GS115毕赤酵母PEG感受态细胞
毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍
毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍由于甲醇营养型酵母菌体内无天然质粒,所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达。
整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。
典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列,主要的结构包括:5’AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3’AOX1基因片段,作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒,它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。
如果是分泌型表达载体,在多克隆位点的前面,外源基因的5’端和启动子的3’端之间插人了分泌作用的信号肽序列。
在这个分泌信号的引导下,外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外,将成熟的蛋白质分泌到细胞外。
为方便于操作,通常表达载体都是穿梭质粒。
表达载体与酵母染色体有单交换和双交换整合2种方式,单交换整合时,或插入A0X1位点,或插入his位点。
有文献报道,以his4作为整合位点时,染色体突变株与表达盒间存在基因转换,偶而可使Laz表达盒丢失,故AOX1位点更好。
一般认为,单交换转化效率比双交换效率高,且易得到多拷贝整合,其发生机制可能是重复单交换引起的。
携带外源基因的表达载体可通过电穿孔、原生质体生成法或全细胞法转化酵母细胞。
甲醇酵母转化和大肠埃希氏菌转化不同之处是前者较为复杂。
对于大肠埃希氏菌而言,只要把重组表达载体导入细胞体内即可。
因其载体上携带有自身复制原点,可随染色体复制而复制,重组表达载体能够稳定存在。
在甲醇酵母系统中,所有的表达载体均不含酵母复制原点。
这就是说,导入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源区发生重组,整合到染色体上,外源基因才能够稳定存在,外源蛋白才能得到稳定表达,这种整合的转化子一旦形成就非常稳定。
如果转化后的重组表达载体未能整合到染色体上,而是以游离的附加体形式存在,这种转化子就不稳定,重组表达载体极易丢失。
毕赤酵母感受态制作及转化
毕赤酵母感受态细胞制作1、GS115活化:100ml三角瓶中装入20ml YPD培养基,接种100ul菌保,过夜活化。
2、转接:500ml三角瓶中装入100ml YPD培养基,取1ml活化菌液接种到100ml YPD培养基中,培养至OD约为1.3-1.5。
3、收菌:将菌放置冰上15min,或者放于4°冰箱冷却。
一般100ml菌液可以制备4份感受态细胞。
将无菌水和过滤除菌的山梨醇(1M)提前置于4°冰箱冷却。
4、用100ml离心管收集菌体,4000rpm/min离心5min去除YPD培养基。
5、用20ml预冷的无菌水洗菌体,4000rpm/min离心5min,重复一次。
6、用20ml预冷的山梨醇洗菌体,4000rpm/min离心5min。
7、每个离心管中加入3ml预冷的山梨醇,重悬菌体。
7、将菌体分装至1.5ml灭菌离心管中,分装4管,4000rpm/min离心5min,弃上清。
8、每管加入80ul预冷山梨醇,重悬菌体,置于冰上待用或加入10%DMSO保存于-80冰箱。
毕赤酵母电击法转化1、将感受态细胞在冰上融化,电转杯和山梨醇在冰上预冷。
2、将80ul感受态细胞与5-10ug线性化质粒混合,转移至0.2cm电转杯中,置于冰上5min。
3、根据电转仪选择合适的程序,进行电击。
4、电击后立即加入500ul预冷的山梨醇,将电击杯中液体全部转移至无菌的1.5ml离心管中,30℃水浴2h。
5、将菌体低转速离心5min,吸出多余上清,留100ul涂板即可。
6、将菌液均匀涂布于His缺陷型培养基,30℃培养1-2天。
要准备灭菌的有:水,1M山梨醇,滤器,大离心管,1.5ml离心管,大小枪头,所有的离心都是低温离心。
毕赤酵母感受态细胞制备
1.毕赤氏酵母GS115感受态细胞制备
(1)从YPD平板上挑取单菌落2~3个于含25mL YPD的250mL三角瓶中,220r/min,30o C过夜(下午5点接,到第二天9点转接);
(2)取1mL 过夜培养物,接种含50mL 新鲜培养基(YPD)的250mL 摇瓶(接种两瓶,共100mL培养液),生长至OD600~1.3-1.5(4h左右);
(3)将100mL培养液分装于3个50mL离心管中,4o C,5000g离心5min,用少许预冷的灭菌水悬浮细胞后并于1管中,加预冷的灭菌水至20mL;
