红花高效液相色谱指纹图谱的研究21页PPT
中药材高效液相色谱指纹图谱研究概述
指 纹图谱 ： 色谱条件 ， 依利 特 Ｋ ｒ ｏ ｍ ａ ｓ ｉ ｌ Ｃ １ ８ 色谱 柱 （ ２ ０ ０ ｍ ｍ Ｘ ４ ． ６ ｍｍ， ５ ｍ） ； 柱 温 ４ ０ ℃； 流 动相 为 甲醇 （ Ａ相 ） 、 ６ ｍ ｍ ｏ ／ Ｌ— Ｎ ａ Ｈ Ｐ Ｏ （ Ｂ相 ， Ｈ Ｐ Ｏ 调 ｐ Ｈ ６ ． ５ ） ， 梯 度 洗脱 。流速 ０ ． ６ ｍ ｌ ／ 分； 检测 波 长 分段 用
科研人员对 指纹 图谱分 析技术 进行 了大
量研究 ， 取得 了可喜 的成绩 。中药指纹 图
谱 的研究 已经从早 期 只对单一 谱 图进行
简单评述 的阶段 ， 发展到利用计算机技术
雷海 民等 ｊ 报道， 不 同产地 牛 蒡 子
药材 Ｒ Ｐ—ＨＰ Ｌ Ｃ指 纹 图谱 研 究 ， 由于采 用梯度洗脱 的方式 ， 各批次供试 品指 纹图 谱 中色谱峰保 留时间可能不一致 ， 故 相似 度计算时未采用 自动校正方式 ， 而是使 用
获 取 的 色谱 条 件 ， 供 试 品 制备 方 法及 评 价
研 究等 ３个 方 面进 行 阐述 。结 果 ： 中药 指
数的一致性 ） ， 且稳定， 制 定 的指 纹 图谱
可对 白术药材组 分群体 特征 的一 致性作 出判断 。白术指 纹 图谱 有 自身化 学条码 的特征 ， 是其 内在化学成分种类与数量 的
色谱指纹图谱 ， 流速 ０ ． ５ ｍ ｌ ／ 分， 检 测波长 ２ ５ ０ ｎ ｍ， 其他色谱条件与 白术基本相 同。
李小 燕 等 报 道 ， 广 西 粉葛 药 材 高 效液相色谱指纹 图谱 的研究 ， 用 乙腈 一 ０ ．
红花注射制剂有效成分含量测定与HPLC指纹图谱的研究_张林
Determination of active ingredient and HPLC fingerprint in safflower injection forms
ZHANG Lin, DU Shou-ying, LU Yang, WANG Zhen, LIU Chang, TIAN Zhi-hao
· 3528 ·
当代医药论丛杂志
·论著·
Hale Waihona Puke 红花注射制剂有效成分含量测定与 HPLC指纹图谱的研究
张林，杜守颖，陆洋，王振，刘畅，田志浩
（北京中医药大学，北京 100102）
摘要：目的：建立测定红花注射制剂中羟基红花黄色素A（HSYA）的高效液相色谱法和总黄酮的紫外-可 见分光光度法，并研究注射用红花黄色素指纹图谱，以提高红花注射制剂质量标准。方法：采用Merck KGaA Hibar-C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相乙腈-含0.5%三乙胺的1%冰醋酸溶液（9∶91），流速1.0mL/ min，波长403nm，测定HSYA；使用紫外分光光度计，波长403nm，测定总黄酮；使用Synergl 4μm Hydro-RP 80A 色谱柱（250mm×4.6mm，4μm），流动相乙腈-0.05%磷酸，梯度洗脱，流速0.8mL/min，波长270nm，建立指纹 图谱。结果：方法学考察表明，检测方法各项指标均符合要求，准确测定了两种制剂10个批次中药效成分含量， 所得指纹图谱各色谱峰分离度好，充分反映粉针剂中所含成分种类和比例。结论：测定方法快速准确灵敏，发现 粉针剂所含药效成分比例更高，为提高红花注射制剂质量标准提供参考。
( Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China )
指纹图谱(PPT)
↓
↓
鉴别
质量评价
↓
↓
聚类分析
相似性差别
遗传算法
↓
人工神经网络
相似系数法
等等
夹角余泫法
欧氏距离等等
图 5 中药材、中药制剂药效组分指纹图谱信息处理研究框图
4、中药药效组分筛选及检测方法学
动态细胞培养 技术
电穿孔技术 ↘
细胞药物筛选 系统
↘
中药复方的有效 部位 ︱ ↓
中药复方药代动 力学
(血液、脑脊液)
三七总皂甙化学成分鉴定LCMS
the total saponins
Fr. III
Fr. II
Fr. IV
三七总皂甙化学成分
Fr.III-1中微量化合R1 物以HP分L析C制备
分离
100%CH3CN
R1
R1制备液相制备示意图
O OH
OH OH
OH
glc O
notoginsenoside R7
O OH
200
100
0 0
10
20
nm
mAU 800
VWD1
A,
Wavelength=203
(SANQI\A2112503.D)
700
600
500
400
300
200
100
0 0
10
nm 20
30 30 30 30 30
Carbosorb ODS-3
40
50
60
70
min
Lichosorb
40
50
60
70
min
Polaris
40
50
60
70
色谱指纹图谱评价PPT幻灯片
◆ 中药色谱指纹图谱 方法学
柱色谱
Column Chromatography
平面色谱
Planar Chromatography
液相色谱
Liquid Chromatography (LC)
气相色谱
Gas Chromatography (GC)
薄层色谱
Thin Layer Chromatography (TLC)
主要内容
◆ 色谱指纹图谱的缘起、属性、特点和作用 ◆ 中药色谱指纹图谱方法学 ◆ 中药色谱指纹图谱试验的规范化 ◆ 中药色谱指纹图谱的定性评价方法 ◆ 应用实践
◆ 色谱指纹图谱的缘起、 属性、特点和作用
中药质量控制现状
【名称】 【来源】 【性状】 【鉴别】
宏观特征鉴别
生药学
植物分类学 动物分类学 矿物学 微生物分类学
谱
中药各类制剂和相关产品指纹图谱
中药指纹图谱的建立
指纹图的获取 方法验证 指纹图的校验和复核
指纹图谱的获取
供试品收集
供试品制备
对照品（参比物）
指纹图谱试验研究
指纹图谱建立和辨识
供试品的收集
真实性、代表性；收集量不少于 10 批
◆ 原料药材
药材名称
供试品来源
原
药材名称收集时间及收集人
始 纪 录
货源情况调查 基原鉴定及鉴定人
毛细管电泳
Capillary Electrophoresis（CE）
反相高效液相色谱 (RP-HPLC)
Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography
●适用范围广 ●分离性能好 ●分析速度快 ●流动相选择范围宽
色谱指纹图谱评价PPT课件
面取得了显著进步。
毛细管电泳法（CE）
03
