替米考星分子印迹聚合物的制备及其固相萃取研究

替米考星分子印迹聚合物的制备及其固相萃取研究郑亚秋曹湛郭宏斌张青杰贺利民*陈清菊骆飚（华南农业大学兽医学院药理研究室，广州510642）摘要以泰乐菌素为虚拟模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，合成了对替米考星具有高选择性的分子印迹聚合物。

考察了二甲基甲酰胺、甲醇、丙酮和氯仿4种致孔剂对合成聚合物性能的影响。

通过正交实验优化的聚合配方为：1.0mmol 泰乐菌素，8.0mmol 甲基丙烯酸，20.0mmol 乙二醇二甲基丙烯酸酯，6.0mL 氯仿，20.0mg 偶氮二异丁腈。

研究了将该聚合物作为固相萃取填料分离、富集替米考星的萃取条件和萃取性能。

当萃取柱依次用甲醇和水（pH 9.0）活化，乙腈溶液上样，甲醇和氯仿分别洗涤，3mL 氨化甲醇（95ʒ5，V /V ）洗脱时，替米考星在分子印迹固相萃取柱上的回收率达到90%以上，而非分子印迹固相萃取柱的回收率仅为32%。

关键词分子印迹聚合物；替米考星；固相萃取；虚拟模板2009-07-10收稿；2009-08-20接受本文系农业行业标准资金（No.200103151）资助*E-mail ：hlm1922@1引言替米考星（Tilmicosin ，TIM ）是一种由泰乐菌素（Tylosin ，TYL ）半合成制得的大环内酯类畜禽专用抗生素，具有同其它大环内酯类药物相似或更强的抗菌活性，目前广泛用于预防和治疗牛、羊、猪和鸡等动物由敏感菌引起的感染性疾病，特别是畜禽呼吸道感染［1］。

考虑动物性食品安全，欧盟、美国和日本等都对该药制定了较低的最高残留限量，我国农业部公告第235号也制定了TIM 的最高残留限量牛、羊和猪的脂肪肝、肾中分别为50，1000和1000μg /kg ；羊奶中为50μg /kg ；鸡的肌肉、皮脂、肝和肾中分别为75，75，1000和250μg /kg 。

提高样品净化方法的选择性一直是痕量分析研究的重要方面，近年来用分子印迹聚合物（Molecularly imprinted Polymers ，MIPs ）作为填料的固相萃取受到广泛关注［2 5］。

与传统的固相萃取填料相比，MIPs 兼具生物吸附材料的选择性和常规填料的理化稳定性［6］。

但由于模板分子难以完全除去，限制了MIPs 在痕量分析中的应用，“虚拟模板”的应用很好地解决了这一问题［7，8］。

本实验以与TIM 结构相似的TYL 为虚拟模板分子（图1），合成的MIPs 对TIM 具有良好识别性能。

将制备的MIPs 作为固相萃取填料，对TIM 具有很高的选择性，为生物样品中替米考星残留的分离、纯化提供了基础。

1替米考星与泰乐菌素的化学结构式Fig.1Chemical structural formula of Tilmicosin （TIM ）and Tylosin （TYL ）2实验部分2.1仪器与试剂Waters2695-2487型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；XL-30型环境扫描电子显微镜（荷兰菲利第38卷2010年1月分析化学（FENXI HUAXUE ）研究简报Chinese Journal of Analytical Chemistry第1期95 9969分析化学第38卷浦电子光学有限公司）；SHA-B型恒温水浴振荡器（常州国华电器有限公司）。

替米考星标准品（含量≥98.5%，Dr.Ehrenstorfer公司）；泰乐菌素标准品（含量≥90%，Sigma-Aldrich 公司）；泰乐菌素原料（含量≥90%，西安亨通光华制药有限公司），使用前用甲苯重结晶；甲基丙烯酸（Methacryclic acid，MAA，分析纯，天津市科密欧化学试剂开发中心）；乙二醇二甲基丙烯酸酯（Ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA，98%，Sigma-Aldrich公司），使用前用活性炭吸附除去阻聚剂；偶氮二异丁腈（Azobisisobutyronitrile，AIBN，化学纯，天津市科密欧化学试剂开发中心），使用前用甲醇重结晶；甲醇、乙腈、二甲基甲酰胺、丙酮、氯仿和乙酸铵均为色谱纯；其它试剂均为分析纯；实验用水为去离子水。

2.2MIPs的制备2.2.1不同致孔剂的MIPs的制备分别将1.0mmol TYL溶解于6mL二甲基甲酰胺、甲醇、丙酮和氯仿中，加入4.0mmol MAA，超声混合5min，4ħ预聚合4h。

然后加入20.0mmol EGDMA和40.0mg AIBN，超声5min，于冰浴上吹高纯氮气5min，密封，60ħ水浴聚合24h，得到块状聚合物。

将聚合物研磨、过筛（粒度为38 75μm），用丙酮反复沉降以除去细小颗粒。

然后装入15mmˑ200mm玻璃层析柱，用甲醇-乙酸（9ʒ1，V/V）溶液200mL洗涤去除模板，流速控制在1mL/min以内，再用100mL甲醇洗去乙酸，真空干燥12h，备用。

非印迹聚合物（Non-imprinted polymers，NIPs）除不加模板分子外，其它步骤同上。

2.2.2正交实验设计以氯仿为致孔剂，固定模板分子TYL为1.0mmol，考察MAA用量（A）、EGDMA（34）正交实验。

通过固相萃取加标回收实用量（B）、氯仿用量（C）和AIBN用量（D）4个因素，进行L9验，分析各因素对聚合物性能的影响，获得最优合成配方。

2.3固相萃取实验2.3.1分子印迹固相萃取柱的制备及萃取条件优化称取150mg MIPs于体积为3mL带有滤板的聚丙烯空柱中，制成分子印迹固相萃取（Molecularly imprinted solid phase Extraction，MISPE）柱。

