MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结
动物脂肪沉积的分子调控机制
动物脂肪沉积的分子调控机制滑留帅;王璟;李明勋;孙晓梅;杨东英;陈宏【摘要】脂肪组织一直被当作具有能量的储存功能,直到一系列的脂肪细胞因子被发现后,人们逐渐认识到脂肪组织还是一个复杂且高度活跃的分泌功能,其参与包括食欲、能量平衡、胰岛素敏感性、繁殖、骨形成、炎症反应和免疫等许多过程的调控.脂肪功能的紊乱多与人类的肥胖病、糖尿病以及代谢综合症相关联,因此动物脂肪沉积的分子调控机制也备受人们关注.本文综述了目前在模式动物上研究的相对较为透彻的一些调控通路以及调控因子,例如,PPARg,C/EBPs,Hedgehog,Wnt/beta-catenin,BMPs,KLFs,Insulin和IGF1等.在未来的研究中,除了要继续利用模式动物挖掘和细化脂肪细胞分化的调控机制外,研究家畜脂肪组织调控机制的异同,对于动物育种也具有重要的意义.【期刊名称】《中国牛业科学》【年(卷),期】2013(039)002【总页数】7页(P48-54)【关键词】脂肪组织;脂肪细胞;分化;调控机制【作者】滑留帅;王璟;李明勋;孙晓梅;杨东英;陈宏【作者单位】西北农林科技大学动物科技学院/陕西省农业分子生物学重点实验室,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S823.2引言长期以来，脂肪组织一直被当做是具有能量的储存功能，用于调节机体的能量稳态平衡，当能量供应充足时，脂肪细胞储存甘油三酯，而当能量供应不足时，脂肪细胞释放甘油三酯以供能。
1994年，首个脂肪细胞因子Leptin被鉴定［1］，之后又有一系列的脂肪细胞因子被发现，例如TNFa（tumour necrosis factor－a），脂联素（adiponectin）、抵抗素（resistin）、adipsin、visfatin、白介素 6（interleukin，IL－6，chemokines等［2］。
这些脂肪细胞因子的发现让人们逐渐认识到脂肪组织是一个复杂且高度活跃的分泌结构，对于调节机体代谢至关重要，它参与包括食欲、能量平衡、胰岛素敏感性、繁殖、骨形成、炎症反应和免疫等一些过程的调控［2，3］。
小鼠胚胎成纤维细胞的分离_扩增和抑制
2002年8月第12卷 第4期中国实验动物学杂志CHINESE J OUR NAL OF LABOR ATORY ANIMAL SCIEN CE Augus t ,2002Vol .12 No .4研究报告小鼠胚胎成纤维细胞的分离、扩增和抑制刘民 李柏青(蚌埠医学院,蚌埠市 233003) 【摘要】 目的 建立有效的胚胎成纤维细胞饲养层体系,用于分离和克隆胚胎干细胞研究。
方法 取胎鼠组织制备小鼠原代成纤维细胞,观察不同分离和培养条件对细胞增殖的影响,以及丝裂霉素C 对细胞增殖的抑制作用;细胞增殖的数量用MTT 法测定。
结果 分离小鼠胚胎原代成纤维细胞的最适胎龄是12.5～14.5d ;20℃～25℃时,用0.25%胰蛋白酶消化组织的最佳时间为3min ;可在培养3～6d 后进行传代。
细胞冻存于-80℃3～4个月,复苏后能正常传代。
丝裂霉素C 抑制胚胎成纤维细胞增殖的合适浓度为每毫升20μg 105细胞,作用2～4h ,可维持小鼠原代胚胎成纤维细胞9d 内不增殖也不死亡。
结论 在合适条件下,小鼠原代胚胎成纤维细胞能顺利分离和培养,并能多次传代和冻存;经丝裂霉素C 处理后增殖受抑制,可作为饲养层细胞用于胚胎干细胞的研究。
