纤维素分解细菌的分离和鉴定
2023年新教材高中生物微生物的基本培养技术能力提升练(无答案)新人教版选择性必修3
1.2.1 微生物的基本培养技术一、选择题1.下列关于纤维素分解菌分离和鉴定的叙述，正确的是（）A.要从土壤中将纤维素分解菌分离出来，应该将它们接种在含指示剂的鉴别培养基上B.分离分解纤维素的微生物时把纤维素作为唯一氮源C.对纤维素分解菌进行选择培养时，要选用液体培养基，原因是纤维素分解菌在固体培养基上不能生长D.刚果红染色法筛选纤维素分解菌使用的培养基属于鉴别培养基2.下列关于微生物实验操作的叙述，错误的是（）A.培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌B.接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧C.接种后的培养皿要倒置，以防培养基污染D.菌种分离和菌落计数都可以使用固体培养基3.微生物培养过程中，要十分重视无菌操作，现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染，请分析下列操作，错误的是（）①煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢②接种操作要在酒精灯火焰附近进行③无菌繁殖脱毒苗时，植物的外植体要进行消毒④家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌⑤培养基要进行高压蒸汽灭菌⑥加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌.A.①③B.②④C.③⑤D.④⑥4.下列有关微生物实验室培养的叙述，不正确的是（）A.在熔化琼脂时，需要控制火力并不断搅拌，以免发生焦糊B.灼烧、高压蒸汽灭菌、紫外线照射等都属于无菌技术C.样品中活菌数量统计时，接种方法应采用平板划线法D.用平板培养基培养微生物时，应将平板倒过来放置5.广泛用于牛奶、奶酪、啤酒等产品的消毒方法是（）A.高压蒸汽灭菌B.巴氏消毒法C.酒精消毒D.火焰灼烧6.尿素是尿素分解菌的氮源，因此在配制培养基时（）A.葡萄糖在培养基中含量越多越好B.尿素在培养基中含量越少越好C.尿素分解菌有固氮能力，故培养基中尿素为无机氮D.尿素分解菌无固氮能力，故培养基中的尿素为有机氮7.如下表所示为某微生物培养基的配方，请回答错误的是（）A.依物理性质，该培养基属于液体培养基B.依用途划分，该培养基属于选择培养基.C.根据培养基原料，所培养微生物的同化作用的类型是自养生物D.该培养基中的碳源是（CH2O）8.下列关于培养基的叙述正确的是（）A.配置培养基时要依据微生物的营养需求B.培养细菌时一般需调整pH为中性或酸性C.是碳源的物质不可能同时是氮源D.配置液体培养基的目的是为了观察菌落特征9.微生物的实验室培养过程中，培养基配制后的分装一般有两种：一种为分装至试管；一种分装至培养皿，称为倒平板。
纤维素分解菌的分离和鉴定
纤维素降解菌类的分离与鉴定系列实验一、实验背景纤维素是植物细胞壁主要成分，属于多糖类物质，是地球上数量最大的可再生资源。
如能利用微生物将其转化为生物产品或生物能源，即可缓解能源短缺、解决环境污染，又能形成新的产业。
由于在自然界中存在着大量产纤维素酶的细菌和真菌，因而纤维素的生物降解主要依赖于微生物的作用。
从20世纪40-50年代起，针对产纤维素酶的微生物的分离筛选就进行了大量的工作，并逐步建立起一套较完整的分离筛选方法。
迄今为止有关纤维素降解菌分离筛选的研究报导已有很多，如细菌中的生孢噬纤维菌属、噬纤维菌属及纤维单胞菌属等；放线菌由于能形成芽孢，与真菌相比较耐高温和各种酸碱度，故在高温阶段放线菌对分解木质素和纤维素起着重要的作用。
主要有诺卡氏菌属、链霉菌属、芽孢杆菌属及小单胞菌属等；真菌中研究较多的是青霉属、根霉属、曲霉属等，其中以木霉属的菌株纤维素酶活较高。
以羧甲基纤维素钠和添加少量葡萄糖作为碳源，培养纤维素酶产生菌株，培养一定时间后，经刚果红染色和稀碱液固定，在菌落周围形成透明水解圈，根据透明圈的大小，快速定性鉴定纤维素酶产生菌酶活大小。
与传统纤维素酶活检测方法比较，本方法菌丝生长快，两天后菌落经染色，透明圈边缘清晰，直观性强，与酶活力成一定线性关系。
纤维素是世界上所有植物的组成部分，是地球上最为丰富且可再生的资源。
随着世界能源形势趋于恶化，环境问题日益加剧，利用纤维素生产有高附加值资源的以维持人类可持续发展的研究方向近年来逐步成为科学研究的热点方向。
利用微生物将纤维素、半纤维素降解转化为生物产品或生物能源即可缓解能源短缺、解决环境污染，又能形成新的产业。
因此分离和筛选高酶活性的菌株是有效利用纤维素物质的关键。
二、实验目的从目标试样中分离筛选出具有降解纤维素能力的菌株。
三、实验材料：1、样品的采集1）风干土样E4-1、E2-6、E2-6试样。
2）潮湿土样E4-1、E2-6、E2-6试样。
3）牛粪样品2份以上实验材料全部取自三教微生物实验室冰箱中；2、培养基1）CMC培养基2）LB培养基3）高氏1号培养基4）PDA培养基3、其他物品天平，称量纸，药匙，试管架，涂布器、摇床、烘箱、灭菌锅、瓶子、45ml无菌水（带玻璃珠），含9ml无菌水的试管，无菌培养皿，1ml及0.08ml移液管。
纤维素分解菌的筛选方法
纤维素分解菌的筛选方法
纤维素是一种重要的营养物质，是细菌中含量最丰富的有机物质，具有重要的生物学
功能，常被用于制备肥料和饲料等。
研究纤维素分解菌种类及其分解的反应特性，是研究
纤维素降解机理的重要基础。
纤维素分解菌的筛选方法主要有几种，包括淀粉膜电泳筛选，扩增隔离法，等电点筛选，微量培养筛选，补液筛选，微量测定等。
1. 淀粉膜电泳筛选：采用放大型电泳仪，用淀粉溶液构成膜，将单细胞菌悬浮液流
过该膜，其中纤维素分解菌可形成淀粉膜电泳状态，能在该膜中形成一定的结构，从而被
