不结球白菜游离小孢子培养及再生植株的倍性鉴定

南京农业大学学报　2009,32(2):25229Journal of N anjing A gricultural U niversity
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成妍,班青宇,王倩,等.不结球白菜游离小孢子培养及再生植株的倍性鉴定[J ].南京农业大学学报,2009,32(2):25229
不结球白菜游离小孢子培养及再生植株的倍性鉴定
成妍,班青宇,王倩,侯喜林
3
(南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室,江苏南京210095)
摘要:对影响不结球白菜小孢子培养和植株再生的几个因素及再生植株的倍性进行分析。

结果表明:基因型是影响小孢子胚诱导率的最重要因子,正反交材料的胚诱导率无显著差异;供体植株开花后6～10d 培养可获得高的胚诱导率;琼脂在8～12g ・L -1范围内,随着质量浓度的提高可显著提高小孢子胚再生率。

结合流式细胞仪和植株形态鉴定,不结球白菜小孢子再生植株自然加倍率总体水平较高,有的高达90%,但不同基因型间有明显差异。

关键词:不结球白菜;小孢子培养;再生植株;倍性鉴定
中图分类号:S63413 文献标志码:A 文章编号:100022030(2009)022*******
Isol ated m i crospore culture and ploi dy i denti fi cati on of
m i crospore 2deri ved pl ants i n B rassica cam pestris ssp 1ch inensis
CHENG Yan,BAN Q ing 2yu,WANG Q ian,HOU Xi 2lin
3
(State Key Laborat ory of Cr op Genetics and Ger mp las m Enhance ment,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China )Ab s tra c t:Several fact ors affecting is olated m icr os pore culture of non 2heading Chinese cabbage were studied .
The results showed
that the genotype was the most i m portant fact or on the inducing rate of m icr os pore 2derived e mbryos,and no significant difference was observed w een reci p r ocal cr oss .The best infl orescence age of the donor p lants was 6210d after bl oom.H igher agar concen 2trati on fr om 8g ・L
-1
t o 12g ・L
-1
could significantly p r omote the regenerati on of e mbryos .Based on the fl ow cyt ometry and
identificati on of the mor phol ogical characteristics,a high level of the s pontaneous doubling efficiency fr om m icr os pore 2derived p lants was observed in non 2heading Chinese cabbage,even t o 90%,and there were obvi ous differences bet w een genotypes .Key wo rd s:B rassica cam pestris ss p 1chinensis ;m icr os pore culture;regenerated p lants;p l oidy identificati on
不结球白菜(B rassica cam pestris ss p 1chinensis Makino )原产中国,是长江中、下游地区人们喜食的蔬菜。

在蔬菜周年供应上,尤其是淡季供应上占有重要的地位。

不结球白菜是异花授粉植物,天然杂交率高,在育种上获得一个纯系需要5～6年的时间。

游离小孢子培养可以获得双单倍体植株,大大节省纯化时间和工作量。

小孢子还是一种优良的转化受体,它具备了单细胞和单倍体两个特性,不会获得杂合体或嵌合体,因此是突变体筛选和基因工程研究的理想材料。

曹鸣庆等[1]
首次报道不结球白菜游离
小孢子培养获得成功。

李岩等[2]、卢钢等[3]、蒋武生等[4]和耿建峰等[5]
获得不结球白菜小孢子再生植株,并对影响培养的基本因素进行了分析。

但与结球白菜、甘蓝、花椰菜、甘蓝型油菜等作物相比,不结球白菜游离小孢子培养研究起步较晚,技术还不完善,可重复性不高。

本研究以10份不结球白菜品种为材料,在前人研究基础上,对在不同开花时期取样和不同质量浓度琼脂上培养的小孢子胚再生进行研究,获得了大量子叶形胚状体和再生植株,并分析其倍性组成,为不结球白菜小孢子培养及其应用提供依据。

1　材料与方法
111　材料
供试不结球白菜材料为暑绿、寒笑、矮抗五号、矮抗六号、黄邦、N14217×N292168、N292168×N14217、苏州青、二青、N30225。

