脂肪酶

第一章概述脂肪酶(Lipase，E C．3.1.1.3)是指分解或合成高级脂肪酸与丙三醇形成甘油三酸酯酯键的酶。

198年,Klibanov A M 等用脂肪酶粉或其固定化酶在有机溶剂体系中成功地催化合成了一系列有机物, 开始了脂肪酶非水相酶学的研究[1]。

随着研究的深入, 发现脂肪酶具有良好的醇解、胺解、酯化和转酯等特性, 可被广泛地应用于有机合成、精细化工、药物中间体合成、手性化合物拆分以及生物能源等诸多领域。

近年来,通过对界面酶学和非水相酶学的研究，从而进一步拓展了脂肪酶的应用领域，利用脂肪酶在有机相催化的各种反应可以合成大量高价值的产物，此外，脂肪酶在食品、医药、皮革和洗涤剂等许多工业领域中也有广泛的应用，充分显示了其巨大的应用潜力。

产脂肪酶的微生物种类很多，大约65个属微生物可产脂肪酶，其中细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属，而实际上可能更多。

脂肪酶产生菌中得到深入研究的主要集中在根霉、曲霉、青霉、毛霉、假单胞菌等具有工业应用价值的菌种以及与医学相关的金黄色葡萄球菌、钩端螺旋体、粉刺状杆菌等。

脂肪酶的筛选方法着眼于快速、简捷、准确、选择性强及易于自动化。

脂肪酶产生菌主要从自然界中寻找，而脂肪酶高产菌的筛选通常采用含甘油三酯的琼脂平板法，并通过在培养基中添加指示剂如罗丹明B、溴甲酚紫、维多利亚蓝等作为筛选标记，然后采用不同的方法对培养条件进行优化。

其筛选的一般过程是：样品分离→富集培养→平板初筛→摇瓶复筛。

不同微生物合成脂肪酶的能力不同，因此，要达到工业用脂肪酶生产微生物的要求，首先要筛选和诱导出与所需酶学性质相符的高产菌株，或者构建高表达量的重组基因工程株。

第二章方案论证2.1脂肪酶的简介脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。

植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。

在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富（Pandey等）。

由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。

2.1.1脂肪酶的分子结构及特征研究表明多数脂肪酶是一种糖蛋白，其糖基部分占分子量的2%~15%，以甘露糖为主，整个分子由亲水部分和疏水部分组成，活性中心靠近分子的疏水端。

研究表明来源不同的脂肪酶，其氨基酸组成数目从270~641不等，从已报道的文献[2—3]来看，分子量为16KD~200KD。

Dong-Woo Lee等报道的B.thermleovorans 单体分子量为16KD,Abel Hiol等报道的Mucor hiemalis f.hiemalis分子量为49 KD，而Lambit Kanwar等报道的一株假单胞菌所产脂肪酶的分子量则为143 KD。

J.S.Twu等从鼠肝中提纯了脂肪酶，其全分子量达到了200 KD，亚分子量达53 KD。

迄今为止，人们已经对多种脂肪酶进行克隆和表达，并利用X-衍射等手段以及定向修饰等技术测定了酶的氨基酸组成、晶体结构、等电点等参数，确定了组成脂肪酶活性中心的三元组结构。

绝大多数脂肪酶的活性中心都是由Ser 和 His参与组成（BaleaoVM,1996）Ser、 His与另一种氨基酸残基（如CCl 和GCL的 GLU,RML和 hPL 的Asp）一起构成脂肪酶催化中心的三元组。

如下图（Van T H,1993）。

BaleaoVM等（1996）报道的人胰脂肪酶（HPL）,Brady L等（1990）报道的Rhizomcor miehei脂肪酶(RML)和Schrag J D等（1991）报道的Geo candidum脂肪酶等的蛋白晶体结构已经研究清楚。

Geo candidum的立体结构也证明这种三联体的存在，见图1（Brady Letal,1990）。

上述三种脂肪酶中，活性中心丝氨酸残基的侧链构象在空间结构方面与丝氨酸蛋白酶的非常相似，不同的是脂肪酶的活性中心隐藏在蛋白质内部。

2.1.2脂肪酶的作用机理脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；Schmid）。

脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。

脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda 和Desnnelv 就发现了这一现象。

溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。

这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征。

酯酶（E C3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸（≤C8）形成的酯。

酶的底物特异性与其结构和酶的活性中心有关。

不同微生物来源的脂肪酶其组成成分、理化特性各不相同。

主要可分为三大类：脂肪酸专一性、酯键位置专一性和立体专一性。

脂肪酸专一性：脂肪酶对不同碳链长度的脂肪酸表现出特殊反应性。

不同来源的脂肪酶水解油脂的脂肪酸专一性有很大的差异。

例如圆弧青霉和B.Subtilis(Lesuisse E,1993)脂肪酶对短链(C8以下)脂肪酶，黑曲霉和根霉产生的脂肪酸对中等链长（C8 ~C12)脂肪酸具有特异性（曹淑桂，1995），而白地霉（李香春，2003;Jensen R G,1974;岩井美枝子，1989）和P.alcoligenes(Lentingh B M,1993）产生的脂肪酶对三油酸（不饱和脂肪酸）呈现强特异性。