【关键词】 小鼠;胚胎;成纤维细胞;胚胎干细胞【中图分类号】Q952 【文献标识码】A 【文章编号】1002-1485(2002)04-0215-05Study on the Proliferation and Inhibition of Mouse Embryonic FibroblastsLIU Min ,LI Baiqing(Bengbu M edical College ,Bengbu 233003,China )【Abstract 】 Objective To establish mouse fibroblast cells as feeder cells in order to isolate and clone mouse embryonic stem cells in vitro .Methods The mouse primary embryonic fibroblasts were isolated from mouse fetus of different gestational ag -es ,under different separation and culture conditions .The proliferation of fibroblasts and in hibition of mytomycin C were observed by measuring cell numbers using MTT assay .Results The optimal gestational age for isolation of mouse embryonic fibroblasts was from on 12.5to 14.5day .At the temperature of 20to 25℃,the optimal ti me for digestion of fetus tissue to obtain fibroblasts was 3min with digestion solution containing 0.25%of trypsin .The optimal concentration of mytomycin c to inhibit proliferation of fi -broblasts was 20μg 105cells for 2to 4hours ,at that condition of treatment of mytomycin C the fibroblasts were alive for 9days without proliferation .Conclusion In this study the mouse embryonic fibroblasts were successfully established for growth of mouse embryonic stem cells .【Key words 】 Mice ;Embryo ;Fibroblasts ;Embryo stem cells[作者简介]刘民,男(1963-),高级实验师。
干细胞相关知识点汇总总结
干细胞相关知识点汇总总结一、干细胞的基本概念干细胞是一种具有自我更新能力和多能性的细胞。
它们可以不断分裂产生同类干细胞，同时也能够分化为多种功能成熟细胞，如神经细胞、心肌细胞、肝细胞等。
干细胞分为两大类：胚胎干细胞和成体干细胞。
胚胎干细胞来源于早期的胚胎，具有最大的多能性；成体干细胞来源于成熟组织和器官，具有较小的多能性。
二、干细胞的类型1. 胚胎干细胞（ES细胞）：来自早期的胚胎，具有最大的多能性，可以分化为任何细胞类型。
2. 诱导多能干细胞（iPS细胞）：是通过基因工程技术将成体细胞重新编程而成的具有多能性的细胞。
3. 成体干细胞：来自成熟组织和器官，包括骨髓干细胞、脐带干细胞、脂肪干细胞等，具有较小的多能性。
三、干细胞的来源1. 胚胎：胚胎干细胞来源于早期的胚胎，通常来自体外受精后的胚胎。
2. 成体组织：成体干细胞来源于成熟组织和器官，包括骨髓、脐带、脂肪等。
3. 基因工程：诱导多能干细胞是通过基因工程技术将成体细胞重新编程而成的多能性细胞。
四、干细胞的应用1. 再生医学：利用干细胞进行再生医学研究，可以修复受损组织和器官，治疗多种疾病和损伤。
2. 组织工程：利用干细胞构建人工组织和器官，解决器官移植的短缺问题。
3. 药物研发：利用干细胞进行药物筛选和药效评估，加快新药的研发和上市。
五、干细胞的伦理和法律问题1. 伦理问题：胚胎干细胞研究涉及胚胎的使用和破坏，引发了伦理和道德方面的争议。