(4)如上离心,用10mL 预冷的灭菌水悬浮细胞;
(5)如上离心,用10mL 预冷的1 mol/L山梨醇溶液悬浮细胞;
(6)如上离心,用0.5mL 预冷的1 mol/L山梨醇溶液悬浮细胞。
2.转化(电击转化)
(1)取80μL上述细胞与10μL 线性化DNA混合,转入预冷的0.2cm电转杯中;
(2)在冰上放置5min;
(3)根据所使用电转仪制造商推荐的酿酒酵母参数进行电击细胞(1.5KV,6ms);
(4)立即加入0.9 mL 预冷的1 mol/L山梨醇溶液至杯中,将内容物转移至灭菌离心管中;
(5) 5000g离心5min,剩余200μL菌液吹吸重悬细胞,涂布1块MD平板;
(6)在30o C孵育平板至菌落明显形成(大约3~4天)。
毕赤酵母表达系统使用心得
Pichia酵母表达系统使用心得甲醇酵母表达系统有不少优点,其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知,并广泛应用于外源蛋白的表达。
虽然说酵母表达操作简单表达量高,但是在实际操作中,并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。
不少人在操作中会遇到这样那样的问题,收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。
其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学(Georgetown University)Lombardi癌症中心(Lombardi Cancer Center),部分用户来自国内。
+ 表示优胜于;- 表示不如;= 表示差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能:优点——使用简单,表达量高,His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会:巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种,一方面由于其是属于真核生物,因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰,另一方面毕赤酵母生长速度快,可以将表达的蛋白分泌到培养基中,方便蛋白纯化。
毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点(MCR)3'端带有his-tag和c-myc epitopes,这些tag有利于常规检测和纯化,而且在MCR5'端引入了alpha factor(α-factor)用以增加表达,并且在表达后α-factor可以自动被切除。
在进行克隆的时候,如果你选择的是EcoRI,那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。
另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记,而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。
第一步——构建载体Xiang Yang:pPICZ系列有许多克隆位点可供选择,同时也有三种读码框以便不用的用户需要。
毕赤酵母工程菌表达猪β-干扰素
毕赤酵母工程菌表达猪β-干扰素高智明;赵沁沁;张国华;闫达中;刘军【摘要】根据毕赤酵母密码子偏爱,人工合成了猪β-干扰素(PoIFN-β)基因,构建了重组载体pPICZA-PoIFN-β.重组载体经SacI线性化后,电击转入毕赤酵母GS115,对在含博莱霉素(Zeocin)平板上生长的转化子进行鉴定,得到分泌表达猪β-干扰素的毕赤酵母基因工程菌株GS115/pPICZA-PoIFN-β.以1%甲醇诱导GS115/pPICZA-PoIFN-β表达.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明,工程菌株实现了猪β-干扰素的高效分泌表达,表达产物为相对分子质量22ku和26ku的混合物,表达蛋白量约为80mg/L.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2014(033)004【总页数】3页(P44-46)【关键词】猪β-干扰素;分泌表达;毕赤酵母【作者】高智明;赵沁沁;张国华;闫达中;刘军【作者单位】武汉轻工大学生物与制药工程学院,湖北武汉430023;武汉轻工大学生物与制药工程学院,湖北武汉430023;武汉轻工大学生物与制药工程学院,湖北武汉430023;武汉轻工大学生物与制药工程学院,湖北武汉430023;武汉轻工大学生物与制药工程学院,湖北武汉430023【正文语种】中文【中图分类】Q78干扰素(interferon,IFN)是一类具有高效抗病毒、抗肿瘤及对免疫系统起关键调节作用的细胞因子[1-3]。