CE具有高分离效率和低成本的优势，尤其适合分析复杂生物样
品。
数据库的建立与完善
建立标准色谱指纹图谱库
收集各种样品的标准色谱指纹图谱，建立全面的数据库，为比对 分析提供参考。
数据标准化
对色谱数据进行处理和标准化，确保不同实验条件下的数据具有可 比性。
数据库更新与维护
谢谢观看
根据样品的性质和目标成 分，选择合适的色谱柱， 确保目标成分的有效分离。
流动相的选择
根据样品的性质和目标成 分，选择合适的流动相， 以获得最佳的分离效果。
检测波长的选择
选择适当的检测波长，以 便在指纹图谱中获得准确 的检测结果。
数据处理与分析
数据采集
按照设定的色谱条件进行实验 ，并采集色谱图数据。
色谱指纹图谱评价ppt课件
目录
• 引言 • 色谱指纹图谱的建立 • 色谱指纹图谱的解析 • 色谱指纹图谱的应用 • 色谱指纹图谱的局限性 • 色谱指纹图谱的发展趋势
01
引言
目的和背景
目的
介绍色谱指纹图谱在中药质量评价中的应用。
背景
随着中药产业的快速发展，中药质量评价方法的创新与改进成为行业关注的焦 点。色谱指纹图谱作为一种新型的中药质量评价方法，具有独特的优势和广泛 的应用前景。
数据预处理
对采集的数据进行必要的预处 理，如平滑化、基线校正等， 以提高数据的准确性和可靠性 。
特征峰的确定
通过对比对照品和样品色谱图 ，确定色谱指纹图谱中的特征 峰。
相似度评价
利用相关软件计算样品之间的 相似度，以评估色谱指纹图谱
的一致性和可靠性。
03
色谱指纹图谱的解析
电化学指纹图谱ppt课件
实验表明，特征参数诱导时间、最大振幅均能作为 定量分析的参数，均与甘草的用量呈良好的线性关 系。
面临的问题？？？
药材生产供应、流通领域的混乱对指纹图谱
的研究是不利的，用多种来源的药材很难制 定稳定的指纹图谱。 从药材提取分离到分析检测全过程的标准化、 规范化程度不够，影响实验室之间的重现性。 除中药注射剂外，大部分中药制剂生产工艺 简单粗糙，杂质较多，即难以保证产品的稳 定，更无法提供高的质量。
不同粉末粒度的薄荷电化学指纹图谱(单位：mm)
(a)0.20~0.45 (b)0.15~0.20 (c)0.10~0.15 (d)0.075~0.10
电化学指纹图谱用于中药的鉴别
以上结果表明，不同中药作为底物的化
学振荡反应体系，可以获得各具特色的 中药电化学指纹图谱，可进行中药的鉴 别和检测。
电化学指纹图谱
常见的中药指纹图谱
高效液相色谱指纹图谱 气相色谱指纹图谱 薄层色谱指纹图谱 高速逆流色谱指纹图谱 毛细管电泳指纹图谱 红外光谱指纹图谱
色谱指纹图谱局限性
液相色谱仅适用于真溶液体系；气相色谱仅适用于 中药挥发性成分分析 定性和定量参数一般只有保留值和峰强度，色谱峰 形也很少变化，因而其特征直观性不强，需进行数 据处理后鉴别和评价中药； 色谱技术不能直接用于成药和固体天然药物指纹图 谱的测定，测定前必须对其成分进行提取、分离等 预处理，因而繁琐、操作流程长、试剂消耗量大， 分析费用高，还引入杂质，提取的部分已不能代表 中药的全部成分。 -------因此，色谱指纹图谱仅适用于中药注射液和口 服真溶液。
电化学指纹图谱
不加入中药时获得的纯B-Z振荡体系的E-t曲线， 因持续振荡时间超过4h，故只截取部分E-t曲线
高效液相色谱技术在中药指纹图谱研究中的应用
几种特征成分（如色谱指纹图谱）以保证制剂和产品质量的一致”［２］。
我国国家药品监督管理局２０００年颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》，要求到２００２年末，所有申报的中药注射剂均应有相关的指纹图谱资料， 使中药指纹图谱的研究成为中药研究的热点。
为实现中药材、中成药质量标准现代化，使中药走向世界，研究建立指纹图谱对实现中药质量标准现代化具有重要的意义。
２ 高效液相色谱技术在中药指纹图谱研究中的应用２．１ 高效液相色谱法构建中药指纹图谱应用于中药材的真伪鉴别及质量评价由于高效液相色谱仪的诸多优点并能对中药样品中含有的绝大多数成分进行分析检测及质量评价，故高效液相色谱技术已成为当前研究中药指纹图谱的主要手段。
欧洲国家现在普遍采用高效液相色谱法对植物药物中已知及未知组分进行控制，并形成相应的规范。
因此高效液相色谱法在构建中药指纹图谱对中药的定性鉴别与定量分析中得到广泛应用。
采用高效液相色谱法测定指纹图谱可对中药材的产地、采收时间、加工方法、工艺流程等多方面通过化学成分的差异来反映中药材的种属差异、真伪鉴别等，从而达到控制中药质量的目的。
刘梅［３］等采用ＨＰＬＣ色谱指纹图谱可以快速、准确对药材夏天无和延胡索进行定性鉴别。
张玉杰等［４］对不同产地正伪品沙苑子及伪品的主要有效成分黄酮类进行利用ＨＰＬＣ指纹图谱进行鉴别研究，研究显示不同来源的正品沙苑子ＨＰＬＣ指纹图谱十分相似，而２种伪品则显示出完全不同的指纹图谱特征，得出ＨＰＬＣ指纹图谱特征可以作为沙苑子质量评价和药材鉴别的依据。
李磊等［５］以不同产地正宗丹参和市场上充作丹参的其他鼠尾草属植物为分析对象，采用ＨＰＬＣ法构建丹参ＨＰＬＣ指纹图谱，可鉴别不同来源丹参与其他鼠尾草属丹参伪品。
高效液相色谱技术在中药指纹图谱研究中的应用许一平１ 罗启恩２１．山东中医药高等专科学校 ２６５２００２．莱阳农学院 ２６５２００高效液相色谱法（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）是在经典液相色谱法的基础上发展起来的一种新的色谱技术。
指纹图谱及高效液相PPT课件
第25页/共29页
正常使用前后色谱柱要强溶剂冲洗
• 参考图5-23，5-24 • “污物”在柱进口处积聚，柱压高等问题，用纯溶剂（甲醇、乙腈）正冲，
反冲。当柱子过“脏”时，正相柱可用甲醇（可加少量水）；反相柱可用异 丙醇加甲醇冲洗；96%二氯甲烷+4%甲醇+1%氢氧化铵20倍柱体积25cm 的柱子大约50ml
次预实验,然后按照一定速度(20%)降低强溶剂的比例。
第15页/共29页
确定方法的有效性
• 在精密度、方法可重复性及样品稳定性分析中由五次进样所得共有峰的峰面积和峰保留时间的相对标准偏 差来确定。
• 由此确定仪器和进样精密度如何，提取方法，仪器状态，色谱条件是否适用。并确保溶液在规定温度条件 下48小时内稳定。
查阅文献名称 • 中药指纹图谱在中药质量控制中的应用—王乐 • 高效液相色谱数字化定量指纹图谱评价维C银翘片的中药 组分物质均一
性 —邵艳玲 • 地黄基于HPLC指纹图谱的质量评价及种质资源利用研究—曹建军 • 人参药材HPLC指纹图谱和高端保健品多维指纹图谱的研究—苑若瑶 • 六味地黄浓缩丸HPLC指纹图谱研究—高新彪 • 黄芎抗栓胶囊指纹图谱的研究_冯艺戎 • 高效液相色谱法同时测定黄芎抗栓胶囊中5种大黄成分的含量_韩燕全 • 仙鹤草质量控制方法的研究_丁蓓蓓