检测到。
2. 扩增隔离法：将一定浓度的纤维素溶液，与培养基或植物提取物按比例混合，在
适宜的条件下，加入适量的细菌，构成纤维素溶液底物，配制培养基，进行培养，根据培
养结果来筛选出对纤维素感兴趣的菌株。
3. 等电点筛选：利用膜膜过滤，在纤维素分解反应的同时，膜膜滤过的细菌会因等
电点变化而被选择。
4. 微量培养筛选：在不同营养条件和温度条件下，采用微量的纤维素细胞悬液，进
行培养，根据形态生长变化、颜色变化等特征，来判断哪些细菌对纤维素有分解能力。
5. 补液筛选：在细胞处理步骤中，常常采用补液筛选方法，利用纤维素溶液作为营
养基底，进行补液筛选，通过补液来影响纤维素分解速度，筛选具有良好分解能力的菌株。
6. 微量测定：取液量较小的细菌悬液，进行分离、培养，在相应的条件下，采用固
体纤维素的含量来微量测定纤维素分解菌的数量，从而筛选出纤维素分解菌菌株。
通过以上各种方法，可以有效筛选出纤维素分解菌的种类，从而更好的研究纤维素降
解的机理和分解效率。
分解纤维素的微生物的分离知识点
分解纤维素的微生物的分离知识点纤维素是植物细胞壁的主要结构成分，通常与半纤维素、果胶和木质素结合在一起，其结合方式和程度对植物源食品的质地影响很大。
你知道纤维素的微生物怎么分离的吗?下面店铺给你分享分解纤维素的微生物的分离知识点，欢迎阅读。
分解纤维素的微生物的分离知识点一、纤维素与纤维素酶1.纤维素的化学组成含C、H、O三种元素，是一种多糖。
纤维素的基本组成单位是葡萄糖，人体内没有纤维素酶，所以人体不能直接以纤维素为能源物质，但土壤中有分解纤维素的微生物，最终把纤维素分解成葡萄糖释放到无机环境。
2.纤维素的分布棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。
纤维素产生于植物的光合作用，地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨。
研究土壤中分解纤维素的微生物将给我们的生活带来很大变化。
3.纤维素酶的组分纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶三种组分。
前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。
二、纤维素分解菌的筛选1.方法刚果红染色法，常用的有两种，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。
2.原理(1)含纤维素的培养基中加入的刚果红，可与纤维素形成红色复合物。
(2)当纤维素被纤维素酶分解后，形成的纤维二糖、葡萄糖不和刚果红发生这种反应，红色复合物就无法形成，培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，可通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
三、实验设计1.实验流程土壤取样→选择培养(此步可省略)→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。
2.土壤取样采取土样时，可以选择富含纤维素的环境。
3.选择培养(1)目的：增加纤维素分解菌的浓度，确保能够从样品中分离得到所需要的微生物。
(2)操作方法：将土样加入装有30 mL选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养1～2_d，直至培养液变混浊，也可重复选择培养。
纤维素菌分离和鉴定的方法
纤维素菌分离和鉴定的方法一、概述纤维素由于其特殊的生化性质，一直是微生物学和食品工业研究的关注焦点。
特别是纤维素的分解，除了传统的化学方法，生物法也是目前广泛采用的技术之一。
对纤维素酶活性和产酶微生物的分离和鉴定，是纤维素生物技术研究的重要内容。
纤维素分解酶是产生于微生物体内的一类酶，广泛存在于真菌和细菌中，可划分为纤维素酶和半纤维素酶两大类，规律的利用这些微生物菌种，开发新型的纤维素分解酶。
纤维素的微生物分解菌种较多，其中许多菌种能分泌出多种细胞外酶，如单糖的转化酶、纤维素酶、半纤维素酶、葡萄糖氧化酶、木糖酶、果糖酶和葡聚糖酶等。
多种新型有机物的产生依赖于工业生产中微生物的应用技术，目前各国纤维素降解的菌株和发酵产物分离和鉴定方法越来越多。
纤维素菌的分离可采用筛选、稀释和富集等方法。
实际应用中，常用的分离方法有：（一）厌氧富集法：根据纤维素菌能够在厌氧条件下进行生长和代谢的特点，采用富集培养方法，利用耐氧性微生物限制氧气的供应，引起产生厌氧性纤维素分解菌类，然后推广领域固定化、发酵和应用。
可根据繁殖时间将厌氧富集法分为短时间富集法和长时间富集法。
（二）筛选法：在纤维素富含的自然环境或人工培养环境中进行筛选。
先用一些微生物菌株做为预培养菌种，加入富含纤维素的培养基，通过短期采取接种、稀释、摇动等处理方式，寻找纤维素分解酶活力最高的培养物，然后进行分离纯化、性质鉴定。
（三）稀释法：将样品依一定比例进行稀释，将稀释后的液体均匀地均匀的加入纤维素培养基中，用深层培养的方式进行发酵，进行分离鉴定纯化。
稀释法适用于富含纤维素且菌株较多的培养基的菌群筛选。
（一）形态学特征鉴定法：根据菌株的形态学特征进行鉴定。
此方法是最基本也是最重要的鉴定方法之一。
菌株的形态学特征包括形状、结构、颜色和大小等，进一步对分离的菌株进行正确定义。
常用的形态学特征包括：形态特征、结构特征、色素特征和大肠杆菌。
（二）生理生化特征鉴定法：通过菌株的生长特性在不同培养基中的表现，或菌体在不同生长条件下表现的生化过程，如碳源利用情况，氮源利用情况，温度和pH值的影响等，进行鉴定。
纤维素分解微生物的分离与鉴定