考察不同的活化、上样、淋洗和洗脱条件下MISPE柱对TIM的保留能力。

TIM的上样浓度为10.0mg/L，上样2mL，收集洗脱液，吹干后溶解于2mL甲醇中，用HPLC测定。

同时用NIPs制备非印迹固相萃取（Non-imprinted solid phase extraction，NISPE）柱做对照实验。

2.3.2MISPE的选择性实验将TIM和TYL溶于乙腈，制备浓度为10.0mg/L的混合标准溶液，上样2mL，分别收集MISPE柱的洗涤和洗脱组分，吹干后溶解于2mL甲醇中，用HPLC测定。

2.4色谱条件柱（250mmˑ4.6mm，5μm）；流速：1mL/min；柱温：30ħ；进样量：色谱柱：Agilent Extend-C1810μL；检测波长：287nm；流动相：0.1mol/L乙酸铵溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱程序为：0min，20%B；2.5min，48%B；4.5min，48%B；4.6min，20%B。

3结果与讨论3.1聚合条件的优化3.1.1致孔剂的选择用扫描电镜对4种致孔剂合成的聚合物进行结构表征。

从放大8000倍的聚合物表观形态图（图2）可以看出，以甲醇为致孔剂的聚合物结构松散；以丙酮和氯仿为致孔剂的聚合物结图2不同致孔剂制备的分子印迹聚合物的扫描电镜图（ˑ8000）Fig.2Scanning electron micrographs of molecularly imprinted polymers（MIPs）prepared by differentporogens（ˑ8000）a.二甲基甲酰胺（Dimethyl formamide，DMF）；b.甲醇（Methanol）；c.丙酮（Acetone）；d.氯仿（Chloroform）。

构比较致密，有大量孔穴；以二甲基甲酰胺为致孔剂的聚合物结构致密，表面光滑。

由回收率结果（表1）可以看出，以丙酮和氯仿为致孔剂的MIPs 吸附保留性能好，但以丙酮为致孔剂的NIPs 回收率也达到78%，非特异性吸附较强。

因此，本实验确定以氯仿为致孔剂。

董文国等［9］通过1H-NMR 实验表明：不同致孔剂中合成的聚合物识别能力的差异源于其在不同溶剂环境中形成氢键的能力有差别，用弱极性氯仿制备的MIPs 的游离羧基和TIM 可能形成较强的氢键。

表1不同致孔剂聚合物的TIM 固相萃取回收率（n =3）Table 1Solid-phase extraction recoveries of tilmicosin （TIM ）by polymers prepared in different porogens （n =3）致孔剂Porogen二甲基甲酰胺DMF 甲醇Methanol 丙酮Acetone 氯仿Chloroform 回收率（标准偏差）Recovery （SD ）/%MISPE 80.3（3.4）78.6（4.3）89.2（2.4）88.6（3.1）NISPE45.1（4.0）72.3（2.9）78.0（3.6）32.1（4.9）MISPE ：分子印迹固相萃取（Molecularly imprinted solid-phase extraction ）；NISPE ：非印迹固相萃取（Non-imprinted solid-phase extrac-tion ）；SD ：标准偏差（Standard deviation ）。

3.1.2正交实验结果分析采用极差法（R 值）分析正交实验数据，结果见表2。

从对回收率指标影响3交联剂用量对聚合物吸附性能的影响Fig.3Effect of amounts of cross-linker on theadsorption properties of polymers prepared考虑，在4个考察因素中，影响最大的为交联剂用量（B ），最优合成配方为A 3B 1C 2D 1。

按此组合制备的MIPs 固相萃取回收率达到97%。

但该聚合物质地软，在固相萃取过程中流速慢，重复使用时，结果不稳定，非特异性吸附强。

这可能因为交联剂用量少，聚合物在洗脱模板分子后，无法保持孔穴原来的形状和大小，使结合位点发生变化。

因此考虑适当增加交联剂用量，使聚合物的刚性增强。

固定其它物质的量，增加EGDMA 用量。

结果如图3所示，当EGD-MA 用量为20.0mmol 时，所制得的聚合物刚性适中，特异性强，回收率较高，具有良好的重复性。

因此，综合考虑MISPE 的回收率、稳定性、特异性等因素，本实验最终确定MIPs 的合成配方为：1.0mmol TYL ，8.0mmol MAA ，20.0mmol EGDMA ，6.0mL 氯仿，20.0mg AIBN 。

表2正交实验的结果及分析Table 2Results and analysis of orthogonally designed test实验序号Test No.因素FactorsA甲基丙烯酸Methacryclic acid（mmol ）B乙二醇二甲基丙烯酸酯Ethylene glycol dimethacrylate（mmol ）C 氯仿Chloroform （mL ）D偶氮二异丁腈Azobisisobutylnitrile（mmol ）回收率Recovery （%）1 2.010.0 2.020.091.32 2.020.0 6.040.047.53 2.030.010.060.019.04 4.010.0 6.060.092.65 4.020.010.020.071.06 4.030.0 2.040.021.978.010.010.040.068.888.020.0 2.060.068.498.030.0 6.020.071.9k 152.684.260.578.1k 261.862.370.746.1k 369.737.652.960.0R 17.146.617.732.0优化水平Optimal levelA 3B 1C 2D 1主次顺序Influencing orderB ﹥D ﹥C ﹥A79第1期郑亚秋等：替米考星分子印迹聚合物的制备及其固相萃取研究3.2MISPE的优化3.2.1活化溶剂的选择依次用甲醇和不同pH值的水（5.0，7.0和9.0）活化MISPE柱，并用NISPE 柱作对照。