第24页/共29页
用良好的流动相条件，包括PH、缓冲溶液 种类及浓度、添加剂，尽量减小硅胶基质 的“次级作用”。
流动相的配制方法：20mMol磷酸钠缓冲液：HCN（9：1）9体积的磷酸钠缓冲 液加1体积的HCN溶液混合。脱气方法应一致 缓冲溶液的配制方法：天平定量称量，定容到一定体积最准。如需控制PH值时应 使用酸度计，添加好的酸碱。
指纹图谱及高效液相
正常使用前后色谱柱要强溶剂冲洗
• 参考图5-23，5-24 • “污物”在柱进口处积聚，柱压高等问 题，用纯溶剂（甲醇、乙腈）正冲，反 冲。当柱子过“脏”时，正相柱可用甲 醇（可加少量水）；反相柱可用异丙醇 加甲醇冲洗；96%二氯甲烷+4%甲醇 +1%氢氧化铵20倍柱体积25cm的柱子 大约50ml
HPLC流动相的选择
乙腈-水，甲醇-水，乙腈-磷酸水溶液，乙腈-乙酸水溶液
流动相组分溶液浓度对色谱峰影响
在选择流动相体系若酸度较大时，峰型好的同时还须考 虑色谱仪酸承载能力
开始方法建立
• 首次HPLC分离较好的实验条件 • 色谱柱 C18、C8 5μm 15×0.46cm • 流动相 甲醇-水， 甲醇-甲酸水（？不太确定） 流速 1.5—2.0ml/min 温度 35—45℃ 样品量 体积<25μL 重量 <100 μg
分析方法的评价方式
• 精密度：取样品一定量按试验方法制备样品溶液， 24小时内连续进样5次，分析仪器及进样的精密 度。 • 重复性：取5份同样量的样品，按试验方法（制备 方法及色谱方法）进样分析，测分析方法的可重 复性。 • 精密度：取同一样品溶液室温下放置，48小时内 进样分析五次，分析样品溶液在室温下的稳定性。
指纹图谱测定实验步骤
• 1.供试品及对照品的制备 • 2色谱条件的选择 • 3.方法学考察
• • • • 线性关系的考察 精密度实验 稳定性试验 重现性试验（保证相对保留时间的RSD<1%,相对保留面 积的RSD<3%） • 加样回收率实验
• 4.指纹图谱的建立和共有指纹图谱峰的指认
样品的溶液制备选择方法
三 压力降
• 同一支色谱柱的渗透性（压力降）或反压力应 该相似。 • 用球形微粒填充的色谱柱的压力降可用下式估 算： P=3000Lη/（t0dp2） 式中P为压力（psi），L为柱长（cm），为流 动相粘度（cp），t0为死时间，dp为微粒的直 径。 新的色谱柱使用纯溶剂（甲醇、乙氰）冲洗时 要记录压力，这是色谱柱很重要的指标
红参高效液相色谱指纹图谱研究_高燕霞
１
ｉ
ａ ，
Ｓ Ｕ Ｊ ｕ ａ ｎ
２
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Ｓ ｃ ｈｏ ｏ
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表
１
流 动 相 梯度 洗 脱条 件
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供试 品 溶 液 按 苷 Ｒ 为参 照峰 ＾ ＾
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“
”
．
２
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项 下 条件 进 样分 析 以 人参 阜
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结 果 各共有峰相 对保 留 时 间 的
．
＂ｍ
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ｌ
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红花高效液相色谱指纹图谱研究
进样量：供试品及参照物各20µ l。
4.测试方法
取待测溶液适量 , 注入液相色谱仪，按选定的测 试条件，测定色谱图。并进行实验方法学考察。
流动相选择 经实验比较，乙腈 -0.5% 磷酸溶液 梯度洗脱，能较好地使样品中各色谱峰分离且出峰最 多；分析时间 65min ，样品 1.5h 图谱显示， 65min 后无 特征峰出现。
同构成第Ⅰ区特征。第Ⅱ区(6～11号), 共有特征是6、
7 、 11 号峰表观丰度呈递增趋势，丰度较小的 8 、 9 、 10 号峰构成西青果的突出特点。第Ⅲ区（12～15号），特 征峰最突出的是 13 号峰（诃黎勒酸）， 12 号峰 <<<13 号 峰>>>14号峰<<15号峰。
共有指纹峰面积比
除诃黎勒酸参照物峰外， 7 、
Chebulamin，13号峰为诃黎勒酸,15号峰为诃子酸。
指纹图谱特征峰基本是酚酸类成分，高保留成分为 没食子酸等。这含药材鞣质类成分高达3.5％相符。
除参照物峰以外，无共有指纹
峰面积（峰）超过总峰面积的10%。 各地商品红花的指纹图谱, 采用“计 算机辅助相似度评价系统”软件进行数据处理,结果样 品a～n的相似度分别为0.96,0.78,0.88，……0.93。
新疆动
新疆主产地, 不同红花药材的指纹图谱相似度
较高（均>0.90)。尤其是吉木萨尔县红旗农场——红花 栽培基地的红花指纹图谱相似度更高（多>0.95)。
11号峰共有指纹峰面积超过总峰面积的 10%,规定相对峰 面积比值：7号峰为0.24～0.44,11号峰为0.24～0.45。
8.西青果液相色谱指纹图谱主要色谱峰的光谱 特征及LC/MS鉴定
红花药材高效液相色谱指纹图谱初步研究的综述
关于红花药材高效液相色谱指纹图谱初步研究的综述摘要目的：利用高效液相色谱建立新疆地区红花的色谱指纹图谱。
方法：采用反相C18柱，乙腈一0．5％磷酸水溶液梯度洗脱；检测波长275 rim；流速1．0mIJmin进行试验。
结果：从7个地区出产的红花获得色谱共有峰，比较基本特征。
羟基红花黄色素A为指标成分，看哪个红花的含量为最高。
结论：该法为中药样品的鉴定提供了较全面的信息，红花样品指纹图谱及指标成分含量测定可用于全面控制红花药材的质量。
关键词红花；高效液相；指纹图谱前言：红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L. 的干燥花,具有活血通经、散瘀止痛的功效,是传统的活血化瘀中药现代药理研究表明红花对心血管系统有广泛而显著的作用,临床疗效确切,大量用于中成药生产和临床处方。
因此,建立红花药材有效的质量评价方法,对不同产地红花药材的质量进行系统的比较研究,确保红花药材质量稳定,直接关系到红花相关药品和临床处方的疗效。