我国生猪产业庞大,而生存状况不稳定,其中猪病毒性疾病是重要影响因素之一,猪干扰素(porcine interferon,PoIFN)是预防和治疗猪病毒性疾病的一种有效的广谱抗病毒药物,市场对猪干扰素的需求量很大[4]。
已知的猪干扰素有α、β和γ3种,其中猪β-干扰素(porcine interferon-β,PoIFN-β)主要由成纤维细胞产生,具有诱导细胞产生多种抗病毒蛋白、增强自然杀伤细胞的活性及抑制白细胞增值等功能[5-6]。
毕赤酵母重组菌GS115—Ch—Glu发酵培养基设计及发酵条件优化
毕赤酵母重组菌GS115—Ch—Glu发酵培养基设计及发酵条件优化作者:冯爱娟吴酬飞王江海等来源:《湖北农业科学》2015年第05期摘要:以毕赤酵母重组菌(Pichia pastoris)GS115-Ch-Glu为研究对象,进行了亚麻子发酵脱毒工艺的研究,并对重组菌的发酵培养条件进行优化。
结果表明,毕赤酵母重组菌GS115-Ch-Glu发酵扩大培养的培养基最佳碳源为2.5%玉米淀粉,最佳氮源为5.0%黄豆粕。
优化后的基础发酵培养基发酵条件为温度28 ℃、转速250 r/min、发酵时间33 h、初始pH 6.5、接菌量1.5%、装液量50 mL/250 mL。
在此最佳发酵条件下,菌体产量为9.0×1010 个/mL。
关键词:毕赤酵母(Pichia pastoris);发酵条件;优化中图分类号:Q815 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2015)05-1155-04DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2015.05.032Abstract: Pichia pastoris GS115-Ch-Glu as a sort of useful recombinant yeast was used to detoxify in linseed. Its fermentation conditions were optimized. The results showed that the optimal carbon and nitrogen source were 2.5% corn starch and 5.0% soybean meal. The optimal fermentation conditions in basal medium were the temperature of 28 ℃, the speed of 250 r/min, the incubation time of 33 hours, the initial pH value of 6.5, the inoculation rate of 1.5% and the liquid volume of 50 mL/250 mL. Under these conditions, the fermentation yield of the cell production was per milliliter of 9.0×1010 strains.Key words: Pichia pastoris;fermentation condition;optimization亚麻子含多功能活性物质,其营养价值极高且具有多种临床应用价值。
GS115毕赤酵母表达菌使用说明
操作说明:
1,本品包含一份甘油菌,使用本甘油菌时可以不用完全融解,在甘油菌表
面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用,但随着冻融次数
的增加,细菌的活力会逐渐下降。
2,为保证菌种纯正,避免其它细菌污染,尽量先划平板,然后再挑单克隆
菌落进行后续操作。
养。细菌在 30-‐35℃培养箱中培养 24-‐48h,真菌在 23-‐28℃培养箱中培养 24-‐72h
(必要时,可适当延长培养时间)。
菌 株 传 代 :
将得到的菌株的新鲜培养物转接到适宜的固体培养基及液体培养基中(尽量 增大接种量:如用无菌吸管吸取≥50μl 新鲜培养物至固体培养基,边移动边缓 慢释放),适宜温度下培养,用以菌株的保藏、传代及制备工作菌株。 注 意 事 项 : 1、菌种活化前,将冷冻管保存在低温、清洁、干燥的环境中,长时间室温下放 置会导致菌种衰退; 2、冷冻管开封、冻干粉复溶、菌株恢复培养等操作应在无菌条件下进行; 3、一些菌种经过冷冻干燥保存后,延迟期较长,部分需连续两次继代培养才能 正常生长; 4、苛养菌的培养需采用含特定营养成分的培养基,敬请正确选择,不清楚时来 电询问; 5、某些厌氧菌的培养,自开封到接种完成,均需以无氧气体充填,以保持厌氧 状态;培养过程中亦要保持厌氧状态; 6、某些菌种,如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等需要 5-‐10%CO2 促 进生长; 7、如发现冷冻管盖松动、复溶液浑浊等异常情况,应停止使用对应产品。 8、部分菌种有致病性、扩散性,请专业人员在专业环境下有保护性操作。 保 藏 条 件 : -‐20℃保存(复溶液于 2-‐8℃保存) 保 藏 时 间 : 2-‐10 年,应根据菌种状况及时转接