酯键位置专一性：指脂肪酶对底物甘油三酯中的1,3位或2位酯键的识别。

三酸甘油酯具有三个酯键，根据脂肪酶对底物作用位置不同可将其分为无位置特异性脂肪酶和位置特异性脂肪酶。

例如，黑曲霉、根霉、铜绿假单胞菌（Gilbert E J,1991）、P.alcoligenes的脂肪酶仅催化1或3位酯键水解，对2位酯键无作用；白地霉、圆弧青霉、伯克霍尔德氏菌和荧光假单胞菌的脂肪酶无位置特异性（曹淑桂，2005），水解甘油三酯的所有酯键；目前仅发现一种可水解2位酯键的脂肪酶来源于Geotrichum sp.(Asahara T etal.1993)。

立体专一性：指脂肪酶对底物甘油三酯中立体对映结构的1位和3位酯键的识别和选择水解。

不少脂肪酶催化拆分外消旋化合物的反应具较高的立体选择性（E>90）,例如，Akesson等发现，来源于荧光假单胞菌脂肪酶能区分Sn-1和Sn-3位二酰基甘油，但水解Sn-2、 Sn-3二酰基甘油比水解它的对应体速度快得多。

因此这类脂肪酸被广泛应用到医药领域（宋欣，2004）。

2.2 产脂肪酶的微生物最早报道的是兔胰脂肪酶，后来在植物种子中也发现了脂肪酶，而微生物是20世纪初发现的。

微生物脂肪酶种类多，且较动植物更易获得纯培养，制备周期短，便于工业化生产和获得高纯度的酶制剂，使得微生物脂肪酶在酶理论研究及实际应用中的重要性逐渐增加，因此对其研究和应用上的发展相当迅速。

目前商业脂肪酶绝大多数都是微生物脂肪酶。

产脂肪酶的微生物种类很多，大约65个属微生物可产脂肪酶，其中细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属，而实际上可能更多。

脂肪酶产生菌中得到深入研究的主要集中在根霉、曲霉、青霉、毛霉、假单胞菌等具有工业应用价值的菌种以及与医学相关的金黄色葡萄球菌、钩端螺旋体、粉刺状杆菌等。

2.3产脂肪酶菌的筛选方法筛选脂肪酶高产菌的方法常见的是采用含甘油三酯琼脂平板。

首先采集含油污土壤样品或其它杂物如油垢、费油布等，无菌水梯度稀释样品，涂平板，培养，观察平板上菌落周围透明圈或通过在培养基中添加指示剂如罗丹明 B、溴甲酚紫、维多利亚蓝等作为筛选标记，观察变色圈的大小。

透明圈和变色圈的有无与大小说明菌株产脂肪酶能力，即透明圈和变色圈越大，菌株产脂肪酶能力越大。

2.4脂肪酶的活性测定脂肪酶的活力测定分两大类，定性检测和定量检测[4]。

一般根据目的的不同选择合适的底物和方法。

定性检测脂肪酶活力主要采用平板法，即在含有底物的平板上打孔，将酶液加入到孔内，然后根据水解定性分析脂肪酶活力高低。

如kouker等于1987年报道了一种脂肪酶平板检测法，他们以三油酸甘油为底物，罗丹明B为指示剂，在平板上比较酶液周围荧光圈大小，进而判断脂肪酶活力大小。

常用的定量测定方法有三种：碱滴定法、PNPB法、皂铜法。

2.4.1 碱滴定法这是最早也是使用最为普遍的用于脂肪酶活性检测的方法。

原理为以橄榄油或三油酸甘油酯或三丁酸甘油酯和2%聚乙烯醇乳化液为底物，在脂肪酶作用下，脂肪酶水解为甘油及游离脂肪酸，以1%酚酞为指示剂，用0.05MNaOH中和反应产生的脂肪酸，每产生1umol脂肪酸定义为一个酶活力单位。

三种方法中碱滴定法（Fox PF 1983;Yeap CK,1998;Hee BZ,2003）最为常用，该法简单易行。

不过使用碱滴定法时如何选择底物是关键之一，其中，三丁酸甘油酯和三油酸甘油酯为国外进口的商品，脂肪酶活力检测的结果稳定性优于国产的橄榄油。

2.4.2 PNPB法PNPB（Lee D Wet al.1999）法因其反应灵敏、重复性较好，是目前国外普遍采用的测活方法。

此法不同于碱滴定法，它的原理为在一定的PH/温度条件下，以对硝基苯丁酸酯为底物，乙腈为溶剂，加入酶液反应15分钟，然后在405nm 下测定反应产生的对硝基苯的吸光度，以反应产生的对硝基苯的量评估酶活力，测定前需制作对硝基苯吸光度标准曲线。

该法活力单位定义为：脂肪酶在最是温度、最适PH下，每分钟水解产生1umol的对硝基苯酚所需的酶量。

该法的缺点是底物价格昂贵。

2.4.3 皂铜法是以甘油三酯和阿拉伯胶为底物，反应产生的脂肪酸用有机溶剂（正己烷）抽提，然后有机相中加入醋酸铜水溶液生成皂铜，最后提取有机相，加入染色剂二乙基二硫氨基甲酸，混合均匀后在430nm测定二乙基二硫氨基甲酸的吸光度，反应也需制作吸光度标准曲线。

该法检测灵敏度高，但是由于试验中使用大量苯进行铜皂的萃取，容易造成环境污染和对人体的伤害。

因此，PNPB法和皂铜法（Lee D Wet al.1999）虽然检测灵敏度高，但相对操作繁琐，而且PNPB法使用的试剂昂贵。