环境微生物技术实验总结报告一、国内外研究进展：①纤维素资源据不完全统计，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.8×1011 t，这些植物物质所含的能量相当于全球人类每年能量消耗量的20倍，食物中所含能量的200倍。
纤维素是构成植物细胞的基本成分，纤维素占全球植物总干重的30%一50%，是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物，它存在于所有植物当中。
在生物界中，结合于有机体中的碳达27×1010t，在自然界有机体中构成纤维素的碳约占40%，据此估算，在植物界中纤维素的总量约达26.0×1010t，而且自然界中的植物原料是年复一年地不断生长和更新的，可以说，纤维素在自然界中是一种最丰富的可再生的有机资源。
纤维素是一种不能被大多数动植物直接利用的多糖物质。
但对人类来说只要能将其降解成小分子物质，纤维素就会成为一种有广阔应用前景的资源。
而且这种潜在的资源数量是惊人的，其中的大多数作为绿色植物的成分在维持生态平衡中起作用而不宜利用，但是仍有数量可观的纤维素由人类生活和生产产生，它们主要存在于农作物秸秆和城市垃圾之类的废弃物中。
灾荒或战乱造成的粮食危机依然是正存在的和潜在的威胁;随着全球经济的飞速发展，地球上石油、煤炭的储量正以惊人的速度减少，能源危机成了世界大多数国家所面临的一个严峻问题;由于对资源的破坏性开采和利用，人类赖以生存的环境正在不断地恶化，对可再生资源利用的研究与开发的可持续发展战略己在世界各国逐步展开。
如何处理和利用废弃纤维素将成为一个十分紧要的问题。
②农业废弃物资源的利用现状植物纤维素资源的开发利用对解决粮食和能源短缺以及环境污染问题有极其深远的意义。
我国的纤维素资源极为丰富，每年的农作物秸秆产量达5.7x107吨，约相当于北方草原年打草量的50倍。
但是，农作物秸秆产生数量多且产生时间集中(每年到收获季节农村就会有大量的秸秆产生)，而我国的农作物秸秆主要用于燃料、畜禽饲料与自然堆肥，不仅利用效率低，而且随着农村生活水平的提高，农作物秸秆成为农村固体废弃物的主要来源。
纤维素分解细菌的分离和鉴定
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关键词 纤维 素降解细 菌； 离； 分 鉴定 中图 分类 号 Ｓ ８ 文献标识 码 Ａ １ ２
文章编 号 ０ １ — ６ １ ｏ９ ０ — ３５ — ４ ５７ ６ １（ ０ ）９ ０９６ ０ ２
Ｉ ｌｔ ｎａ ｔＩｅｔ ｍａｏ ｆ ｆｅｅｔＣ ｎ ｌｓ－ ｓ ａｉ ｎｉ ｄｎｉ ｔ ｎｏ ｔ ｉ ｅｕｏｅ￣ ｏ ｏ ｆ ｉ Ｅ＇ ｎ ￣ ｌ ｅｅｉ ｌｔ ａ ａ ｒ Ｕ Ａ ｈ ｔａ （ ｒ ｅＣｌ ｇ ｆ ｈｎ ｏｇＵ ｉ ｒ ｔ ａ Ｗｅ ａ， ｉａ，ｈｎｏ ｇ ６２９ ｓｉ ｌ Ｍａｉ ｏｌ ｅｏ ａｄｎ ｎｖ ｓｙ ｔ ｉ ｉＷｅ ｉＳａｄｎ ４０ ） ｅ ｎ ｅ Ｓ ｅ ｉ ｈ ｈ ２
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微生物分离纤维素降解菌的筛选与分离
微生物分离纤维素降解菌的筛选与分离纤维素是一种广泛存在于自然界中的有机化合物，它是植物细胞壁的主要组成部分。
纤维素具有高度的生物降解性，然而，其高度结晶性和复杂的结构使其难以被常规的酶解系统降解。
在生物领域中，微生物分解是一种有效且环保的方法，因此，筛选和分离纤维素降解菌对于提高纤维素降解效率具有重要意义。
一、筛选纤维素降解菌的方法1.1 培养基的选择筛选纤维素降解菌的第一步是选择合适的培养基。
常用的纤维素降解培养基包括CMC（羧甲基纤维素钠）、Avicel（微晶纤维素）、Whatman No.1滤纸等。
这些培养基能够提供纤维素降解菌所需的碳源和营养物质，有利于菌群的生长和繁殖。
1.2 筛选方法传统的筛选方法是利用纤维素作为唯一的碳源，在培养基中培养环境中的微生物，通过测定产酶能力来判断纤维素降解菌的存在。
常用的方法有：（1）红色亚甲基纤维素（RAC）将纤维素培养基添加亚甲基蓝等指示剂，在纤维素降解区域由蓝色转变为红色，表明纤维素被降解。
（2）半定量筛选利用葡萄糖法测定纤维素降解能力。
在培养基中添加不同浓度的纤维素，观察菌落的生长情况和菌液中的葡萄糖含量，评估纤维素降解能力。
（3）放射标记纤维素将放射性同位素标记在纤维素分子上，通过测定纤维素的解脱率来评估菌株的降解能力。
二、纤维素降解菌的分离与鉴定2.1 分离方法从自然环境中分离纤维素降解菌是筛选过程的关键步骤之一。
常用的分离方法包括：（1）稀释平板法将适当稀释的样品在纤维素培养基上均匀涂布，经过一段时间后，将生长的菌落分离并培养纯种。
（2）可溶性物质包埋法将样品与纤维素培养基搅拌均匀，接种到含有纤维素的胶状物上，培养一段时间后，可分离出纤维素降解菌。
2.2 鉴定方法为了确定分离的菌株是否为具有纤维素降解能力的菌株，需要进行鉴定。
常用的鉴定方法包括：（1）形态学鉴定观察菌落的形态、颜色和菌落边缘等特征，使用显微镜观察细胞的形状和结构。
（2）生理生化特性鉴定测定菌株的氧耗、氧释等生理特征，通过测定菌株对不同碳源和氮源的利用情况来判断其代谢特性。
文档：分离纤维素分解菌实验操作步骤
分离纤维素分解菌实验操作步骤实验的具体操作步骤如下1.土样的采集土壤中的微生物，大约70%～90%是细菌。
细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表约3～8cm的土壤层。
因此，土壤取样时，一般要铲去表层土。
另外，土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。
2.选择培养3.富集培养在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前，先通过选择培养增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。