冷 冻 管 开 封 :
毕赤酵母表达系统(学习资料)
毕赤酵母表达系统前言:所用表达质粒有pPIC3.5K,pAO815用于胞内表达,而pPIC9K用于分泌表达,所有载体均利用AOX1启动子来诱导高水平表达。
抗性选择:最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先对HIS+转化子进行选择,再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。
毕赤菌株表型:毕赤酵母菌GS115 及KM71 在组氨酸脱氢酶位点(His4)有突变,因而不能合成组氨酸,所有表达质粒都有HIS4 基因可与宿主进行互补,通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。
GS115 及KM71都可在复合培养基如YPD(YEPD)及含组氨酸的最小培养基中生长。
转化之前,GS115 及KM71 都不能在最小培养基中生长,因为它们是His-。
培养温度:毕赤酵母生长温度为28-30度(液体、平板、斜面)。
在32 度以上诱导生长时,对蛋白表达有害,甚至会导致细胞死亡。
贮存:贮存细胞几周或几月,用YPD培养基或YPD 琼脂斜面1 挑取所需菌株单克隆在YPD 平板上划线生长;2 挑取单克隆转移至YPD进行穿刺培养,30 度2 天;3 细胞在4 度可放几周几月或几年,存于-80度1 挑取所需菌株单克隆在YPD 中过夜培养;2 收集细胞,在含15%甘油的YPD 中悬浮至终OD600 为50-100(大约2.5-5.0×109细胞/ml);3 细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80 度。
注意:在4 度或-80 度长期保存后,用之前建议在MM、MD 或MGY 平板上划线培养以检测His+转化子的表型是否正确及其活力。
以质粒pPIC9K,酵母Pichia pastoris GS115为例说明做法。
载体pPIC9K酶切为点线性化质粒DNA:建议使用下列方法线性化载体以获得Mut+及Muts重组子,可能其中一个会比另一个更利于表达多拷贝重组子。
如果只想得到Muts重组子,使用KM71 菌株。
单个十字交换事件可比双重十字交换更容易、更有效地获得Muts重组菌(例如:插入A OX1或his4 而不是取代AOX1)。
酵母成型脂肪酶筛选方法
酵母成型脂肪酶筛选方法本文作者:朱珊珊、喻晓蔚、徐岩单位:江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室作为真核表达系统,巴斯德毕赤酵母表达系统正以其独特的优势和潜力得到广泛使用[1]。
本实验室在前期研究中,从一株酿造浓香型大曲酒酒曲中筛选获得的华根霉中克隆得到其脂肪酶基因proRCL(GenBank登录号No.EF405962),并在毕赤酵母中实现了克隆与高效表达[2]。
研究所用的表达载体pPIC9K含有一个来自于乙醇氧化酶Ⅰ(AOX1)基因的严格甲醇诱导型的强启动子pAOX1,但甲醇易燃,在工业放大过程中存在安全隐患。
pGAP是一种糖酵解中的关键酶――三磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAP)的启动子,在葡萄糖、甘油等基本碳源的存在条件下,能高效地组成型表达外源基因,在培养过程中不需更换碳源,简化了操作步骤,也更适合工业上的应用,因此我们考虑利用GAP启动子来构建组成型表达proRCL的载体。
外源基因整合入毕赤酵母,根据线性化位点位置的不同,将会导致两种整合入基因组事件――单插入与双交换的发生,产生两种不同的表型,即Mut+和MutS。
单插入事件通常会导致插入不同拷贝数的基因组,而双交换一般是将单拷贝外源基因整合入基因组。
多拷贝外源基因的整合可以提高外源蛋白的表达量,但是利用毕赤酵母表达系统进行定向进化的过程中,多拷贝的发生会干扰重组子的筛选,例如筛选酶活提高突变株时,拷贝数的增加也会导致酶活增高,从而干扰了酶活提高突变酶的筛选。
而利用商业化的pGAPZαA表达质粒无法产生双交换事件,为了同时利用启动子pGAP进行组成型表达筛选,以及将外源基因双交换整合入基因组产生单拷贝重组子,本文在保留了诱导型表达载体pPIC9K上的5′AOX1的基础上,将PCR得到的pGAP基因片段插入到5′AOX1序列之后,华根霉脂肪酶基因proRCL之前,通过载体与基因组之间的5′AOX1及3′AOX1区发生的双交换事件,将构建的组成型表达载体整合到酵母基因组中,产生MutS表型的菌株。
毕赤酵母表达知识
很好,需要好好研究一下原文地址:毕赤酵母表达知识01转载于丁香作者:思时尔非a.配制500×BIOTIN stock solution(0.02%)有这么3种方案:1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中,放过夜,基本就能溶;2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH,就很容易溶解了;3、水浴加热,温度不能高于50度。
