法有很多优点呢。
它操作相对简单，不需要特别复杂的仪器。
这就好比是一个实用的小工具，随时都能拿出来用。
而且，它的准确性也比较高，可以为我们提供可靠的数据。
但是，就像任何方法都不是完美的一样，甲醛滴定法也有一些局限性。
比如说，它可能会受到其他物质的干扰。
这就像是在一场音乐会上，突然出现了一些噪音，会影响我们欣赏音乐的效果。
不过，这并不妨碍甲醛滴定法在很多领域的应用。
在食品工业中，我们可以用它来检测食品中的氨基酸含量，确保食品的质量和营养价值。
在医药领域，它也能帮助我们研究药物的成分和作用。
总的来说，甲醛滴定法测定氨基酸是一个非常有趣且实用的方法。
实验九 甲醛滴定法测定氨基酸
实验九甲醛滴定法测定氨基酸一、目的掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。
二、原理氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：H3N+—R—COO—⇔H2N—R—COO—+H+-NH+3是弱酸，，完全解离时pH为11～12或更高，若用碱滴定-NH+所释放的H+来测量3氨基酸，一般指示剂变色域小于10，很难准确指示终点。
常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右移，促使-NH+释放H+，使溶液的酸度增加，滴3定终点移至酚酞的变色域内(pH9.0左右)。
因此，可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。
R-CH(COO—)-NH+3⇔R-CH(COO—)-NH2+H+−−→−NaOH中和R-CH(COO—)-NH2−−→−HCHO R-CH(COO—)-NHCH2OH−−→−HCHO R-CH(COO—)-N(CH2OH)2如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量（脯氨酸与甲醛作用生成不稳定的化合物，使滴定mL数偏低。
酪氨酸的滴定mL数偏高）。
如样品是多种氨基酸的混合物，如蛋白水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。
但此法简便快速，常用来测定蛋白质的水解程度。
随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时，表示水解作用已完全。
三、器材药25 mL锥形瓶；3 mL微量滴定管；吸管；0.1 mol／L标准甘氨酸溶液300 mL 准确称取750 mg甘氨酸，溶解后定容至100 mL；0.1 m01／L标准氢氧化钠溶液500 mL；（标准氢氧化钠溶液应在使用前标定，并在密闭瓶中保存。
不可使用隔日贮在微量滴定管中的剩余氢氧化钠。
）酚酞指示剂20 mL 0.5％酚酞的50％乙醇溶液中性甲醛溶液400mL 在50 mL 36～37％分析纯甲醛溶液中加入1 mL 0.1％酚酞乙醇水溶液，用0.1 mol／L的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。
此试剂在临用前配制。
氨基酸总量(氨态氮)的测定(甲醛滴定法)
氨基酸总量(氨态氮)的测定（甲醛滴定法）一、单指示剂甲醛滴定法：(一)原理：氨基酸具有酸、碱两重性质，因为氨基酸含有-COOH 基显示酸性，又含有-NH2基显示碱性。
由于这二个基的相互作用，使氨基酸成为中性的内盐。
当加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就可用碱来滴定-COOH基，以间接方法测定氨基酸的量，反应式可能以下面三种形式存在。
（二）试剂(1) 40%中性甲醛溶液(2) 0.1%麝香草酚酞乙醇溶液。
(3) 0.100N氢氧化钠标准溶液。
(三)操作步骤：称取一定量样品(约含20毫克左右的氨基酸)于烧杯中(如为固体加水50毫升)，加2-3滴指示剂，用0.100N NaOH溶液滴定至淡蓝色。
加入中性甲醛20毫升，摇匀，静置1分钟，此时蓝色应消失。
再用0.100N NaOH溶液滴定至淡蓝色。
记录两次滴定所消耗的碱液毫升数，用下述公式计算计算：氨基酸态氮(％)=( N V×0.014×100)/W式中：N：NaOH标准溶液当量浓渡。
V：NaOH标准溶液消耗的总量(m1)W：样品溶液相当样品重量(克)。
0.014：氮的毫克当量。
三、双指示剂甲醛滴定法：(一)原理：与单色法相同，只是在此法中使用了两种指示剂。
从分析结果看，双指示剂甲醛滴定法与亚硝酸氮气容量法(此法操作复杂，不作介绍)相近单色滴定法稍偏低，主要因为单指示剂甲醛滴定法是以氨基酸溶液PH值作为麝香草酚酞的终点。
PH值在9.2，而双指示剂是以氨基酸溶液的PH值作为中性红的终点，PH值为7.0，从理论计算看，双色滴定法较为准确。
(二)试剂：(1) 40%中性甲醛溶液(2) 0.1%麝香草酚酞乙醇溶液。
(3) 0.100N氢氧化钠标准溶液。
(4) 0.1%中性红(50%乙醇溶液)(三)操作步骤：取相同的两份样品，分别注入100毫升三角烧瓶中，一份加入中性红指示剂2-3滴，用0.100N NaOH溶液滴定终点(由红变琥珀色)，记录用量，另一份加入麝香草酚酞3滴和中性甲醛20毫升，摇匀，以0.100N NaOH准溶液滴定至淡蓝色。
发酵过程主要生化指标的测定氨基氮测定——甲醛滴定法
• 水溶液中的氨基酸并不是以游离的羧基或 氨基形式存在，而是兼性离子，既是质子 供体（酸），也是质子受体（碱）。
COOH
COO-
COO-
H3N+ C H
H3N+ C H
H2N C H
R
2p左K右1
R
9p左K右2
R
甲醛可与氨基酸上的NH3+结合，生成羟甲基衍生物，释放出H+ R-NH2＋2HCHO→R-N（CH2OH）2
• 为何两种显色剂？
• 6-7.6 溴酚兰变色范围（黄 蓝）
• 7.4-10 酚酞变色范围（无色 粉红）
• 酚酞终点淡红，不易观察，现在变色范 围是从黄色变为紫色，终点为紫色，易 观察。