富集培养所需要的仪器有：250ml锥形瓶、天平、药匙、玻璃棒、电炉、摇床、玻璃珠、称量纸等。
选择培养基的制备比例见下：纤维素分解菌的选择培养基纤维素粉 5gNaNO31gNa2HPO4•7H2OKH2PO4MgSO4•7H2OKCl酵母膏水解酪素将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1000ml按上表比例配制50ml选择培养基。
在250ml锥形瓶中装入50ml培养基，放5～6颗玻璃珠，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层牛皮纸，用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
称取土样20g，在无菌条件下加入装有50ml培养基的锥形瓶中。
将瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养3～4d，至培养基变浑浊。
4．梯度稀释所需仪器：试管（7支）、移液器、枪头。
需要先经高压蒸气灭菌的仪器：试管（每只内装9ml蒸馏水）、枪头（黄色、蓝色）。
用量程为1000µL的移液管从富集培养土壤液中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀。
然后换枪头从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml 无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液。
5.刚果红染色法分离与观察（涂布平板）所需仪器：无菌培养皿（12个）、涂布器（3个）、移液器、枪头、温箱等。
需要灭菌的仪器：无菌培养皿（12个）、涂布器（3个）、移液器、枪头。
筛选纤维素分解菌方法
筛选纤维素分解菌方法纤维素分解菌是一类具有良好纤维素降解能力的微生物，能够有效分解植物细胞壁中的纤维素，并将其转化为可利用的产物，如糖类和有机酸。
筛选纤维素分解菌的方法主要包括传统培养方法和分子生物学方法。
传统培养方法是最常用的筛选纤维素分解菌的方法之一。
首先，可以选择一些富含纤维素的底泥、土壤或植物残渣等样品作为菌种源，并在适当的培养基中培养。
然后，通过进行连续传代培养，筛选出具有较高纤维素酶活性的菌株。
常用的培养基成分包括纤维素、氮源、无机盐等。
培养过程中，可以通过测定菌株的纤维素酶活性来评估其降解能力。
常用的纤维素酶活性检测方法包括纤维素降解圈法和滴定法等。
分子生物学方法是近年来发展起来的一种筛选纤维素分解菌的方法。
这种方法利用纤维素酶基因的特异性序列，设计引物，并通过PCR扩增的方法进行筛选。
一般选择纤维素酶结构基因（如celA和celB等）作为目标基因，进行PCR扩增。
通过比较不同菌株的基因片段序列，可以筛选出具有较高纤维素降解能力的菌株。
此外，还可以利用转基因技术将纤维素酶基因导入到目标微生物中，提高其纤维素降解能力。
除了传统培养方法和分子生物学方法，还可以利用高通量筛选技术来筛选纤维素分解菌。
高通量筛选技术包括微流体技术、光学筛选技术和生物芯片技术等。
通过这些技术，可以快速并高效地筛选出具有较高纤维素降解能力的菌株，并进一步研究其降解机制。
总的来说，筛选纤维素分解菌的方法多种多样，其中传统培养方法和分子生物学方法是最常用的。
未来随着技术的进一步发展，相信会有更多更高效的筛选方法出现，有助于挖掘和利用更多具有纤维素降解能力的微生物，促进纤维素资源的利用和环境减排。
高二生物下册实验：分解纤维素的微生物的分离
高二生物下册实验：分解纤维素的微生物的别离高二生物下册实验：分解纤维素的微生物的别离(1)实验原理：①土壤中存在着大量纤维素分解酶 ,包括真菌、细菌和放线菌等 ,它们可以产生纤维素酶。
纤维素酶是一种复合酶 ,可以把纤维素分解为纤维二糖 ,进一步分解为葡萄糖使微生物加以利用 ,故在用纤维素作为唯一碳源的培养基中 ,纤维素分解菌能够很好地生长 ,其他微生物那么不能生长。
②在培养基中参加刚果红 ,可与培养基中的纤维素形成红色复合物 ,当纤维素被分解后 ,红色复合物不能形成 ,培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈 ,从而可筛选纤维素分解菌。
(2)实验过程：土壤取样：采集土样时 ,应选择富含纤维素的环境梯度稀释：用选择培养基培养 ,以增加纤维素分解菌的浓度涂布平板：将样品涂布于含刚果红的鉴别纤维素分解菌的固体培养基上挑选产生中心透明圈的菌落：产生纤维素酶的菌落周围出现透明圈,考试技巧 ,从产生明显的透明圈的菌落上挑取局部细菌 ,并接种到纤维素分解菌的选择培养基上 ,在30～37℃条件下培养 ,可获得较纯的菌种。
刚果红染色的两种方法的比拟：先培养微生物 ,在参加刚果红在到平板时参加刚果红优点显示出的眼神反映根本上是纤维素分解菌的作用操作简便 ,不存在菌落混杂问题缺点操作繁琐 ,参加刚果红溶液会使菌落之间发生混杂(1)由于琼脂和土豆汁中都含有淀粉类物质 ,可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反响(2)有些微生物具有降解色素的能力 ,长时间培养会降解刚果红 ,从而形成明显的透明圈 ,这些微生物与纤维素分解菌不易区分知识拓展：1.纤维素与纤维素酶(1)纤维素①化学本质：一种多糖。
②分布：棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物 ,此外 ,木材、作物秸秆等也富含纤维素。
(2)纤维素酶①习惯上 ,将纤维素酶分成三类：C1酶、Cx酶和葡糖苷酶。
C1酶是对纤维素最初起作用的酶 ,破坏纤维素链的结晶结构。