D-生物素是具有生物活性的生物素,也就是vitaminH。
在毕赤酵母代谢过程中,作为多种酶的辅基起作用。
天然培养基中一般可以不单独添加,因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素,但是做高密度发酵还是必须要添加的。
b.有几个比较迷惑的问题请教大家:(很典型的小问题)1、制感受态细胞,OD多少比较好?pyrimidine 战友的方法:取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP 管中。
说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高,再高了效率会很低2、关于高效转化法,文献说用(LiAc),而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用,要用LiCl。
Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、YNB到底能高温灭么?有的说能有的说不能。
过滤灭菌的怎么操作?我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上,报纸包上,瓶盖放烧杯里单灭。
然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。
4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深,单灭则不会。
该115度还是121度灭?网上搜了下,都有人用!5、电转化参数用400欧还是200欧?有的用400,有的还专门说不是用400。
都是从园里看到的!电击参数:1.5KV,25uF,200欧姆(不是400)6、电转后,在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧?如果不想筛高拷贝的,是否PCR验证一下即可?网友的回答:ynb最好不灭菌,我是0.22um过滤处理的。
中国林蛙抗菌肽基因在毕赤酵母中的表达及其活性检测_乔红伟
收稿日期:2007-12-10基金项目:国家自然科学基金资助项目(30340087) 作者简介:乔红伟(1970-),女,博士。
*通讯作者,E -mail:han wy@中国林蛙抗菌肽基因在毕赤酵母中的表达及其活性检测乔红伟1,2,韩俊友1,赵瑞利1,胡 博1,谢 芳1,郑 伟3,雷连成1,江利娜1,韩文瑜1* (1.吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春130062;2.中国医学科学院实验动物研究所,北京100021;3.吉林省水产科学研究院,吉林长春130062)摘要:将中国林蛙皮肤抗菌肽基因(RC)克隆到毕赤酵母表达载体pP IC9K 上,使之准确融合于±交配因子分泌信号,然后通过电击转化毕赤酵母宿主菌GS115/H is -,构建pPIC9K /RC 。
将筛选出的高效表达的重组转化子用甲醇作诱导剂进行小瓶发酵,28~30e 诱导后,经T r icine SDS -PA G E 检测,表达产物在±信号因子引导下分泌到培养基中。
分泌到培养基中的表达产物能够抑杀细菌和抑制肿瘤细胞生长。
对酵母重组子用酵母染色体D NA 的通用引物和目的片段的引物进行PCR 扩增。
结果表明,中国林蛙皮肤抗菌肽基因能以单拷贝整合到毕赤酵母染色体基因组中并形成转录产物。
关键词:中国林蛙;抗菌肽;酵母表达;抑菌活性中图分类号:S859.797 文献标识码:A 文章编号:1005-4545(2008)06-0663-04Cloning and expression of antimicrobial peptide gene from Rana chensinensis in Pichia pastorisQIAO H o ng -w ei 1,2,H AN Jun -yo u 1,ZH AO Ru-i li 1,H U Bo 1,XIE Fang 1,ZH ENG Wei 3,LEI Lian -cheng 1,JIANG L-i na 1,H AN Wen -yu 1* (1.College of Am inal Science and Veterinary M edi -cine,J ilin Univ er sity ,Chang chun 130062,China;2.I nstitute of L abor atory A nimal S ciences,Chinese A cademy of M edical Sciences (CAM S)&P eking Union M edical College (P UMC),Beij ing 100021,China;3.A quatic Research I nstitute in J ilin P rovince,Chang chun 