于2005年10月上旬育苗,11月上旬移栽于南京农业大学园艺学院江浦试验站,2006年3月上旬进入花期,栽培管理措施同一般大田。

收稿日期:2007211205
基金项目:国家863计划项目(2006AA100108)
作者简介:成妍,博士研究生。

3
通讯作者:侯喜林,教授,从事蔬菜遗传育种及分子生物学研究,E 2mail:hxl@njau 1edu 1cn 。

112　小孢子的分离和培养
小孢子分离参照耿建峰等[5]
的方法。

每皿接4个花蕾。

33℃培养24h 后转入25℃黑暗培养。

在LE I 2
CA DFC290显微镜下观察游离小孢子的发育情况。

25d 后统计子叶形胚数。

于7个不同开花时期(开花前、开花1～5d 、6～10d 、11～15d 、16～20d 、21～27d 、>28d )取样,单株开第1朵花为第1天。

113　小孢子胚的再生成苗子叶形胚转绿后转移到固体培养基上(B5+012mg ・L -1
62BA +0102mg ・L -1
NAA +30g ・L -1
蔗
糖+琼脂(8、10、12g ・L -1
))进行分化培养。

每处理接种15瓶。

4周后,统计小孢子胚的成苗率。

将生根良好的再生植株炼苗1周左右,移栽到基质中(V (草炭)∶V (蛭石)∶V (珍珠岩)=3∶3∶1)。

2周后移栽到大田,管理措施同普通植株。

114　小孢子再生植株的倍性鉴定
在试管苗移栽2周后,选取暑绿和黄帮小孢子再生植株各30株参照张振超等[6]
的测定方法,采用美国Beck man Coulter 公司生产的Ep ics XL 型流式细胞仪测定DNA 含量,以普通二倍体材料作为对照。

开花期对所有再生植株进行形态鉴定。

2　结果与分析
211　小孢子离体培养的发育情况
刚分离出的小孢子形状为圆球形,有3条明显的萌发沟,正处于单核靠边期(图12A ),高温热激后细胞膨大并启动分裂(图12B ),培养5d 时分裂成多细胞团(图12C ),10d 后肉眼可见到圆球形胚形成(图12D ),继而发育成心形胚(图12E )、鱼雷形胚(图12F )、子叶形胚(图12G )。

将生长良好的小孢子胚转移到固体培养基中(图12H ),部分胚玻璃化、褐化死亡(图12I ),多数胚开始直立生长,子叶膨大,生长点萌动,逐渐长出真叶(图12J )。

经过多次继代诱导生根后进行驯化移栽(图12K ),最后将小孢子植株移入大田生长(图12L )。

图1　不结球白菜小孢子在离体培养中的发育过程
F i g 11　D e ve l o pm e n t p r o ce ss o f m i c r o spo re o f no n 2hea d i ng C h i ne se cabba ge i n vitr o
A.刚游离的小孢子(×400)Fresh m icr os pore;
B.膨大的小孢子(×400)S welling m icr os pore;C .分裂成细胞团(×200)D ivid 2ing t o cell aggl omerate; D.圆球形胚(×40)Gl obular e mbryo;E .心形胚(×20)Heart stage e mbryo;F .鱼雷形胚(×20)Tor pedo stage embryo;G .子叶形胚(×613)Cotyledonary e mbryos;H.小孢子胚再生Embryos regenerating;I .再生中玻璃化V itrificati on;J.再生植
株Regenerated p lantlets;K .移栽成苗Plantlets after trans p lantati on;L.田间生长状况Plant gr owing in field
212　不同基因型小孢子胚诱导率的差异比较
从表1可以看出,供试的10个基因型都获得了胚状体,但不同基因型小孢子胚胎发生能力差异很
・62・ 南　京　农　业　大　学　学　报 第32卷　
大,出胚率最高的基因型N292168×N14217(2715
个/蕾)是苏州青(0114个/蕾)的近200倍。