谱指纹图谱用于中药的表征和质量控制已越来越引起广泛的关注。
色谱指纹图谱是在固定实验条件和实验方法，得到同一样品不同批次色谱图谱。
美国FDA最近几年制定的植物草药指南已把指纹图谱作为这类混合物质群的质量控制方法。
欧洲也将色谱指纹图谱作为植物药制剂的评价方法。
本文采用高效液相色谱法,建立红花药材的指纹图谱,对不同来源的红花药材进行比较研究,为红花的质量控制提供有效方法。
正文：1材料与仪器1．1仪器与试药Agilent一1100高效液相色谱仪；四元泵，DAD检测器；G137PA自动脱气机；标准自动进样器；柱温色谱柱Zorhax SB—C18柱(4．6mln×250 mln，5 tnn)。
乙腈为色谱纯(Fisher)；水为二次蒸馏水；羟基红花黄色素A对照品(中国药品生物制品检定所，批号：0782—200310)；红花药材由武汉大学药学院张洪教鉴定为菊科植物红花能心地矾淞tinctorius L．的干燥花(符合中国药典2000年版一部)。
《中药指纹图谱》课件
中药指纹图谱的研究进展
新技术
近年来，新的检测技术如质谱成像和纳米成像等开 始应用于中药指纹图谱的研究。
新应用
除了质量控制，中药指纹图谱的研究还涉及药理学、 药效学等新的应用领域。
中药指纹图谱的未来发展
1
发ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ趋势
中药指纹图谱将更加精细化，能够提供更多详细的化学信息和文化遗产保护。
2
市场前景
随着中药的国际认可和市场需求的增加，中药指纹图谱的应用前景非常广阔。
参考文献
1. 文献列表 2. 引用标准
《中药指纹图谱》PPT课 件
中药指纹图谱是一种用于鉴别、评价和质量控制中药的方法。它通过分析中 药样品中的化学成分，帮助保证中药的安全性和疗效。
什么是中药指纹图谱
中药指纹图谱是一种描述中药样品中的化学成分及其相对含量的图谱，是中药的"身份证"和"指纹"。
中药指纹图谱的构建方法
1
概述
中药指纹图谱的构建分为样品制备、分离技术、检测方法等多个步骤。
案例分析
实际案例
我们将以某种中药为例，展示该中药在中药指纹图 谱中的典型谱图和峰识别结果。
分析结果
通过中药指纹图谱分析，可以准确鉴别该中药的真 伪和质量状况，确保其安全有效的使用。
总结与展望
1 总结
中药指纹图谱是一种有效保证中药质量和疗 效的方法，具有较高的分析精度和可靠性。
2 展望
随着技术的进步和应用的拓展，中药指纹图 谱将在中医药领域发挥越来越重要的作用。
2
总体步骤
样品收集、提取、分离、检测和数据分析是构建中药指纹图谱的总体步骤。
3
具体操作
具体操作包括样品准备、HPLC条件设定、峰识别和数据处理等。
指纹图谱(PPT)
1年生
2年生
3年生
4年生
5年生
6年生
三七主根
其中云南省文山州占80%以上， 种植面积约5万亩，分布于文山 砚山、马关、麻栗坡、西畴等
三七药材资源分布图
三七GAP种植基地
化学成分研究：
已分离成分： 人参皂苷（ginsenoside）-Rb1、Rd、Re、
HO
O glc
20(S) 20( R)
notoginsenoside 8 notoginsenoside 9
glcO OH
OOH
HO
Oglc
notoginsenoside R10
HO
O glcO
OH
Oglc
glcO OH
notoginsenoside R1
OCH3
HO
HO Oglc
notoginsenoside R12
第三部分、三七系列中药注射剂指纹图谱研究及 相似度计算软件的试用。
研究单位：
中国药科大学 中国药品与生物制品检定所 中科院昆明植物研究所 广西药品检验所 上海市药品检验所 云南省药品检验所 广东省药品检验所 黑龙江省药品检验所 北京禾普康天然药物技术开发有限公司
研究的主要内容
➢ 三七药材GAP情况 ➢ 指纹图谱方法学研究 ➢ 三七药材指纹图谱研究、三七总皂甙生
500 400 300 200 100
0 0
10
20
mAU 500
VWD1
A,
(SANQI\A2112502.D)
Wavelength=203
nm
400
300
200
中药指纹图谱的原理与应用PPT课件
C联用。液相色谱可以起到脱盐和浓缩样品的作用，
减少盐或其它小分子对样品离子化的影响而降低样
品的损耗和污染。液相色谱与质谱在线联用使质谱
法与常规的蛋白质分析方法可以很好的联用，其精
确度和灵敏度都大大超过了常规方法。并且，快速
流动的在线分离技术是一种高效率的生物分析方法。
用LC/ESI/MS进行生物大分子的分析鉴定能获得满
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• 现代分子生物学研究发现，核苷酸序列含有生命有机物构建、 维持和繁殖生命所必需的遗传信息，不同种生物体含有不同 的DNA序列，同种生物体既有相同的DNA序列，保持同种生 物体的遗传性状，又具有多态性，使同种生物各个体千差万 别。由于这种核苷酸序列是相对稳定的，因而可以利用现代 分子生物学技术构建DNA指纹图。其原理是：每个生物体个 体的DNA经酶切后，电泳分离，用标记的DNA探针杂交和放 射自显影后形成的带纹分布应该是有区别的，具有个体、群 体和物种的特异性(DNA fingerprintion，DNAfp)。如要了 解中药复方制剂中的某味药是否存在，通过对这种中药材的 分子遗传标记的研究，找到具有该种高度特异性的片段，便 可以此为基础，制备出对该种高度特异性的寡核苷酸探针， 再经分子杂交进行指纹分析，即可达到鉴别目的。DNA指纹 图具有高度的个体特异性。DNA指纹图谱技术包括AP-PCR (arbitrary primer PCR，任意引物聚合酶链式反应)和RAP D(随机扩增多态性DNA，randomly amplified polymorp hic DNA)两种指纹图谱技术。RFLP (限制性[内切酶]片段长 度多态性，restriction fragment length polymorphism) 是最常用的构建DNA指纹图的方法，但该法费时费力，使应 用受到限制。随机扩增多态DNA(RAPD)标记，可以在特异D NA序列尚不清楚的情况下，检测DNA的多态性，这是构建中 药指纹图谱的新方法，具有极好的应用前景。此外，还有SSR (简单重复序列，simple sequence repeat)、ISSR(简单重 复序列间区，inter s第im20p页l/共e 2s5e页quence repeat) 、AFLP(扩
基于超高效液相色谱-质谱红花药材指纹图谱的建立