130033,China)Abstract :A no vel antibacter ial peptide gene of Rana chensinensis skin w as iso lated throug h RT-PCR and clo ned into plasmid pPIC9K to construct pPIC9K /R C.T he r eco mbinant ex pr essio n plasmid was tr ansfo rmed into Pichia p astor is GS115/His -yeast st rain by the electro po ratio n.T he select ed reo rg anization wit h hig h ex pression was in -duced by methano l in 28~30e .T hroug h T ricine SDS -P AG E,ex pr essio n pr oduct w as secr eted into medium by the guidance of ±sig na l factor w ith bio lo gical activ ity o f antibacterial and antitumor .T he po sitiv e clo nes o f w hich the chr omosomes w er e int eg r at ed with antibacterial peptide gene o f R ana chens inens is skin wer e identified by the pheno -ty pe and PCR.T he results sho wed t hat antimicr obial peptides of Rana chensinensis skin w ere integr ated to the chr o -mo so mes o f Pichia p astor is w ith single -co py g enes and presented the transcr iptio n pro ducs.Key words :R ana chensinensis ;antimicro bial peptide;ex pression in Pichia p as toris ;ant ibacter ial act ivity *Cor r esp onding author ,E -mail :hanw y @j lu.ed 抗菌肽在自然界分布极为广泛,从原核生物到人类的所有界、门的各种组织、器官中均有发现,目前,已经测定了几百种不同抗菌肽的肽链序列;它们在长度、序列和结构上明显不同,但具备2个共同特征:阳离子肽;活性结构为两亲性。
毕赤酵母组成型高效表达启动子的筛选鉴定
毕赤酵母组成型高效表达启动子的筛选鉴定石义超;王凤忠;江均平;朱利泉【摘要】为获得高产量、高活性的葡萄糖氧化酶(GOD)酵母表达菌株,优化了GOD的T132S/T56V双突变编码序列,将之克隆到表达载体pGAPk上得到表达载体pGAPk-h2-GOD,以pGAP启动GOD基因的表达.将pGAPk-h2-GOD上的pGAP启动子替换为pGCW14和pAOX1,并对pGCW14启动子进行改造,得到3种pGCW14的改造体,最终得到包括pGAPk-h2-GOD在内的6种不同启动子的重组表达载体.将这6种载体转化毕赤酵母GS115,建立了一种简便高效的筛选方法初步筛选出GOD重组菌株,再对筛选到的转化子进行发酵培养,测定发酵上清液的GOD酶活力,以此来比较各种启动子启动效率的强弱.结果显示:pGCW14的启动效率是pGAP的3~5倍,改造后的启动子pGCW14+ G20A/C-467T(0.767)和pGCW14-UA(0.689)的启动效率较原始的pGCW14(0.574)都有明显的提高,尤其pGCW14+ G20A/C-467T启动效率最高,比原始pGCW14提高了32.5%左右.与诱导型启动子pAOX1 (1.187)相比,pGCW14+ G20A/C-467T(1.109)的启动效率仅比其低6.6%左右.结论:改造后的启动子可望在毕赤酵母组成型高效表达的研究应用中具有一定的前景.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2018(039)013【总页数】7页(P110-116)【关键词】葡萄糖氧化酶;巴氏毕赤酵母;启动子pGCW14;组成型表达【作者】石义超;王凤忠;江均平;朱利泉【作者单位】西南大学农学与生物科技学院,重庆400715;中国农业科学院农产品加工研究所,北京100193;中国农业科学院农产品加工研究所,北京100193;西南大学农学与生物科技学院,重庆400715【正文语种】中文【中图分类】TS201.3随着基因工程技术和蛋白异源表达的飞速发展,越来越多的表达系统被建立并得到广泛应用。
毕氏酵母(Pichia_pastoris)感受态细胞制备及转化 (1)