方差分析显示,正反杂交组合基因型N14217×N292
168、N292168×N14217间小孢子胚诱导率无显著
差异。

213　不同开花时期对小孢子胚诱导率的影响
从表2可以看出,在不同开花时期进行培养,小孢子胚诱导率差异显著。

第1朵花蕾开花后6～10d 培养,胚诱导率最高可达3108个/蕾,11～15d 次之。

在开花后不到5d 和16～20d 两个时期
培养,胚诱导率分别为1117个/蕾和1150个/蕾。

开花前(小于0d )和大于20d 接种胚诱导率较低。

这可能由于在开花初期和末期,同一花蕾中小孢子发育的同步性较差,单核靠边期的小孢子占的比例较小,相应小孢子胚诱导率也较低。

表1　不同基因型小孢子胚诱导率的比较Ta b l e 1　Com p a riso n o f i nducem e n t ra te o f m i c r o spo re
em b ryo s i n d i ffe re n t ge no typ e s
基因型Genotype 蕾数Buds 产胚数Embryos 每蕾产胚数
Embryos per bud
暑绿Shul ü36902150c 寒笑Hanxiao
36762111c 矮抗五号A ikang 536812125c 矮抗六号A ikang
636902150c 黄帮Huangbang 3639711103b N14217×N2921683696026167a N292168×N142173699027150a 苏州青Suzhouqing 3650114d 二青Erqing 36210158cd N30225
36
9
0125d
注:不同上标字母表示在0105水平差异显著。

Note:The different superscri p t letters indicate significant difference
at 0105level .The sa me as foll ows .
表2　开花时期对小孢子胚诱导率的影响
Tab l e 2　I nfl ue nce o f i nfl o re sce nce age o n i nducem en t
ra te o f m i c r o spo re em b ryo s
开花时期/d
I nfl orescence age
蕾数
Buds 产胚数
Embryos 每蕾产胚数
Embryos per bud
<024110146e
1～536421117d 6～10361113108a 11～1536832131b 16～2036541150c 21～2724110146e >28
24
9
0138e
表3　琼脂质量浓度对小孢子胚再生的影响Ta b l e 3　Effe c t o f aga r co ncen tra ti o n o n regene ra ti o n o f
m i c r o spo re em b ryo s
基因型
Genotype
琼脂质量浓度/
(g ・L -1)
Concentrati on of agar
总胚数
Embryos 苗数
Plantlets
再生率/%
Rate of regenerati on
暑绿81504631c Shul ü10
1507147b 12
1508355a 黄帮81503927b Huangbang 10
1506443a 12
150
74
49a
214　琼脂质量浓度对小孢子胚再生植株的影响
从表3可以看出,在不同质量浓度琼脂的培养基上,小孢子胚再生率差异显著。

当琼脂为8g ・L
-1
时,多数小孢子胚玻璃化,有些甚至褐化死亡,只有少数胚能直接成苗,大多数胚产生愈伤后才分化成
苗。

接种在琼脂为10g ・L -1和12g ・L -1
的培养基上,2种材料小孢子胚的再生率都明显提高。

相同条
件下黄帮的小孢子胚再生率低于暑绿。

黄帮在琼脂浓度为10g ・L -1和12g ・L -1
时,小孢子胚再生率没有显著差异。

215　小孢子再生植株的倍性分析
对再生植株用流式细胞仪进行倍性检测(图2为流式直方图),二倍体对照与双单倍体的分离峰都
图2　不同倍性植株的DNA 含量峰值
F i g 12　DNA co n te n t o f p l a n ts w ith d i ffe ren t p l o i dy
・
72・第2期 成妍,等:不结球白菜游离小孢子培养及再生植株的倍性鉴定
出现在荧光强度为140处(图22A ),单倍体的分离峰都出现在荧光强度为70处(图22B );若分离峰
出现在其他位置则为其他倍性的材料,若出现多个分离峰则为混倍体。