基于超高效液相色谱-质谱红花药材指纹图谱的建立罗春霞;王瑾;祁艳茹;马丽;杨亮;关明【摘要】以红花为研究对象,建立超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)指纹图谱分析方法,为红花药材质量鉴别提供借鉴.通过考察检测波长、梯度洗脱条件、提取溶剂、提取方法等因素,在最优条件下对20个产地的红花样品进行分离分析.色谱柱:Thermo Hypersil Gold C18,100 mm×2.1 mm,1.9μm,流动相:0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B);流速:0.3 mL/min;柱温:30℃;检测波长:270 nm;进样量:2μL,质谱条件:鞘气流速:45 arb,辅助气流速15 arb,雾化电压:3.3 KV,离子传输管温度:350℃,辅助气加热温度:400℃.试验结果:共确定了67个共有峰,通过UPLC-MS指认了其中11个共有峰,对20批不同产地的红花药材指纹图谱进行了相似度评价,其相似度在0.687～0.971之间.建立的UPLC-MS指纹图谱可为红花药材的质量控制提供参考依据.【期刊名称】《分析测试技术与仪器》【年(卷),期】2019(025)003【总页数】8页(P152-159)【关键词】超高效液相色谱-质谱;红花药材;指纹图谱【作者】罗春霞;王瑾;祁艳茹;马丽;杨亮;关明【作者单位】新疆师范大学化学化工学院,新疆乌鲁木齐 830054;新疆师范大学化学化工学院,新疆乌鲁木齐 830054;新疆师范大学化学化工学院,新疆乌鲁木齐830054;新疆师范大学化学化工学院,新疆乌鲁木齐 830054;新疆师范大学化学化工学院,新疆乌鲁木齐 830054;新疆师范大学化学化工学院,新疆乌鲁木齐830054【正文语种】中文【中图分类】O657.63红花(Carthamus tinctorius L.)系菊科[1]，又名刺红花、草红花，一年或两年生草本植物. 红花是我国传统的中药材，具有活血化瘀、舒筋活络、预防和治疗心脑血管疾病等功效[2-4]. 新疆因具有特殊的地理环境和生态条件而成为我国红花的主产区[5]. 由于长期的自然选择和人工选择，红花种内产生了明显分化，形成了丰富的种质资源，不同种质来源的红花药材品质差异明显. 中药材的质量问题直接关系到中药的疗效及安全，因此建立一种反映中药内在质量的评价方法是关键.近年来，指纹图谱已广泛应用于药材的鉴别和质量评价[6-8]. 目前，关于红花指纹图谱的报道很多[5,9-11]，但有些来源地比较有限，有些指纹图谱共有峰较少，很难对红花药材的质量进行全面、客观的评价. 高效液相色谱(high performance chromatography, HPLC)法建立的中药指纹图谱存在灵敏度较低、溶剂消耗量大等问题，使中药中的组分不能被全部识别，进而导致药材质量评价不够准确. 近年来，超高液相色谱(ultra high performance liquid chromatography, UPLC)以其分析速度快、分离性能好等优点，在中药分析中快速发展[12]. 本研究以20批不同产地的红花药材为分析对象，构建红花药材多指标成分超高效液相色谱-质谱(ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry, UPLC-MS)指纹图谱，对20批红花药材进行相似度评价，较为客观地反映药材的内在质量，为新疆地域药材质量评价理论的完善和质量鉴别方法的建立提供一定的参考依据.1 试验部分1.1 仪器、试剂与材料UltiMate3000/QExactive超高效液相色谱质谱联用仪(Thermo Scientific)；色谱柱：Hypersil Gold C18，(100 mm×2.1 mm×1.9 μm，Thermo Scientific)；微波超声波合成萃取仪(北京祥鹄科技有限公司).甲醇、甲酸、乙腈(均为HPLC级，Fisher scientific公司)；试验用水(广州市屈臣氏牌纯净水).红花药材采自新疆不同产地，共20批，经新疆农业大学杨晓君副教授鉴定，为菊科红花属草红花. 自然晾干后粉碎，过180 μm筛，放入干燥器中室温下避光保存，样品信息如表1所列.表1 新疆不同地区红花药材采样点Table 1 Sampling sites of Carthamus tinctorius L. in different areas of Xinjiang序号来源地序号来源地1和田地区墨玉县阿克萨拉依乡11昌吉地区吉布库镇2伊犁地区察布查尔县扎格斯台12和田地区于田县郭家屯乡3伊犁地区尼勒克乡13塔城地区塔城市164团4伊犁地区喀什乡14昌吉地区吉木萨尔镇5伊犁地区清水河农科站15昌吉地区吉木萨尔县北庭镇6伊犁地区霍城惠远16塔城地区裕民县国营牧场7昌吉地区木垒县东城镇17克州阿图什市8塔城地区裕民县哈拉布拉乡18和田地区和田皮山县9塔城地区额敏县166团19伊犁地区芦草沟县10伊犁地区察布查尔县堆齐牛录乡20喀什地区岳普湖县铁热木乡1.2 供试品溶液的制备20批红花样品粉碎，过75 μm筛，室温下称取1.000 0 g红花粉末于微波超声波合成萃取仪的三口瓶中，加15 mL 50%甲醇溶液，微波功率600 W，温度70 ℃，萃取20 min. 冷却至室温，将反应液及残余的红花全部倒入25 mL容量瓶，50%甲醇定容，过0.22 μm滤膜，待测.1.3 色谱条件色谱柱：Thermo Hypersil Gold C18，(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流动相：0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；流速:0.3 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：270 nm；进样量：2 μL；梯度洗脱程序为：0～2 min，98% A；2～20 min，98～92% A；20～48 min，92～88% A；48～60 min，88～84% A；60～105 min，84～81% A；105～110 min，81～70% A；110～115 min，70～65% A；115～120 min，65～60% A；120～122 min，60～98% A；122～125 min，98% A.1.4 质谱条件鞘气流速：45 arb，辅助气流速：15 arb，雾化电压：3.3 KV，离子传输管温度：350 ℃，辅助气加热温度：400 ℃.2 结果与讨论2.1 色谱条件的优化2.1.1 检测波长的选择对270、403、390、367 nm 4个检测波长进行考察，不同检测波长下红花样品的出峰情况存在显著差异(如图1所示). 