毕氏酵母(Pichia pastoris)感受态细胞制备及转化1、毕氏酵母氯化锂转化法(1)试剂1M LiCl(用去离子蒸馏水配制,滤膜过滤除菌;必要时用消毒去离子水稀释)50% PEG3350(Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制,滤膜过滤除菌,用较紧的盖子的瓶子分装)2mg/ml salmon sperm DNA / TE(10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA)-20℃保存注:醋酸锂对毕氏酵母无效,仅氯化锂有效;PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用;(2)感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中,30℃摇菌过夜(约24~28h)培养到OD 值为0.8~1.0(约108 Cells/ml);收获细胞,用25ml无菌水洗涤一次,室温下1500g离心10min;重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中,将悬液转入1.5ml离心管;离心机最大速度离心15秒沉淀菌体,重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中;按50ul/管分装,立即进行转化;注:不要将感受态酵母菌冰浴;(3)毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min,迅速冰浴以制备单链担体DNA;将感受态酵母菌离心,以Tips去除残余的LiCl溶液;对于每一个转化,按以下顺序加入:50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5~10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀(约1min);30℃水浴孵育30min;42℃水浴热休克20~25min;6000~8000rpm离心收集酵母菌体;重悬酵母于1ml YPD培养基,30℃摇床孵育;1~4h后,取25~100ul菌液铺选择性培养基平板,于30℃培养2~3天鉴定;2、毕氏酵母PEG1000转化法(1)试剂缓冲液A:1.0M Sorbitol,10mM Bicine,pH8.35(sigma),3%(v/v)ethylene glycol 缓冲液B:40%(w/v)PEG1000(sigma),0.2M Bicine,pH8.35缓冲液C:0.15M NaCl,10mM Bicine,pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO,-70℃保存注:缓冲液A、B、C均用滤膜过滤,-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处(即使在冰上解冻的待转化细胞,其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降;如进行多样品的转化,建议按6样品/组进行);(2)待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板,30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中,30℃振荡培养过夜;取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养,待其OD值从0.1升到0.5~0.8;室温下3000g离心收集酵母菌体,50ml缓冲液A洗涤一次;重悬菌体于4ml缓冲液A中,按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中,每管加入11ulDMSO,混合后迅速于液氮中冷冻,-70℃保存(3)毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中,直接加于冻结的酵母细胞中;加入担体DNA(40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA)以获得最大转化率;37℃水浴孵育5min,中间混合样品1~2次;取出离心管,加入1.5ml缓冲液B,彻底混匀;30℃水浴孵育1h;室温下2000g离心10min,去除上清液,菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中;离心样品,去除上清液,轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中;将所有转化液铺于选择性平板,于30℃孵育3~4天后,鉴定;3、毕氏酵母电转化法(1)E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液,接种于200ml LB液体培养基中活化培养,37℃,200 rpm,16~18小时。