2. 法律问题：不同国家和地区对干细胞研究和应用的法律规定不同，有些国家禁止胚胎干细胞的研究和应用，有些国家则允许并支持相关研究。
六、干细胞的临床研究进展1. 干细胞移植治疗：干细胞移植已经成为治疗白血病、淋巴瘤等血液系统疾病的重要手段。
2. 干细胞再生医学：干细胞可以用于治疗多种慢性疾病和器官损伤，如心脏病、糖尿病、脊髓损伤等。
3. 干细胞组织工程：干细胞组织工程技术正在积极开发人工心脏、肝脏、胰岛、肌肉等人工组织和器官。
成纤维细胞
成纤维细胞科技名词定义中文名称：成纤维细胞英文名称：fibroblast定义：普遍存在于结缔组织中的一种中胚层来源的细胞。
分泌前胶原、纤连蛋白和胶原酶等细胞外基质成分，伤口愈合过程中可迁移到伤口进行增殖。
所属学科：细胞生物学（一级学科）；总论（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布百科名片疏松结缔组织中的成纤维细胞成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymalcell) 分化而来。
成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。
根据不同功能活动状态，可将细胞划分成成纤维细胞和纤维细胞，成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。
成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用。
目录细胞的功能活动状态划分来源特征创伤修复分离培养原代培养展望展开编辑本段细胞的功能活动状态划分根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞，细胞和细胞核较大，轮廓清楚，核仁大而明显，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动；纤维细胞（fibrocyte）功能活动不活跃，细胞轮廓不明显，核小着色深，核仁不明显，细胞质少。
此二型细胞可互相转化。
[1]编辑本段来源成纤维细胞：数目最多，胞体大，为多突的纺锤形或星形的扁平细胞，细胞核呈规则的卵圆形，细胞轮廓不清。
成纤维细胞摄取所需的氨基酸，如脯氨酸和赖氨酸等，在粗面内质网的核蛋白体上合成前α多肽链（proalphapolypeptidechain ），多肽链输送到高尔基复合体后，组成前胶原分子（procollagen ）。
前胶原分子由分泌囊泡带到细胞表面，然后通过胞吐作用释放到细胞外。
在前胶原肽酶催化下，将每一前α多肽链的尾段除去，成为原胶原分子（tropocollagen ）。
MEF及饲养层的制备(实验记录)
MEF及饲养层的制备(实验记录)mef及饲养层的制备（实验记录）1.MEF的获取：（已实施步骤4-12）（1）激素治疗小鼠，同步发情和超排卵（2）2：1合笼过夜(雌：雄)*r%m)e3y6i\（3）取出阴道塞（即乳白色或淡黄色果冻以确认她怀孕）的开始时间为0.5天-u1}-b）o*P（4）取出妊娠12.5-14.5天的小鼠为实验材料（5）通过颈椎脱位杀死怀孕小鼠，在含有75%酒精的烧杯中消毒，并在超清洁工作台上解剖。
首先，剖开腹部皮肤露出子宫，然后更换另一套手术器械。
用眼钳提起靠近宫颈的一端，分离子宫系膜，切开子宫角，取出子宫，并将其放入含有PBS的培养皿中。
（6）取出胎鼠，在pbs中洗涤数次。
去除头、尾、内脏和四肢，仅留躯干部。
在pbs 中充分漂洗，弃除红细胞。
(用两个镊子配合即可除去羊水膜、胎盘、头尾、内脏、四肢)（若是想培养神经干细胞，则用剪刀剪取前脑进行培养即可）（可以一起处理多个胚胎）1n.s#@$g$@（7）在新的皮氏培养皿中加入少量PBS，放入树干中，用眼剪将其剪成小于1mm3的组织块（可以再剪一点，可以缩短下一步的消化时间）。
（8）加入2~4ml0.25%胰蛋白酶，培养箱中消化10―15min，消化结束后加入等体积（多加点也行，只要不是少加，保证彻底的终止消化反应）的mefmedium终止消化反应，轻轻吹打，使细胞分散。