由图1可见，当检测波长为270 nm时，红花样品中指标成分响应最为明显，出峰个数多且峰型较好，能够提供的有效成分信息较为丰富，故选择270 nm为检测波长.图1 不同检测波长下的红花样品UPLC色谱图Fig. 1 UPLC chromatograms of safflower samples at different detection wavelengths(a) 270 nm, (b) 403 nm, (c) 390 nm, (d) 367 nm2.1.2 梯度洗脱条件的优化参考相关文献[13]，采用0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相，并对梯度洗脱条件进行优化，最终确认1.3项下为较优色谱条件. 该条件下，红花各组分达到最佳分离，对应样品UPLC色谱图如图2所示.2.2 提取条件的优化2.2.1 提取溶剂的考察分别以甲醇∶水为0∶100(体积比)、甲醇∶水为25∶75(体积比)、甲醇∶水为50∶50(体积比)、甲醇∶水为75∶25(体积比)、甲醇∶水为100∶0 (体积比)作提取溶剂. 结果表明，提取溶剂中无甲醇或甲醇浓度过低时，红花药材中许多脂溶性组分没有出峰或者峰面积较小. 而甲醇浓度过高时，又会导致红花中的水溶性组分无法被提取出来. 故选择甲醇∶水为50∶50(体积比)作为提取溶剂.图2 红花样品UPLC色谱图Fig. 2 UPLC chromatogram of safflower sample 2.2.2 提取方法考察分别以超声辅助提取法、微波辅助提取法、基质固相分散萃取法(MSPD法)、快速溶剂提取法对红花样品进行提取，比较5种指标成分的峰面积、提取时间等(如表2所列). 由表2可见，超声辅助提取法、微波辅助提取法提取出的有效成分峰面积较大，但微波辅助提取法的提取时间仅为20 min. 故选择微波辅助提取红花样品. 表2 不同样品前处理方法所得指标成分峰面积比较Table 2 Comparison of peak area of different sample pretreatment methods方法峰面积羟A6-羟基山奈酚-3,6-二-β-d-葡萄糖苷芦丁红花黄色素A脱水红花黄色素B超声辅助提取法2159 549429 569126 388395 800688 695微波辅助提取法2 119 554453 454123 562435 329686 602MSPD法2 117 757405 612111 652362 574682 241快速溶剂提取法533 207108 94032 499111 004182 3472.3 指纹图谱的建立在上述最优条件下，对20个产地的红花样品进行分离分析. 将色谱图导入中药指纹图谱相似度评价(2004A)软件，经过设置参照谱图、系统自动匹配、生成对照谱图、相似度评价4个步骤，即得到对照指纹图谱(采用中位数法，时间窗为1.00)，其中R谱即为红花药材的UPLC对照指纹图谱(如图3所示).2.4 相似度评价相似度评价结果由2.3中的“相似度评价”步骤得出，将R谱与20张红花样品的UPLC色谱图进行比较(如表3所列). 由表3可见，除样品S1和S12与R谱的相似度低于0.70之外，其余样品与R谱的相似度均大于0.70，其中S7、S10、S11、S18与R谱的相似度均介于0.70～0.80之间，但是其相互之间的相似度都在0.80以上. 总体来看，20个样品与R谱的相似度在0.90以上.图3 20批红花药材UPLC图谱(R为对照指纹图谱)Fig. 3 UPLC chromatograms of 20 batches of safflowers (R as the control fingerprint)表3 20批红花UPLC色谱图与指纹图谱R相似度评价表Table 3 Evaluation table of similarity degree of 20 batches of safflower UPLC chromatograms and fingerprint spectra RNo.S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15S16S17S18S19S20RS110.69 90.5250.6390.7260.7250.7150.5260.8750.6880.9070.6530.7080.6590.4490.8 860.7180.6390.4950.580.695S20.69910.7360.9380.9520.9390.6940.7930.809 0.6710.8210.5920.9440.9630.740.8130.960.6430.7720.7840.952S30.5250.73 610.6540.7460.7810.6740.9630.6570.7090.5820.870.750.7320.950.6550.766 0.8520.9620.9490.821S40.6390.9380.65410.9190.8930.60.7290.7680.5650.7 830.5160.9150.940.720.7360.9120.5940.7150.6840.886S50.7260.9520.7460. 91910.9360.740.7980.8260.6910.8180.6530.930.9710.7530.8190.9840.7160. 7830.8130.95S60.7250.9390.7810.8930.93610.80.820.870.7630.8270.6950.9 490.9270.7960.8720.9490.730.7810.8190.968S70.7150.6940.6740.60.740.81 0.690.830.9560.7730.7630.7340.670.6460.8460.7580.7820.6550.7260.791S8 0.5260.7930.9630.7290.7980.820.6910.680.710.6150.8060.810.7790.9660.6660.8310.8450.9660.9370.879S90.8750.8090.6570.7680.8260.870.830.6810.8 210.9440.7360.8420.7650.6230.980.8320.7840.6610.6850.841S100.6880.671 