可转化人工染色体文库研究进展

[收稿日期]20061023　[基金项目]中国博士后科学基金项目(5366);湖南省省级重点实验室科研项目(5F 35)　[第一作者简介]曹筑荣(),男,湖南衡阳市人,国防科学技术大学计算机学院在读硕士生　[通讯作者]曹孟良(65),男,湖南长沙市人,农学博士,国家杂交水稻工程技术研究中心研究员,@可转化人工染色体文库研究进展 曹筑荣,王正华　(国防科技大学计算机学院,湖南长沙410073) 曹孟良　(国家交杂水稻工程技术研究中心,湖南长沙410125)[摘要]综述了可转化人工染色体(tra ns f ormation 2competent ar tificial c hromosome ,TAC )载体的发展、TAC文库的构建程序及TAC 载体系统在植物基因克隆中的应用。

[关键词]可转化人工染色体;基因组文库;图位克隆[中图分类号]Q785[文献标识码]A [文章编号]16731409(2006)04020104构建基因组DNA 大片段插入文库对于真核生物的物理作图、图位基因克隆、基因结构及功能分析等研究具有重要作用。

基因组文库的发展主要依赖于克隆载体的发展。

构建基因组文库的载体很多,载体的种类、用途、克隆容量和克隆效率也随着研究的需要而迅速发展。

最早使用的λ噬菌体、co smi d 载体由于容量有限(λ噬菌体24kb 左右,cosmid 35～45kb )而限制了它们的应用[1]。

随后发展起来的酵母人工染色体(yeast art ificial chromo some ,YAC )、细菌人工染色体(bacterial a rtifici al chromo some ,BAC )和P1人工染色体(P12derived artificial chro mosome ,PAC )等[2,3,4],它们容载大片段DNA 的能力大大增加,使构建高等真核生物的基因组文库成为可能。

应用这些载体已成功地构建了很多生物的基因组文库[5～8]。

这些载体在基因组时代,对完成基因组的测序和作图起了重要作用。

但在后基因组时代的今天这些载体缺陷日益凸现。

对基因功能进行快速鉴定和分析时,使用这些载体构建的文库需要进行繁琐的亚克隆和功能互补实验,不仅工作量大,而且有遗漏目的基因的可能。

因此,具有植物功能转化的双元细菌人工染色体(bi nary B AC ,B I B AC)和可转化人工染色体(t ransformation 2compet ent artificial chromosome ,TAC)便应运而生[9,10]。

1　TAC 载体的发展Liu 等[10]结合PAC 载体和双元载体的特点,构建了载体p Y L TAC7,其结构如图1。

它具有以下特点:(1)具有H i n d Ⅲ和B am H Ⅰ等多克隆位点,有利于各种不同的酶切片段插入。

(2)具有P1复制子和Ri 质粒p Ri A4复制子,能在大肠杆菌和农杆菌中以单拷贝的形式穿梭复制。

因此在获得候选克隆后,不必进行亚克隆,而可以直接进行植物功能转化,大大加速了工作进程。

(3)重组筛选标记是卡那霉素基因(Ka n r )和蔗糖致死因子(s acB )。

sacB 基因编码果聚糖蔗糖酶(Levansurase ),催化从蔗糖转移果糖残基到各种受体蛋白上,影响受体的正常功能。

在含有5%蔗糖的培养基上,s acB 基因产物能使大肠杆菌和农杆菌致死。

当外源DNA 片段插入到p Y L TAC7的克隆位点后,sacB 基因失活,阳性克隆可以在含5%蔗糖的培养基上生长,而未插入外源片断的阴性克隆致死。

利用Ka n r 和s acB 的双重选择,可以减少假阳性的几率,更有利于筛选。

(4)在T 2DNA 右边界插入了植物筛选标记潮霉素磷酸转移酶基因(h pt ),在Pnos 启动子作用下发挥作用。

(5)含有P1裂解复制子,通常情况下是低拷贝质粒,但在IP T G 诱导下产生多拷贝,有利于克隆DNA 的提取和文库筛选[10]。

由于Pnos 启动子在单子叶植物中的启动能力较弱,Liu 等[11]对p Y L TAC7进行了改造,构建了TAC 载体p Y L TAC17。

p Y L TA C17选用水稻肌动蛋白Act I 强启动子,更适合构建单子叶植物,如小麦的文102长江大学学报(自科版)　2006年12月第3卷第4期农学卷Journal o f Yangtze U niver sity(N a t Sci Edit)　Dec 12006,Vol 13No 14A gr i Sci V 2000790J401982.19mlc ao h hrrc.co m.库[12～14]。

把植物筛选标记由h p t 替换为ba r 基因[11]。

bar 基因编码对磷化麦黄酮(PP T )和双丙胺类(bi 2alap hos )除草剂的抗性,适合用作禾本科作物转化体的选择。

Li u 等用p Y L TAC17载体构建了普通六倍体小麦的基因组文库,对部分较大插入片段克隆的遗传稳定性分析表明TAC 也存在插入子重组现象[12]。

然而用ba r 基因作为筛选标记基因,在进行候选克隆的功能互补转化中,存在筛选困难、假阳性率高、有基因型限制等问题。

因此,为了适合不同受体材料的筛选,以h pt 为植物筛选标记,构建了载体p Y L TAC27。

Li u 等以p Y L TAC27构建了“明恢63”基因组文库,该载体可以高效率的应用于单子叶植物的基因图位克隆和功能分析[11]。

图1　pYL TAC7物理图谱Figure 1　pY LT AC7physic al maps生物的大部分性状由多基因控制,生物工程研究正从单基因导入转向多基因导入。