（做原代消化的时间稍长，胰酶用量也大，若是做传代，则只需加入500微升，最多1ml的胰酶，消化1~3min。
）（躯干组织不易消化，做原代和传代时，故都用0.25%胰蛋白酶；而脑组织较易消化（脑肿瘤组织），原代和传代都用0.05%胰蛋白酶。
）（消化可能不完全，也可室温静置5－10min，弃组织块，这样下面过滤就相对容易。
）（如果消化得到的细胞太少，可以离心弃上清，pbs洗涤，重新加胰酶消化）（胰蛋白酶，trypsin,最适条件ph8.0，37度，溶液中钙镁离子和血清会降低其活力，故消化用的胰蛋白酶中加入了edta。
分离和培养MEF细胞
分离和培养MEF细胞主要实验步骤：（冰上操作）1）处死：首先，将怀孕13.5-14.5天的小鼠拿到一个饭盒中，采用脱颈椎的方法将小鼠处死，将小鼠浸泡在酒精中2-3min。
2）取胎鼠：将已处死的孕鼠拿到超净台上的大培养皿的盖子中，用一对剪刀和镊子剪开小鼠的腹部，取出胎鼠，边取边用剪刀将脐带剪开。
3）取胚胎：将取出的胎鼠转移至大培养皿中（装有预冷的1×PBS），用剪刀将外面包裹的两层膜剪开（外面一层膜稍厚，里面一层膜稍薄，两层膜中间是羊水），取出胚胎。
（冰上操作）4）去四肢和骨骼：将胚胎转移至新的装有预冷PBS的培养皿中，用一对镊子轻轻的将头、四肢及躯干骨骼剔除，仅留肉（主要是躯干上的嫩肉），特别注意去尽血（血长得快，会对MEF造成很大影响）。
（冰上操作）5）消化：将组织块移至新的装有预冷PBS的培养皿中，用小剪刀剪碎（小于1 mm 3的组织块，取5倍体积（可以多一点点）胶原酶IV（5mg/ml in surm-free DMEM，0.22um抽滤），反复吹散组织块，并用巴氏管将组织悬液转移至15 mL 离心管中，37℃水浴锅中消化30-60 min。
加入等体积的PBS终止。
6）过滤：将200目筛网置于一个新的培养皿中，将细胞悬液滴至筛网上过滤（如果比较粘稠滤不下去，可以再加一些PBS反复吹吸），过滤完后可用1mL培养基再冲洗一次。
7）离心：将滤液转移至一个新的15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min。
8）多聚赖氨酸处理培养皿：1ug/ml多聚赖氨酸（用水配成2mg/ml贮存液，用时用PBS稀释成工作浓度）润洗培养瓶，吸走多余的多聚赖氨酸，再用PBS洗一遍培养瓶。
9）接种：弃上清，向沉淀中加1 mL培养基，用枪将其吹打成细胞悬液。
血球计数板计数，并按照一定密度接种于处理过的培养瓶。
T75培养瓶可接种1×106细胞。
用含有10% FBS, 1% P/S的DMEM培养。
10）换液：4小时后换新鲜培养基。
2.2.1 小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备
小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备北京大学工学院葛子钢实验室第一次撰写2008/12/05 汪丽丽最后修改2009/06/29 汪丽丽共3页目的培养MEF细胞做饲养层细胞，为胚胎干细胞的扩增提供环境条件。
主要器材超净工作台上海力新实业有限，HFSsfe-1200 CO2细胞培养箱SANYO，MCO-15AC- 80℃超低温冰箱REVCO，LEGACI倒置相差显微镜Olympus，U-PMTUC数码照相机Olympus，C-3040ZOOM台式高速离心机Eppendorf，minispin液氮罐CBS各种规格培养板、培养皿Falcon细胞培养主要试剂1.小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养液DMEM/h（Hyclone, SH30022.01）85%；FBS（ Hyclone，30071.03 ）15%2.丝裂霉素C（Sigma, M4287）饲养层培养液溶解100µg/ml，分装，-20℃保存。
3.Gelatin (Sigma, G2500)超纯水溶解，1g/L。