毕赤酵母实验操作技巧介绍材料
颍上新城质差室分分析案例摘要:随着VOLTE百日大会战的开启,我部对阜阳质差室分进行摸排分析,目前质差室分原因主要为馈线问题、室分泄漏、宏站与室分切换等,针对不同原因,采用工程维护、RF及工参优化等手段进行改善。
关键字:馈线问题、室分泄漏、工程维护、RF及工参优化【故障现象】:3月上旬,发现该XY-FY-颍上-颍上新城-HFTA-436961-3小区室分MR 覆盖率仅为90.1%,该室分覆盖东西两栋30层高层,其中1-4F为商场部分,未做室分覆盖,采样点较少。
【原因分析】:此类室分质差主要从以下几点分析原因:(1)是否存在告警及馈线驻波告警;(2)室分泄漏;(3)室内外切换重选参数是否合理;(4)馈线故障。
1.原因排查:(1)对该小区进行告警排查及驻波测试,无异常,驻波均值正常值范围内,如下图所示:(2)针对是否存在室内泄漏,对该小区周边楼宇进行测试,周边楼宇主要占用的信号为1.8G宏站FY-颍上-鑫都华庭-HFTA-437970-61、FY-颍上-颍上荣禾绿园-HFMA-436418-55。
XY-FY-颍上-颍上新城-HFTA-436961-3主要为平层覆盖,为发现室分泄漏。
(3)对颍上新城进行室内摸排,测试过程中,主要占用为室分信号,切换无异常,该楼宇室分覆盖如下所示:根据设计图纸及网管资料,该室分系统主要覆盖东西两单元30F及地下车库,现场摸排中发现,RSRP均值为 -75dbm,SINR均值为28dbm,室分整体覆盖良好,其中东西单元1-4F电梯室分覆盖效果较差,平均RSRP均值为-108dbm,SINR均值为2dbm,西单元的10-11F主要为宏站信号,该层怀疑为室分馈线故障导致,如下所示:并且根据设计图纸,该楼宇存在地下停车场,对该区域进行测试,发现,由于纠纷问题,原覆盖新城1-4F的商场部分的XY-FY-颍上-御水兰庭-HFTA-437017-2室分,未能覆盖该区域,该设备位于负一层电梯口附近的弱电井,设备AB口为临时接的蘑菇头,该设备只能覆盖电梯口至地下停车场之间走廊的部分区域,剩余区域则为弱覆盖区域,主要占用信号为为地下停车XY-FY-颍上-颍上新城-HFTA-436961-3室分覆盖,平均RSRP均值为-105dbm,SINR均值为6dbm。
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GS115 毕赤酵母PEG感受态细胞
组成规格:
货号名称规格数量
GT2504 GS115酵母感受态细胞50ul 20支
GT2505 GS115酵母感受态细胞50ul 50支
GT2506 GS115酵母感受态细胞50ul 100支
为了满足广大科研工作者对大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母和农杆菌等菌种感受态细胞的需求,华越洋现推出各种系列的感受态细胞供大家选择。
毕赤酵母感受态细胞试剂盒
1 介绍
本试剂盒包括酵母感受态细胞、Solution 1和Solution 2。
其中酵母感受态细胞是用于转化的细胞,需-70度低温保存;Solution 1和Solution2为转化时使用的试剂,均为无菌,需-20度保存,使用时解冻即可。
本酵母感受态细胞采用专利技术制备的感受态,有别于传统山梨醇制备的感受态细胞,并配有Solution 1和Solution 2,可直接用于热击法转化,而不需要使用电转仪和电击杯。
本方法是电击法的替代方法,也避免了LiCl方法需要现制备感受细胞的繁琐。
转化效率可以达到102-103cfu/ug线性化DNA,经本公司反复验证-80保存6个月不影响转化效率。
2 转化步骤
2.1 线性化质粒片段的制备
取过夜培养的质粒菌种3ml,使用质粒抽提试剂盒抽提质粒,最后溶解于50ul的TE或水中。
将所有的质粒片段在200μl的体系中酶切线性化。
用酚氯仿试剂去除蛋白并且浓度片段至20ul体系中(保证有100μg的质粒片段)。
2.2 转化
2.2.1直接加于冻结的酵母细胞中,以获得最大转化率;(注意加入至冻结的细胞中,而不是解冻的细胞中);
2.2.2. 加入后迅速放入37℃水浴孵育5min,中间混合样品1~2次;
2.2.
3. 取出离心管,加入1.5ml Solution 1,彻底混匀;(注意可以弹或移液器轻轻混合,不可用移液器剧烈来回混合也不可用涡旋振荡器) ;
2.2.4. 30℃水浴孵育1h;
2.2.5. 室温下2000g离心10min,去除上清液,菌体沉淀重悬于1.5ml Solution 2中;
2.2.6. 离心样品,去除上清液,轻微操作将样品重悬于0.2ml Solution 2中;
2.2.7. 将所有转化液铺于选择性平板(例如MD板),于30℃孵育3~4天后,鉴定;
3 注意事项
1.转化步骤1中DNA要加入至冻结的细胞中,注意不可解冻细胞后再加入DNA;
2.转化步骤2中混合样品是必需的;
3.转化步骤3中要充分混匀,但不可剧烈混合;
4.所有混合细胞均要轻柔;。