Li n 等[15]用受体载体p Y L TAC747和供体载体p Y LV 、p Y L SV ,建立了能高效连接和转移多个基因的多基因排列和转化载体系统。

Cre /lo x P 重组系统和寄主体内的核酸内切酶能够使基因排列,因此可使多个基因一次转移到p Y L TAC747载体,再将含有多个外源基因的TAC 克隆转化植物。

2　TAC 文库的构建211　TAC 载体的制备采用碱裂解法大量提取TAC 载体,CsCl 连续梯度进行纯化,用H in d Ⅲ完全酶切后,用H K 去磷酸化酶处理。

载体制备的好坏直接关系着文库中空白载体的比例和文库的质量。

载体的纯度越高,获得阳性克隆就越多,文库的质量也越好。

为减少文库空载率,对载体进行脱磷是很必要的[16],脱磷后的载体很容易降解,不能在-80℃长期保存[17],不能多次冻融,冻融2次的载体效率会大大降低,应该弃用[18]。

212　高分子量DNA 的制备制备高分子量DNA 时,一般使用液氮将组织捣碎,而且在研磨过程中使组织浸在液氮中。

为了保护核DNA 免受降解,常采取将细胞核包埋在低熔点琼脂糖中形成plugs 或与低熔点琼脂糖、矿物油混合形成microbeads [16]。

2.3　高分子量DNA 的部分酶切对核DNA 进行部分酶切,其目的是产生大小比较集中的片段,根据需要的片断大小选择最佳的酶用量。

一般采用两次脉冲电泳进行片段选择[16,17,19,20]。

2.4　大片段D N A 与载体的连接大片段DNA 与载体的连接效率高低主要取决于插入DNA 片段与载体的比例。

因此大量连接前要设置一些不同的比例,摸索最佳的连接条件。

连接在10℃、16℃和20℃之间进行温度变换,使得各种不同大小的片段都能在最合适的温度下进行连接,提高了连接效率[21]。

2.5　带有外源片段的载体转化到感受态细胞电转化效率与插入片段大小有关,插入片段越大,转化效率越低;插入片段越小,转化效率越高。

2.6　阳性克隆的保存阳性克隆的分检有人工和机器手两种。

采用单克隆方法保存文库既费时又费力。

对于克隆规模非常大的文库,采用克隆池的方法不失为一个好的选择[22]。

3　TAC 文库的鉴定文库构建完成以后,需要对文库进行评价,评价一个T 文库质量高低的标准是文库中克隆的数202　长江大学学报(自科版)2006年12月AC目、插入片段大小、细胞器DNA 的含量及假阳性的比例。

目前,应用TAC 载体已成功构建了拟南芥[10]、小麦-簇毛易位系6VS /6A L [12]、高抗黄矮病基因的小麦-中间偃麦草易位系[13]、籼稻品种H359[23]、稻瘟病[24]、百脉根[22]、水稻[25]、桃[26]、六倍体小麦[27],番茄[28]等的基因组文库。

4　TAC 文库在植物基因克隆中的应用目前植物基因克隆的方法主要有功能克隆法(f unctionalclo ni ng)、表型克隆(phenot ype cloni ng)、mRNA 差异显示法(mRNA differenti al display )、缩减杂交法(subt ract ive hybridization )和图位克隆法等[29～32]。

由于高等动植物的基因组结构非常复杂,许多基因的作用机制未知,这给“新”基因的克隆带来了困难,图位克隆法的出现给这一问题带来了希望。

应用图位克隆法进行植物基因克隆,其成功与否或效率高低的关键因素往往在于能否高效地将候选克隆DNA 片段进行互补实验,以确定目的基因的特定片段。

目前YAC 、BA C 的图位克隆效率不高,这是因为Y AC 、BA C 不是植物基因载体,不能直接进行转化互补实验,并且常用于转化植物的载体携带的图2　基于TAC 载体的图位克隆Figure 2　Positon cloning ba sed on T AC ve ctorDNA 片段又较小,一般不超过25kb 。

用克隆容量小的载体构建适于植物转化的小片段DNA 亚克隆文库不仅增加了工作的难度和工作量,还可能遗漏失去目的基因[22]。

这也是国内外研究人员这些年应用图位基因克隆很少成功的主要原因之一。

可转化人工染色体TAC 正是出于解决这一难题而设计的。

TAC 能够携带大片段的DNA (100～300kb ),且具有植物转化的功能,将之应用于图位克隆中,无疑大大简化了工作程序,减少了基因克隆数,从而提高研究的效率和成功率,基于TA C 载体的图位克隆[33]如图2所示。

已有研究表明,应用TAC 系统,能够成功地将外源DNA 片段转移到植物并进行表达和功能互补实验。

刘耀光等[25]已高效地将多个TAC 克隆大片段插入子完整地转移到拟南芥基因组中,获得了上千个转化体并成功地将含有重力感应基因SGR 1的大片段(80kb )TAC 克隆转化到拟南芥重力感应缺陷型,使之恢复了对重力的感应性。

此外,基于TAC 载体水稻大片段DNA 转化已获得成功,在水稻、小麦等植物的基因克隆中的应用研究也在进行[34]。