• 用标准碱液滴定羧基，按标准碱的消耗 量求出氨基酸的含量。碱完全中和羧基 时的pH值约为8.5～9.5。
滴定注意事项：
• 沙伦逊甲醛滴定法(Sorensenformaltitration) 一种测定氨基或氨基氮的方法。氨基酸 分子中含有碱性氨基和酸性羧基，在固 态或水溶液中以双性离子（内盐）存在， 因此不能直接用酸滴定氨基，也不能用 碱滴定羧基。
• 沙伦逊提出了将氨基酸（水溶液）用中 性甲醛水溶液处理，将氨基“隐蔽”后 滴定羧基的方法。
三、大肠杆菌发酵种子的制备
菌种
接种量1-2环
接种量1%
斜面 一级种子 二级种子
30℃，18h ， 4℃长期保存
14h，32℃，
8h，32℃
按学号，4人一组，3组共用一支斜面种子 摇瓶装液量50ml 一级种子种龄在14h±2h内，二级种子7-8h内
时间安排
每一格必须由操作人签名！
一级种子
二级种子
• 甲醛有毒，滴定要快，必要时可戴口罩。 • 现配现滴，滴完盖紧瓶盖。 • 中性甲醛若长时间放置会变酸,滴定前要
食品氨基酸总量的测定(精)
第八章 食品氨基酸总量的测定【教学目标】：1.掌握氨基酸、含氮量等的概念和相关知识；2.掌握氨基酸液氮的测定方法和操作技能；3.了解比色法的原理，基本方法及仪器使用和维护的知识。
一、甲醛滴定法1原理氨基酸具有酸性的一COOH 基和碱性的一N 2H 基。
它们互相作用使氨基酸成为中性的内盐。
加入甲醛溶液时，一N 2H 基与甲醛结合，其碱性消失。
这样就可能用碱来滴定一COOH 基，并用间接的方法测定氨基酸的量。
用碱完全中和一COOH 基时的pH 值为8.4~9.2。
2试剂（1）40%中性甲醛：用百里酚酞作指示剂，将甲醋用碱溶液中和至淡蓝色。
（2）0.1%百里酚酞乙醇溶液。
（3）0.1N 氢氧化钠标准溶液。
3操作方法称取粉碎样品5.00~10.00g 或液体样品5~10mL,置于烧杯中，加入50mL 水和活性碳约5g ，加热煮沸，过滤，用30~40mL 热水洗涤活性碳，收集滤液于三角瓶中，加入3滴百里酚酞指示剂，用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。
加入中性甲醛20mL ，摇匀，静置1min ，此时蓝色已经消失，再用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。
记录第二次滴定时消耗的碱液毫升数。
4计算氨基酸态氮（%）=100014.0⨯⨯⨯WV N 式中：N----氢氧化钠标准溶液的当量浓度；V----氢氧化钠钠标准溶液的消耗量（第二次）（g ）;W----样品溶液相当于样品的量（g ）;0．014----氮的毫克当量。
5说明（1）用碱性溶液第一次滴定时，用pH 计控制滴定到溶液pH7.5后，然后加入中性甲醛继续用碱液滴定，又用pH 计控制用碱液滴定样液至pH9.2为终点较为正确。
（2）取相同2份样品溶液，其中1份加入中性红指示剂3滴，用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至琥珀色为终点，另1份加入百里酚酞指示剂3滴和中性甲醛20mL ，静置1min 后，用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。
按下列、公式计算：100014.0)((%)12⨯⨯-⨯==WV V N X 氨基酸 式中： 2V ------用百里酚蓝作指示剂时消耗氢氧化钠量（mL ）；1V ------用中性红作指示剂时消耗氢氧化钠量（mL ）；N ------标准氢氧化钠溶液的当量浓度；W------样品重量（g ）；0.014----氮的毫克当量。
氨基酸态氮的测定方法之双指示剂甲醛滴定法
(5) 结果计算
氨基酸态氮（%）
式中 c ——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L;
V1——用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标 准溶液的体积，mL;
V2——用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠 标准溶液的体积，mL;
m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g 0.014——氮的毫摩尔质量，g/m mol
剂、测定方法、结果计算、说 0500mol/l氢氧化钠标准溶液
在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基酸含量的变化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的 指标之一。
①40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。
随着食品科学的发展和营养知识的普及，食物蛋白质中必 需氨基酸含量的高低及氨基酸的构成，愈来愈得到人们的 重视。为提高蛋白质的生理效价而进行食品氨基酸互补和 强化的理论，对食品加工工艺的改革，对保健食品的开发 及合理配膳等工作都具有积极的指导作用。因此，食品及 其原料中氨基酸的分离、鉴定和定量也就具有极其重要的 意义
种，而在构成的氨基酸中，亮氨酸、 异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨算、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体中不能合成，
必须依靠食品供给，故被称为必需氨基酸，它们对人体有着极其重要的生理功能，常会因其在体内缺乏而导致患病或通过补充而增强
了新陈代谢作用。
根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电
Na2B4O7 溶解后，定容至1000mL
0.