高压灭菌后，4℃保存。
4.0.25％trypsin＋EDTA (Hyclone, SH30042.01)0.25％trypsin：EDTA =1:15.小鼠胚胎成纤维细胞冻存液小鼠胚胎成纤维细胞培养液90%；DMSO (Sigma, D5879) 10%；小鼠品系ICR小鼠孕鼠12.5~13.5天实验步骤1.小鼠MEF的制备1．准备：洗净双手，穿好隔离服，戴好消毒的一次性口罩、帽子，戴上乳胶手套，喷洒酒精消毒。
2.取材：⑴准备100mm培养皿一个，60mm培养皿两个，小滴管向三个培养皿中均加入PBS，小皿PBS量约4~5滴管，要求皿中PBS能浸泡之后所容组织即可。
⑵脱颈处死孕12.5~13.5天的雌鼠：①捉小鼠尾巴，将小鼠取出笼子。
②左手揪住尾巴，右手握住剪子用剪子上部按住颈部。
③两手向两边用力拉伸，同时右手下压颈部。
④腹部朝上喷洒酒精消毒。
lif
gp130在小鼠ES细胞增殖过程中的作用建系之初，人们注意到小鼠ES细胞只有与小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF )共培养才可以维持其自我更新的特性；若失去MEF的支持则立即发生分化，说明MEF能促进ES细胞增殖并/或抑制其分化。
之后的研究表明：MEF通过分泌白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)抑制ES细胞的分化［10,11］。
LIF属于IL-6细胞因子家族，该家族细胞因子主要有IL-6、IL-11、LIF、CNTF、CT-1、OSM等。
该家族不同细胞因子具有相同或相似的生物学效应。
例如，OSM，CNTF，CT-1及LIF都能抑制ES细胞分化。
ES细胞不表达IL-6的受体，故IL-6不能抑制ES细胞分化，但当IL-6和其可溶性受体共同作用于ES细胞时即可以抑制ES细胞的分化［12］。
IL-6家族不同因子具有相同生物学效应的分子基础是它们共同的受体gp130［13］。
gp130是一种跨膜蛋白，属细胞因子受体超家族，本身无激酶活性，其介导的信号传递依赖于细胞内一种非受体型酪氨酸(Tyr)蛋白激酶JAK (Janus kinase)。
gp130与配基结合引起细胞内的不同JAK分子之间的靠近和相互磷酸化，活化的JAK继而使gp130特定位点的Tyr残基磷酸化。
继而，下游信号分子（如：STAT，SHP-2）则依赖SH2(Src homology 2)结构域与gp130上磷酸化的Tyr残基结合，而JAK则能够使与gp130 结合的该信号分子磷酸化而活化［14］。
STAT3 (signal transducer and activator of transcrip- tion) 即是JAK下游具有SH2结构的主要信号分子，当其与gp130上的磷酸化Try结合后，JAK可以将其磷酸化，继而进入核内调节相关基因的转录和表达。
利用化学小分子实现人胚胎干细胞多能性状态的转化
利用化学小分子实现人胚胎干细胞多能性状态的转化欧阳琦;杨青青;周晓樱;林戈;卢光琇;胡维新【摘要】小鼠胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)具有两种不同的多能性状态-原始态多能性(naive pluripotency)和始发态多能性(primed pluripotency),这两种多能性干细胞在形态、自我更新维持条件、基因表达、表观遗传学特征以及单克隆形成率等方面都存在明显差别.传统条件下分离和培养的人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells,hESCs)生物学特征更接近始发态多能性状态,需依赖转基因操作才能获得和维持原始态多能性状态.本研究通过在培养体系中添加化学小分子成功地将已建系的始发态多能性hESCs转化为原始态多能性干细胞,转化后hESCs呈紧密、圆形、隆起的三维克隆结构,具有两条活化的X染色体,单克隆形成率提高,基因表达更接近原始态多能性特征.结果提示hESCs也存在两种多能性状态,不同的体外培养环境可获得具备不同多能性特征的hESCs.