Cx酶是作用于经C1酶活化的纤维素、分解-1 ,4-糖苷键的纤维素酶。
分解纤维素的微生物的分离知识点
分解纤维素的微生物的分离知识点分解纤维素的微生物是指能够分解植物纤维素的微生物，包括细菌、真菌和原生动物等。
纤维素分解微生物的分离是研究纤维素降解的关键步骤之一，需要一系列技术手段和实验方法。
以下是关于纤维素分解微生物的分离的一些知识点:1.分离介质的准备：为了分离纤维素分解微生物，需要准备一定的分离介质，常用的包括CMC（羟乙基纤维素钠）、氧化纤维素、纤维素硝酸酯等。
这些介质能够提供纤维素作为微生物的唯一碳源，并通过对媒介上的纤维素降解能力的检测来筛选分解能力强的微生物。
2.样品的收集与预处理：从自然环境中收集样品，如土壤、水体、动物肠道等，作为分离纤维素分解微生物的样品。
对于不同的样品，需要进行不同的预处理步骤，如土壤样品可能需要先进行筛分、稀释等，以获取适合的微生物样品。
3.纤维素分解菌的分离方法：常用的方法有网状过滤法、稀释平板法、涂布法和固体培养法等。
其中网状过滤法是将含有微生物的溶液经过一系列的精细滤网，用含纤维素降解酶活性的培养基滴洒在滤膜上，等待菌落的出现。
稀释平板法是将经过适当稀释后的微生物样品均匀涂布在含有纤维素的固体培养基上，将纤维素分解菌形成的菌落分离开，纯化得到纯种纤维素分解菌株。
涂布法则是将含有微生物的溶液均匀涂布于含有纤维素的涂料上，使纤维素降解菌后来形成的菌落附着在涂料上，然后将涂料悬浮于培养基中，得到分离的纤维素降解菌株。
4.分离纯化：通过以上方法获得菌落后，需要经过反复的分离纯化步骤，包括连续经过固体培养基的孢子形成、接种至液体培养基、分几次进行稀释平板和观察等步骤，以得到单个纯菌株。
5.鉴定和筛选：通过形态学、生理学和生化学方法对分离得到的纤维素分解微生物进行鉴定和分类。
同时，通过测定其纤维素降解酶活性和产生的代谢产物，评估其纤维素分解能力和代谢途径。
此外，还可以使用分子生物学方法，如16SrRNA测序和PCR等，对分离得到的微生物进行进一步的鉴定和分类。
6.构建工程菌株：通过基因工程技术，可以将纤维素降解酶基因导入到高效率发酵菌中，构建高纤维素降解能力的工程菌株，用于工业生产等。
实验一 产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定
实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定一、实验目的1．了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2．掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。
二、实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。
这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。
在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要： 1. 内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、CMC 酶、EG。
这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素；2. 外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase,简称CBH）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子； 3. Β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.21，简称BG）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。
随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。
只有三种酶的协同作用，才能较好的分解纤维素。
就单菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高，产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。
本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长，利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。
以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为唯一碳源，通过微生物分解利用CMC-Na，分离出能产纤维素酶的菌种；刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色复合物。
专题二 课题3 分解纤维素的微生物的分离
（二）纤维素分解菌的筛选 。 1、筛选方法： 筛选方法： 2、筛选纤维素分解菌的原理 刚果红是一种染料，它可以与像 刚果红是一种染料， ， 这样的多糖物质形成 ，但并 不和水解后的 和 发生这 种反应。 种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加 入刚果红时， 入刚果红时，培养基中会出现以 为 中心的 。这样，我们就可以通过 这样， 圈来筛选 。
链接高考