追踪这些植株于抽薹开花时进行形态鉴定,单倍体植株矮小细弱、分枝多、叶片细长、无花粉或败蕾;双单倍体植株同二倍体对照,生长发育良好、有花粉。

两种倍性分析方法结果一致,表明通过流式细胞仪可以准确鉴别小孢子再生植株的倍性。

由表4可知,获得的再生株大多数为双单倍体,说明不结球白菜在小孢子培养过程中自然加倍率较高,其中暑绿的双单倍体比率高达90%。

这可能是由于单倍体植株忍受田间不利环境的能力较差,死苗率高,而双倍体植株相对健壮,存活率高。

基因型差异在再生株的自然加倍率上也有体现,在相同的培养与生长条件下,黄帮比暑绿的双单倍体比率低很多(表4)。

本试验中没有发现混倍体或其他倍性较高的植株。

表4　小孢子再生株的倍性组成
Tab l e 4　P l o i dy com po s iti o n o f p l an tl e ts de ri ve d fr om m i c r o spo re s
基因型
Genotype
移栽苗数
Trans p lantati on
成活株数
Survival 鉴定株数
I dentificati on
单倍体数
Hap l oids 比率/%
Rati o 双单倍体数
Double hap l oids
比率/%
Rati o 暑绿Shul ü
233176150151013590黄帮Huangbang
103
68
50
19
38
31
62
3　讨论
基因型间的差异在各种作物游离小孢子培养中都普遍存在。

耿建峰等[5]
通过多重比较将54个基因
型的白菜分为高诱导率、中诱导率、低诱导率和难诱导4类基因型,并推断小孢子胚诱导率的高低是由
少数基因控制的。

张凤兰等
[7]
通过对甘蓝型油菜研究发现其小孢子胚诱导率由具有加性效应特点的2个
基因位点控制。

本研究发现正反交材料的胚诱导率无显著差异,这与S ági 等[8]
对小麦花药培养的研究
结果一致。

关于细胞质的作用在不同作物上研究结果不同,对小麦[9]
品种间正反交杂种进行花药培养,
很少或根本没有观察到母性效应。

但在大麦
[10]
、玉米
[11]
中观察到了显著的细胞质效应。

通过对差异表
达的c DNA 文库筛选并根据功能基因组的信息,现已分离到许多与小孢子胚胎发生相关的基因
[12-14]
,
通过基因工程手段有望克服不利基因型的影响。

供体植株在不同开花时期的生理状况差异很大,它直接决定着花蕾中有效小孢子所占的比例多少,从而影响小孢子胚诱导率。

本研究发现在开花后6～10d 进行培养可获得高的胚诱导率。

该阶段植株正处于盛花期,光照、温度、湿度等都比较适合,同一花蕾中小孢子发育时期相对一致,单核靠边期小孢子占的比例较大,这与刘志文等[15]
在甘蓝型油菜中得到的结论一致。

但不同研究者因使用的试材不同
获得的结论也有差异,陈军等[16]
研究结果表明,中油821在开花1～5d 取材可获得较高胚诱导率,王
亦菲等
[17]
认为始花期前后1周的主轴花蕾培养效果最好。

玻璃化是小孢子胚成苗过程普遍存在的现象,它极大地降低了成苗率。

琼脂在8～12g ・L -1
范围内,随着质量浓度提高可显著提高小孢子胚再生率,王汉中等
[18]
在油菜小孢子培养中也有相同结论。

这可能是通过提高琼脂质量浓度间接降低了培养瓶中的湿度,减少玻璃化苗的产生,从而提高成苗率。

倍性鉴定传统上主要根据形态学、解剖学和染色体记数法进行,费工费时,不适宜大规模应用。

通过流式细胞仪测定细胞的DNA 相对含量鉴定植物倍性逐渐被广泛应用
[19]
,并且可以准确地鉴定小孢子
再生植株中的单倍体和双单倍体,这样可以在幼苗期对单倍体进行加倍处理,获得更多的双单倍体。

本研究发现不结球白菜的自然加倍率较高,在对再生苗量要求不大的情况下,完全可以省去繁琐的人工加倍。

对于自然加倍率较低的基因型需要进一步研究适合其加倍的方法。

通过游离小孢子培养获得的再生植株群体往往是倍性复杂的混合群体,其中二倍体和四倍体移栽成活率高,单倍体较低,而其他倍性的植株多生长不良,较难移栽成活,多在开花前死亡。

本研究是在移栽后2周时对再生植株进行流式细胞检测的,这时可能已丢失了一些特殊倍性的植株,因此倍性鉴定应及早进行。

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责任编辑:范雪梅
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92・第2期 成妍,等:不结球白菜游离小孢子培养及再生植株的倍性鉴定。