式中 c ——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L;
另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20ml，摇匀，静置1分钟，用0.
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实验九甲醛滴定法测定
氨基酸
集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-
实验九甲醛滴定法测定氨基酸一、目的
掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。
二、原理
氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：
H 3N+—R—COO—⇔H
2
N—R—COO—+H+
-NH+
3是弱酸，，完全解离时pH为11～12或更高，若用碱滴定-NH+
3
所释
放的H+来测量氨基酸，一般指示剂变色域小于10，很难准确指示终点。
常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上
述平衡右移，促使-NH+
3
释放H+，使溶液的酸度增加，滴定终点移至酚酞的变色域内(pH9.0左右)。
因此，可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。
R-CH(COO—)-NH+
3⇔R-CH(COO—)-NH2+H+−
−→
−NaOH中和
R-CH(COO—)-NH
2
−
−→
−HCHO R-CH(COO—)-NHCH2OH−
−→
−HCHO R-CH(COO—)-
N(CH
2
OH)
2
如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量（脯氨酸与甲醛作用生成不稳定的化合物，使滴定mL数偏低。
酪氨酸的滴定mL数偏高）。
如样品是多种氨基酸的混合物，如蛋白水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。
但此法简便快速，常用来测定蛋白质的水解程度。
随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时，表示水解作用已完全。
三、器材药
25 mL 锥形瓶；3 mL 微量滴定管；吸管；
0.1 mol ／L 标准甘氨酸溶液300 mL 准确称取750 mg 甘氨酸，溶解后定容至100 mL ；
0.1 m01／L 标准氢氧化钠溶液500 mL ；（标准氢氧化钠溶液应在使用前标定，并在密闭瓶中保存。
不可使用隔日贮在微量滴定管中的剩余氢氧化钠。
）
酚酞指示剂20 mL 0.5％酚酞的50％乙醇溶液
中性甲醛溶液400mL 在50 mL 36～37％分析纯甲醛溶液中加入1 mL 0.1％酚酞乙醇水溶液，用0.1 mol ／L 的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。
此试剂在临用前配制。
如已放置一段时间，则使用前需重新中和。
四、操作
1．取3个25 mL 的锥形瓶，编号。
向第1、2号瓶内各加入2mL0.1 mo1／L 的标准甘氨酸溶液和5 mL 水，混匀。
向3号瓶内加入7mL 水。
然后向3个瓶中各加入5滴酚酞指示剂，混匀后各加2 mL 甲醛溶液，再混匀，分别用0.1 mo1／L 标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色。
重复以上实验2次，记录每次每瓶消耗标准氢氧化钠溶液的mL 数。
取平均值，计算甘氨酸氨基氮的回收率。
甘氨酸氨基氮回收率％=加入理论量
实际测得量×100 公式中实际测得量为滴定第1和2号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液mL 数的平均值与3号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液mL 数之差乘以标准氢氧化
钠的摩尔浓度，再乘以14.008。
2mL乘以标准甘氨酸的摩尔浓度再乘14.008。
即为加入理论量的mg数。
2．取未知浓度的甘氨酸溶液2 mL，依上述方法进行测定，平行做几份，取平均值。
计算每mL甘氨酸溶液中含有氨基氮的mg数。
氨基氮(mg／mL)=
2
008 .
14
/
)
(⨯
⨯
-NaOH
L
mol
B
A
式中：A为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均mL数。
B为滴定对照液(3号瓶)耗用标准氢氧化钠溶液的平均mL数。
mo1／L
NaOH
为标准氢氧化钠溶液的真实摩尔浓度。
思考题
选用酚酞指示剂，为什么滴定的是氨基?
注意事项
本实验为定量实验，甘氨酸和氢氧化钠的浓度要严格标定，加量要准确，全部操作要按分析化学要求进行。