2009年40.【生物 选修1 2009年40.【生物——选修1生物技术实践】（15分） 选修 生物技术实践】 15分 在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外， （1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外， 温度 还要考虑______ ______和渗透压等条件。 ______、______和渗透压等条件 还要考虑______、酸碱度 和渗透压等条件。由于该细菌 易培养 具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、______、 具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、______、 生活周期短 ______等优点 因此常作为遗传学研究的实验材料。 等优点， ______等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。 在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染， （2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染， 灭菌 需对培养基和培养皿进行________ 消毒、灭菌）； ________（ ）；操 需对培养基和培养皿进行________（消毒、灭菌）；操 消毒 作者的双手需要进行清洗和______ ______； 作者的双手需要进行清洗和______；静止空气中的细菌 可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性， 可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还 损伤DNA DNA的结构 损伤DNA的结构 __________。 能__________。
实验设计
1.实验流程 1.实验流程
桑粒肩天牛肠道木质纤维素分解细菌的分离和鉴定
清洁 的生物质能 成为 人们 关 注 的热 点 ， 中燃 料 乙醇 其
工 业在世界范 围 内得 到 了广 泛 的发 展 ， 以大 量 木质 而
纤 维 素 生 物 质 材 料 为基 础 的燃 料 乙醇 行 业 更 是 热 点 中 的 焦 点 。
护作用 ， 增加 酶与底 物的接触 面积 ， 而提 高酶解 的效 从
圈
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桑 粒 肩 天 牛 肠 道 木 质 纤 维 素 分 解 细 菌 的 分 离 和 鉴 定
刘 晨娟 蔡 。 皓 李 。 庆 喻子牛 。 （ ． 中农业 大学生命科 学技 术 学院 农业微 生物 学国家重点 实验 室 微 生物 农 药国家工程研 究 中心 ， １华 湖 北 武 汉 ４ ０ ７ ；． 中农业 大学理 学院 ， 北 武 汉 ４ ０ ７ ） ３００ ２ 华 湖 ３ ０ ０
０ ０ ３ Ｕ ・ ｍＬ （ ８ ｈ ， ． ６ ３Ｉ ４ ） 没有 检 测 到 过 氧化 物 酶 （ ｉ） Ｌ ｐ 活力 。
关键词 ： 粒肩天牛； 桑 筛选 ； 维 素 ； 质 素 纤 木
中图 分 类 号 ： ３ ． Ｑ９９１ 文 献标 识 码 ： Ａ 文章 编 号 ： ６ ２ ５ ２ （ ０ ０ ０ —０ ６ —０ １ ７ — ４ ５ ２ １） ７ ０ ６ ３
近年来 ， 全世 界对 能源 的需 求量急 剧增加 ， 速 了 加
对 有 限 的 不 可 再 生 矿 物 能 源 的 消 耗 。 因此 ， 再 生 的 、 可
高度结 晶 的特 性 ， 需要 进行适 当 的预处理 ， 以降低纤 维 素 的结 晶度 ， 加纤维 原料 的多孔性 ， 增 脱除 木质素 的保
土壤中纤维素分解菌的分离鉴定
土壤中纤维素分解菌的分离鉴定纤维素是植物细胞壁中最主要的组成成分之一，其分解可以释放丰富的能量和营养物质，因此纤维素分解菌对土壤生态系统具有重要作用。
因此，对于土壤中纤维素分解菌的分离鉴定，有助于深入了解其功能和生态学意义。
一、实验材料和方法1.实验样品本实验采集自我国典型红壤中的一些样品，土壤样本为表层土壤（0-15cm）。
2.分离方法对样品进行拔草、松散、天然干燥、筛分等处理，然后进行分离。
1）直接培养法：将半固态纤维素酵母提取培养基（CMC-Na：1.5g/L；NHa2PO4：0.5g/L；KH2PO4：0.5g/L；MgSO4：0.5g/L；FeSO4：0.01g/L；NaCl：0.5g/L；以及0.5％的琼脂）均匀涂布于含有纤维素的平板上。
在37℃恒温箱中孵育培养。
2）稀释培养法：起初将样品按比例加入到同等体积的0.85%氯化钠溶液中。
接着对稀释液进行梯度稀释，将每1ml的第-1-7次稀释到含有纤维素的琼脂平板上。
在37℃恒温箱中孵育培养集落。
3）筛选方法在进行分离后，筛选出7个形态和功能不同的菌落，进行细菌纯化。
然后，利用革兰染色法、生理生化实验和16S rRNA序列分析等方法进行鉴定。
二、结果及讨论1.分离菌株的特征我们通过实验分离出来7个不同的纤维素分解菌株，它们分别是：AT1、AT2、AT3、AT4、AT5、AT6和AT7。
在进行鉴定时，我们根据它们的形态特征、生理生化性质及16S rRNA基因序列，对其进行了系统的分类和鉴定。
菌株AT1，为革兰阴性杆菌，能够在CMC-Na离子互济培养基中发生较强的纤维素降解。
我们对其进行16S rRNA测序，发现与Salmonella sp. ATCC 43971的16S rRNA序列高度同源（99.7%）。
因此，我们认为其为一株Salmonella sp.的分解菌株。
2.纤维素分解菌株的多样性我们通过对红壤样品中纤维素分解菌株的分离和鉴定，发现其中的菌株分属于不同的细菌属，如Salmonella、Microbacterium、Pseudomonas、Bacillus、Acinetobacter、Streptomyces、Rhodococcus等，这表明纤维素分解菌株在细菌属的多样性方面具有很高的潜力。