原始态多能性状态的获得使hESCs在基因治疗、器官再生等领域具有广阔的应用前景,而仅改变培养条件,不依赖基因操作的培养方式大大提高了原始态多能性于细胞应用的安全性.【期刊名称】《激光生物学报》【年(卷),期】2014(023)004【总页数】7页(P319-325)【关键词】人胚胎干细胞;多能性;转化;化学小分子【作者】欧阳琦;杨青青;周晓樱;林戈;卢光琇;胡维新【作者单位】中南大学生命科学学院,湖南长沙410078;中南大学生殖与干细胞研究所,湖南长沙410078;中南大学生殖与干细胞研究所,湖南长沙410078;中南大学生殖与干细胞研究所,湖南长沙410078;中南大学生殖与干细胞研究所,湖南长沙410078;中南大学生殖与干细胞研究所,湖南长沙410078;中南大学生命科学学院,湖南长沙410078【正文语种】中文【中图分类】Q813.1小鼠胚胎干细胞依据其来源的发育阶段以及细胞的生物学特性可分为两类:一类是传统意义上的胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells，mESCs)，来源于植入前囊胚的内细胞团，处于原始多能性状态(naive)［1］;一类是上胚层干细胞(mouse epiblast stem cells，mEpiSCs)，来源于植入后胚胎的上胚层，处于始发态的多能性状态(Primed)［2］。
干细胞常用实验技术protocol
实验室内部的人胚胎干细胞protocol人类胚胎干细胞H1和H9维持方案一、试剂配制饲养层细胞培养基Fibroblast-DMEM Media (F-DMEM)DMEM (GIBCO 11960-044) 450mlFCS GIBCO 16000-044 50ml 10%Pen/Strep 2.5ml 50IU/mlL-glut GIBCO 25030-081 5ml 2uM/ml人类胚胎干细胞培养基HESC-MediaKO-DMED GIBCO 10829-018 480mlKOSR GIBCO 10828-028 120ml 20%10mM NEAA GIBCO 11140-050 6ml 0.1mML-glut(0.2M) GIBCO 25030-081 6ml 2mMPen/Strep 3ml55mM BME GIBCO 21985-023 1.1ml 0.1mMITS GIBCO 41400-045 6ml4-80C避光保存。
用前每50毫升加200-400ng bFGF细胞冻存培养基FBS-DMSOFCS GIBCO 16000-044 9ml 90%DMSO SIGMA D2650 1ml 10%细胞消化液Trypsin-EDTA0.25% Trysin-1mM EDTA GIBCO 25200-056 2ml 0.05%,0.2mMPBS(-) 14190-144 8mlMEF细胞有丝分裂终止液Mito CMitomycin C 0.2mg 0.05mg/mldd-H2O 15230-162 4ml避光保存。
Mito C的终浓度为10ug/ml即40吸ul 工作液加到2ml F-DMEM中。
.0.1% Gelatin(用于培养皿的包被)1% Gelatin 40ml 0.1%ddH2O GIBCO 15230-162 360ml高压消毒。
二、培养方案一) 饲养层细胞的培养1、主要实验材料（1）培养液为F-DMEM。
胚胎成纤维细胞的生物学特点
胚胎成纤维细胞的生物学特点1971年，Burrington发现胚胎皮肤创伤愈合后没有瘢痕组织学表现，首次提出“无瘢痕愈合（scarless healing）”的概念,由此引发了人们对无瘢痕愈合机制的研究。
无瘢痕的现象只出现在孕期前2/3阶段，之后过渡为少瘢痕期，一般选择研究的无瘢痕期：人孕75～100天，大鼠14～16天，兔21～22天,绵羊60～90天[1-4]，出生后则瘢痕期。
众多研究发现，胚胎无瘢痕愈合主要与环境、成纤维细胞、细胞外基质、细胞因子、基因表型等方面有关。