0.7090.5650.6910.7630.9560.710.82110.7330.7580.7060.6180.6640.8360.70 50.7770.6950.7180.771S110.9070.8210.5820.7830.8180.8270.7730.6150.944 0.73310.6770.8310.7630.540.9530.8190.6930.5780.6390.796S120.6530.5920 .870.5160.6530.6950.7630.8060.7360.7580.67710.6610.5940.8080.7410.657 0.9460.8090.880.687S130.7080.9440.750.9150.930.9490.7340.810.8420.706 0.8310.66110.9310.7770.830.9420.6930.7760.8180.951S140.6590.9630.7320 .940.9710.9270.670.7790.7650.6180.7630.5940.93110.7470.7590.9620.6450. 7540.7850.932S150.4490.740.950.720.7530.7960.6460.9660.6230.6640.540. 8080.7770.74710.6040.770.8390.9530.9160.83S160.8860.8130.6550.7360.81 90.8720.8460.6660.980.8360.9530.7410.830.7590.60410.8210.7620.6330.69 0.835S170.7180.960.7660.9120.9840.9490.7580.8310.8320.7050.8190.6570. 9420.9620.770.82110.7240.8020.8340.971S180.6390.6430.8520.5940.7160.7 30.7820.8450.7840.7770.6930.9460.6930.6450.8390.7620.72410.840.8620.7 41S190.4950.7720.9620.7150.7830.7810.6550.9660.6610.6950.5780.8090.77 60.7540.9530.6330.8020.8410.9360.852S200.580.7840.9490.6840.8130.8190 .7260.9370.6850.7180.6390.880.8180.7850.9160.690.8340.8620.93610.862R 0.6950.9520.8210.8860.950.9680.7910.8790.8410.7710.7960.6870.9510.932 0.830.8350.9710.7410.8520.86212.5 色谱峰的指认采用UPLC-MS对红花样品进行检测，对已达到分离要求的组分进行质谱分析. 将各组分的分子量与文献中已报道的组分进行比较，确认红花中11个未知组分(如图4所示). 20批红花的11个共有峰的保留时间及峰面积如表4、5所列.根据高分辨质谱提供的准确分子量与红花中已知组分的分子量进行对比，将理论分子量和实测分子量进行比较计算，对于质量偏差小于2 ppm的组分予以确认，共确定了11个组分，按照保留时间的先后顺序分别如表6所列.图4 UPLC-MS联机分析红花药材中的11个组分Fig. 4 Analysis of 11 components in safflower by UPLC-MS表4 20批红花样品11个共有峰的保留时间Table 4 Retention times of 11 peaks in 20 batches of safflower samples编号保留时间/minS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15S16S17S18S19S20RSD/%1 2.762.682.692.782.722.672.672.692.702.692.772.702.702.702.702.692.702.70 2.702.690.84216.8716.7816.8016.8916.7816.7216.7916.7716.8316.8116.971 6.8816.7416.8116.8016.8016.7316.8416.8016.770.24318.0618.0818.1218.15 18.1218.1218.0818.1218.1418.0918.1118.0918.0918.0918.0918.1018.1118.1 418.1218.110.13418.8218.8518.8918.9118.8818.8918.8618.8918.9118.8618. 8718.8618.8618.8618.8618.8618.8818.9018.8918.870.12531.3831.4831.5731 .6331.6231.5631.5431.5831.6131.5731.4831.5231.5631.5631.5831.5831.603 1.6231.5831.580.18632.1932.3132.4032.4732.4532.4032.3832.4132.4432.39 32.3132.3532.3932.3932.4132.4232.4432.4532.4132.410.19735.3835.4835.5 735.6635.6335.6035.5835.5935.6235.5835.4935.5235.5535.5635.5835.6035. 6135.6235.5835.580.21836.2636.3536.4436.5336.5136.4936.5036.4736.5036 .5036.3736.4036.4336.4436.4736.5036.5236.5036.4736.460.31941.1641.244 1.4041.4441.4341.4741.3841.4041.4341.4241.2841.3341.3541.3941.4341.40 41.4541.4341.3841.400.191051.5751.7251.8651.8851.9151.8951.8851.8951. 