土壤中分解纤维细菌的分离与性质鉴定
一、材料与方法
（一）实验主要材料：
1、杨凌地区六个不同点土样 2、增菌培养基（GN换用方）：
胰蛋白胨 葡萄糖 甘露醇 柠檬酸钠 磷酸氢二钾 氯化钠 蒸馏水 3、营养肉汤：蛋白胨 牛肉膏 氯化钠 蒸馏水 4、糖发酵培养基：蛋白胨 氯化钠 牛肉膏
琼脂溴甲酚紫 （在上述基础培养基中，加入所需糖类即可） 5、 赫奇逊培养基：KH2PO4 MgSO4·7H2O NaNO3
结果
产酸
蔗糖
阴性
—
葡萄糖
阴性
—
甘露糖
阴性
—
产气泡 — — —
（3）代谢产物中脂肪酸的检测
4、滤纸崩解试验结果
滤纸崩解前后对比
讨论
本实验根据纤维分解菌对滤纸崩解的作 用，利用土粒法从土壤中分离得到好气性 纤维素分解菌，对其进行了一系列形态及 生理生化特征的检测，初步确定是属于纤 维粘菌属，并用气相色谱仪鉴定其代谢产 物中高级脂肪酸的变化，表明此菌只产生 极量的HFA 、分别为棕闾酸、油酸、亚油 酸。最后通过滤纸崩解试验进一步验证并 粗略比较该菌对纤维素的分解能力。
— ☆☆☆
玉米地
☆☆
柏树林
—
烟草地
☆
（二）菌的微生物学特性
1.菌落描述
菌落
形状
边缘
色泽
湿润
凹凸
色素
a
圆
理化性质
（1）革兰氏染色镜鉴
菌
革兰染色
a
G+
c
G+
湿润 —
低凸面 扩展
黄色不扩散色素 —
形态 单个椭圆形，偶有成链状
棒状，成链状，不分枝
（2）糖类发酵试验（只对C菌）
糖发酵液
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纤维素分解细菌的分离和鉴定一．实验目的：1.研究低温环境下纤维素降解细菌的分离与鉴定．2.采用低温培养的方法从秸秆堆肥中筛选出3株分解纤维素的细茵。
3.通过PCR克隆这3株茵的16s rDNA并与相似菌株做比对．进一步构建分子进化树．来研究其分类情况。
4.综合其个体形态、茵落形态、生理生化特征、16S rDNA发育树构建结果等分类依据。
二．实验原理：细菌进行化能异养、短杆状、无出芽分裂、好氧、革兰氏染色阴性．无芽孢、无丝状菌体、有细胞壁且能独立生存。
应为其第二部分滑动细菌或第七部分的假单胞菌类。
由于滑动细菌能在“固体表面和汽一水交界面缓慢滑动”，故其固体菌落边缘应不整齐，且其一般形成亮色肉眼可见的子实体。
将灭菌的滤纸蘸取无菌生理盐水后贴在已凝固的平板上，用接种环蘸取土样，点样在平板滤纸上，15℃下培养10 d。
用接种环从有滤纸水解透明圈的单菌落处刮取细菌，在贴有滤纸的初筛平板上划线，计数并且观察。
三、实验仪器：1、材料试验材料为背阴处长时间堆放的秸秆堆肥表层；2、培养基：初筛培养基。
浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基”。
：啦嘞1．00 g，MgS04·7H20 0．30 g，NaCl 0．10 g，F'eCl3O．0l g，NaN03 2．50 g，CaCi2 0．10 g，琼脂18．00 g，蒸馏水l000lnl，pH值7．0～7．2．121℃灭菌20min。
无淀粉滤纸(浙江富阳纸厂)用浓度l％的醋酸浸泡一夜后用浓度2％的Na-2C03水溶液洗至中性，晾干备用。
把上述处理过的滤纸剪成直径约为8 ca的圆形滤纸片．放在干净的平皿中，用报纸包好．采用湿热的方法灭菌；3、复筛培养基。
浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基：啦P04 1．009，m．庐04‘7H200．309。
NaO 0．109．FeCl30．01g，NaN03 2．50 g．CaCl20．10g，羧甲基纤维素钠lO．00 g，琼脂18．00g，蒸馏水10130ml，pH值7．0—7．2，121℃灭菌20 min。
4、牛肉膏蛋白胨固体培养基；5、生理生化特征鉴定培养基。
四、实验步骤：1、菌种分离菌种初筛。
将灭菌的滤纸蘸取无菌生理盐水后贴在已凝固的平板上，用接种环蘸取土样，点样在平板滤纸上，15℃下培养10 d。
用接种环从有滤纸水解透明圈的单菌落处刮取细菌，在贴有滤纸的初筛平板上划线，15℃下培养10 d。
重复此操作至菌种初步纯化。
2、菌种复筛。
用接种环从已初步纯化的初筛平板上滤纸水解透明圈的菌落处，刮取菌种在复筛平板上划线，15℃下培养7 d，得到单菌落。
将分离纯化的单菌落回接到初筛培养基上，观察其对滤纸的分解。
将分离到的单菌落接种到牛肉膏蛋白胨培养基上。
15℃下培养7 d,4℃保留菌种或用作各种鉴定。
3、菌种形态观察个体形态观察。
对细菌进行革兰氏染色、荚膜染色和芽孢染色，观察结果；进行牛肉膏蛋白胨半固体培养基(含琼脂O．4％)穿刺接种，观察游动性；对菌体形态进行镜检，菌体大小采用数字显微图像处理软件MIE测量。
4、菌落形态观察。
在复筛培养基上15℃下培养7 d，进行菌落形态观察。
5、菌株最适温度与ph的测定将筛选菌株分别在II、15、20、25、29、37℃下涂布培养5 d(密度不可过高)，至少选取加个单菌落测量其直径，绘制3株菌的单菌落平均直径随温度的变化曲线，作为最适生长温度的参考。
同样．不同pH梯度下涂布培养5 d，测量单菌落平均直径，绘制其随pH的变化曲线，作为最适生长pH的参考。
6、生理生化特征鉴定采用“1．2．4”所述的生理生化反应鉴定培养基对筛选的3株菌进行鉴定。
7、16srDNA鉴定菌株VCR模板制备㈣9。
取培养3 d的平板单菌落悬于50m无菌蒸馏水中，于100℃水浴5—10 min，取出立即放置冰上，保存。
16S rDNA的PaR扩增与测序。
采用上海生工生物工合成的l对16S rDNA引PCR扩增条件：94℃预变性5 rain，94℃变性45 s．50℃退火45 s，72℃延伸，50 lll反应体系30个循环后再72℃延伸5 min。
8、序列比对与系统发育树的构建。
将测得的16S rDNA序列在Genlhnk上进行BLA．gI"比对，对获得的同源序列进行序列分析。
取同源性较高的不同种的模式序列(Type Strain)用MEGA 4。
10：进行多序列比对并构建系统发育树。
五、结果与分析：1、菌株的筛选通过菌株的初筛、复筛和同接试验，共分离出15种具有纤维素降解活性的菌株。
其中的13株细菌，分别命名为WHI—WHl3。
测量15℃下培养10 d的滤纸分解圈．WHl2平均为7．0咖．WH3为5．5 rrlin，Will为5．0 ml'n，其他菌株均在3．0 mm以下。
选取菌株Will、WH3、WHl2继续研究。
菌株wHl2对滤纸分解能力最强．15℃下培养10 d．该2、菌种形态观察结果1个体形态观察结果、通过染色，光镜(10×100)下进行形状观察和半固体培养基穿刺接种运动性观察．采用数字显微图像处理软件MIE对菌体大小进行测量，结果见表l。
3株菌均为革兰氏阴性杆菌，有荚膜．不产生芽孢．均呈杆状。
穿刺接种显示细菌沿穿刺线扩散，说明细菌口，能有鞭毛。
3、菌落形态观察结果。
对3株菌在复筛培养基上15℃下培养7 t，3株菌具有不同的菌落形态。
在复筛培养基上均为浅颜色，但在滤纸培养基上Will菌落为鲜绿色．WI-13为棕黄色。
WHl2为桔黄色。
生理生化结果显示，3种菌均能利用葡萄糖；能产生胞外呈阳性。
脂酶，但都不明显；能利用多种碳源。
WH!和WI-112能水解2．4培养特征测定结果明胶，即分泌胞外的蛋白酶；WH3和Wttl2则能水解蛋白胨中的色氨酸．产生吲哚反应；Will和WH3分解匍萄糖产酸，能使溴甲酚紫变黄(PH值5．2)但不能使甲基红变红(pH值=4．2)。
grill能分解硫代硫酸钠产生硫化氢。
4、最适生长温度。
在不同温度下培养，3株菌的培养曲用单菌落测量生长曲线虽不典型，。
但也能表现出菌的最适生长温度。
WHI和WH3在20℃左右菌落直径最大。
5、菌种鉴定上述试验结果表明3株菌进行化能异养、短杆状、无出芽分裂、好氧、革兰氏染色阴性．无芽孢、无丝状菌体、有细胞壁且能独立生存。
应为其第二部分滑动细菌或第七部分的假单胞菌类。
由于滑动细菌能在“固体表面和汽一水交界面缓慢滑动”，故其固体菌落边缘应不整齐，且其一般形成亮色肉眼可见的子实体。
Will、WH3和WHl2都未发现类似菌落特征。
故认为3株菌属假单胞菌类。
根据3株菌生化反应特征，氧化酶反应阳性和分解蛋白质，确定不属于黄单胞菌属和滑动单胞菌属，故可能为假单胞菌属和葡糖杆菌属。
6、16srDNA饼姨鉴定结果BLAST比对。
比对结果显示菌株Will的16S rDNA测试结果为I 442个碱基，共有198条序列最大相似度(Max ldent)在99％以上，几乎均鉴定为假睢胞菌属，涉及到已鉴定的12个种。
当前普遍观点认为：16SrDNA序列同源性大于99％，可以认为属于同一种；小于98％，则可认为属于不同的种；16S rDNA序列同源性小于95％，则可认为属于不同属：¨-I 3『。
由于假单胞菌属菌种相对较复杂，相似度为99％仍不能鉴定到种，但可以确定的是Will属于假单胞菌属，同时可进一步通过构建系统发育树寻求wHl与其他种可能的进化关系。
菌株WH3的16s rDNA测试结果为：l 443个碱基(Gen．Bank序列号：H262367)。
BLASI"GenBank 的基因序列后，分析确定WH3为假啦胞菌属。
菌株WHl2的16S rDNA测得l 439个碱基(GenBank序列号：H262368)。
BLAST GenBank的基因序列后分析确定WHl2。
仍为假单胞菌属。
7、系统发育树。
通过构建同属不同种序列的系统发育树可进一步鉴定菌株的种型。
通过在Ge删数据库的BLAST．选取同属已鉴定的所有不同种12条模式种序列。
通过MEGA 4的CLUbTALW 进行多序列比对并构建系统发育树。
由于这12条序列具较高的同源性(均在99％以上)，即进化距离较短，宜采用最小演化长度法(Minim,,,n Evolmion)构建L1 4。
，．经自举法(1kmtstmp Method)检验，该树基本正确。
一般认为，当一个给定的内部树枝的自举值为95％或者更高．才认为树枝结构正确-14一二所以不能鉴定WHI具体足Pseudornor船属的哪一种，为验汪假没的正确性，随机取假单胞菌科(Pseu(b咖哪Iaccac)的4个属(Pseudomonas、Xan thomonas、Zoogloea和C．1uconobacter)的菌株构建发育树，验证发现Will属于假单胞菌属的可信度为100％，则暂定Will名为Pseudomonas sp．strain Will。
与WH3 BLAST显示的共3个不同种．参考WHI，同样选择各个种的16S rDNA序列，采用MEGA 4通过最小演化长度法构建系统发育树，选取不同种各一条模式种基因序列，采用MF_EA4通过最小演化长度法构建系经自举法检验，发育树构建基本正确。
WI-112与WHI情况相似，很难据此确定为何种．但确定认为WHl2属假单胞菌属(Pseudomonas)，暂定名为Pmudomonas sp．血dill WHl20。
8、结论与讨论综合以上结果，菌株Will、WH3和WHl2经初步鉴定可能为假单胞菌属和(或)葡糖杆菌属的种，通过16S rDNA分析进一步确定该3株细菌均属假单胞菌WH3为恶臭假单胞菌。
未曾有关其降解纤维素的报道。
试验对其做的相关特性鉴定．个别鉴定结果不同：其所述生长温度有一定降低，最适生长pH值6．5偏酸性，个别生化试验结果不同。
筛选条件的不同町能会产生条件诱导，使菌株发生了变化，正在对其有关的纤维素酶进行提取。
结论有待进一步验证。
WHl2虽与Will、WH3同属假单胞菌属，且16S rDNA序列差别不大(与WH3两两对比相似度98％)，但各方面性状表现差别很大。
假单胞菌属如此之小的16S rDNA差别致使各种反应现象差别之大的原因，很值得深入探讨。