9051.8651.7451.8551.8651.8751.8651.8651.9051.8951.8851.880.131157.4757.6057.7057.7057.6957.6757.7257.7357.7257.7457.6557.7157.6857.7357.69 57.7257.7357.7357.7357.710.17表5 20批红花样品11个共有峰的峰面积Table 5 Peak areas of 11 peaks in 20 batches of safflower samples编号峰面积S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15S16S17S18S19S201105 684246 926137 075115 490133 850198 284243 385171 37986 964288 488247 474123 258149 368116 106167 312225 76967 173225 769176 267251 08021 454 8821 044 9851 164 5241 828 0472 190 3752 759 0951 800 7602 248 2161 787 4031 586 1491 607 9641 427 6742 400 0661 963 5351 943 1072 097 4132 675 2161 855 2182 143 8932 277 7883191 917310 145208 483316 900303 887351 784535 262275 297241 216395 360249 980197 784348 395290 844268 256303 890340 396231 961295 652340 6994125 406185 239139 213197 392175 178186 137334 794187 067132 219222 704175 980178 027190 190186 408171 653195 209194 087156 466185 324177 4025283 920531 671400 534570 472513 718747 8641 068 029533 316394 087557 294479 337485 595650 309511 944551 968422 219723 047397 314414 325517 8256159 878320 248262 289229 087282 090465 482259 247340 615229 951139 053329 138229 229389 615315 082379 099289 880318 607232 790226 703310 9727176 332254 205253 849318 953297 091379 166295 201373 583253 072353 427174 740237 598411 369310 318298 918223 900356 595252 964343 432289 0818112 852181 107199 257190 203181 818245 33383 510232 481143 04467 138139 989126 550231 059186 676192 512145 721159 987153 249167 642162 383975 41688 45165 54678 08867 50257 14592 57078 14043 76310441077 94174 21189 29795 04278 857110 13374 259115 53157 65669 2441030 07240 72128 704395 739364 427366 372399 794450 970287 997314 284351 049347 073300 723407 212287 044395 739364 427366 372399 794450 97011386 129677 642581 951754 895790 5011 073 503749 579661 408540 857645 617343 884587 950975 196715 801806 528636 296877 197602 264729 990830 130表6 红花药材中11个共有峰具体信息表Table 6 Specific information table of 11 common peaks in safflower编号中文名分子式保留时间/min[M+H]-(实测值)[M+H]-(理论值)质量偏差/ppm1异槲皮苷同分异构体C21H20O122.78463.088 87463.088 201.452羟基红花黄色素A[14]C27H32O1616.81611.162 17611.161 760.6736-羟基山奈酚-3,6-二-O-β-D-葡萄糖苷-7-O-β-D-葡萄糖醛酸[15 ]C33H38O2318.11801.174 50801.173 111.7346-羟基山奈酚-3,6-7-三-O-β- D-葡萄糖苷[15]C33H40O2220.79787.195 07787.193 851.5556-羟基山奈酚-3,6-二-O-β-D-葡萄糖苷[15]C27H30O1731.51625.141 11625.141 020.1466-羟基山奈酚-3-0-β-D-芸香糖苷-6-0-β-D-葡萄糖苷[15]C33H40O2132.37771.199 65771.198 930.937异槲皮苷同分异构体C21H20O1235.57463.088 87463.088 201.458芦丁同分异构体C27H30O1636.43609.146 73609.146 111.029芦丁[16]C27H30O1641.34609.146 61609.146 110.8210红花黄色素A[17]C27H30O1551.78593.151 61593.151 190.7111脱水红花黄色素B[18]C48H52O2657.601043.267 821043.267 400.403 结论本研究以来自新疆伊犁地区、塔城地区、昌吉地区、喀什地区及和田地区等不同产地的20批红花样品为分析对象，建立了一种UPLC-MS指纹图谱分析方法，确定了67个共有峰，并通过UPLC-MS指认了其中的11种组分. 本文建立的UPLC-MS指纹图谱可识别出更多的有效成分，在红花药材的质量评价方面更具优势，可为红花药材质量的全面控制提供一定的借鉴. 同时，该方法可为构建红花药材质量分析体系与优质红花药材种质的筛选奠定基础，为红花药材的质量分析与评价提供较为全面的技术支撑和参考.参考文献:【相关文献】[1] FAN L J, GUO Meili. 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