研究认为胚胎成纤维细胞（fetal fibroblasts,fFB）是胚胎无瘢痕愈合最主要的效应细胞[5],本文主要对皮肤胚胎成纤维细胞进行综述如下。
1胚胎皮肤成纤维细胞形态学皮肤fFB外形狭长，边缘不整齐，培养4～6天后会出现相暗的微粒，呈整齐的放射状排列，大小较心脏来源胚胎成纤维细胞小[6]。
在透射电镜下大鼠fFB 呈长梭形，细胞质内有丰富的粗面内质网，细胞核大，核仁明显，表面有许多短小突起，可见微绒毛核胞浆褶皱，随着传代数的增加，突起和绒毛减少，胞浆内质网扩张，排列无序，膜表明脱颗粒，胞浆出现空泡以及大小不均的板层状或同心圆状颗粒，线粒体数目减少，体积增大，高尔基复合体增多，溶酶体增大增多[7-8]。
2增殖与凋亡在无血清培养基里，胚胎成纤维细胞的培养情况如图1，胚胎成纤维细胞倍增时间为75.3h，正常细胞的倍增时间为41.1h，培养72h后细胞数目开始下降[9]。
胚胎成纤维细胞的凋亡受多种因素调控，其中PDGF-BB可以作用于PDGFR-β抑制胚胎成纤维细胞的凋亡，调节其增殖、迁移，从而对创面的愈合产生影响[10]。
3胚胎成纤维细胞与细胞外基质3.1胶原合成：胚胎的成纤维细胞与成体的成纤维细胞表型不同,其分泌胶原的能力强于成体,其中Ⅲ型胶原的含量比成体的高（占30～60%）,与I 型胶原相比,Ⅲ型胶原更易被特异的和非特异的胶原酶所降解,代谢较快，因此最终胶原沉积较少[11]，表现出无瘢痕的特征。
细胞培养：干细胞的培养
成体干细胞
➢ 是成体组织内具有自我更新及分化一种或一种 以上子细胞的未成熟细胞。
➢ 来源于成体组织或器官，一般具有组织特异性， 只能分化成特定的细胞或组织。为多能干细胞 或单能干细胞，如造血干细胞和上皮干细胞等。
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3、根据干细胞组织发生的名称进行分类:
➢胚胎干细胞 ➢造血干细胞 ➢骨髓间质干细胞 ➢肌肉干细胞 ➢成骨干细胞 ➢内胚层干细胞 ➢视网膜干细胞 ➢胰腺干细胞
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山中伸弥
约翰·伯特兰·格登
（Shinya Yamanaka） （ John Bertrand Gurdon）
2012年的诺贝尔生理学或医学奖获得者
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山中伸弥
1962年出生于日本大阪府，日本医学家， 京都大学再生医科研究所干细胞生物系教授
人生万事如塞翁失马：高中热衷柔道，受伤了10多次 (骨折)，最后阶段学习，考入国立神户大学医学部； 毕业后，蹩脚的整形外科医生；1989年，进入大阪大 学研究生院，毕业后，前往美国旧金山的格拉斯顿研 究所留学，开始从事老鼠的胚胎干细胞研究。1996年 回国后研究陷入停滞；1999年12月，成为奈良先端 科学技术大学院大学的副教授；2003年，日本科学技 术振兴机构为他提供了为期5年、总额3亿日元的研究 经费，至此逐步走向成功。
1999年12月，干细胞研究进展被《科学》杂志评选为该年度 世界十大科学进展之首。
2007年日本的Yamanaka研究小组和美国的James Thomson 研究小组分别获得诱导多能性干细胞 （induced pluripotent stem cell，iPS细胞）。
2013年，加州大学旧金山分校的丁盛团队发现了化学诱导多 能干细胞（CiPSCs） 。
无饲养层培养法：利用各种能分泌抑制分化 因子的细胞制备条件培养基或在基础培养基 中加入重组的LIF制备条件培养基。
纤维细胞实验报告
一、实验目的1. 掌握纤维细胞原代培养的基本步骤和注意事项。
2. 熟悉纤维细胞传代培养的操作方法。
3. 观察纤维细胞在不同培养条件下的生长情况，分析其生物学特性。
二、实验原理纤维细胞是一类重要的结缔组织细胞，具有合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白等细胞外基质成分的功能。
原代培养是指从生物体中直接取材进行培养，而传代培养则是在原代培养的基础上，将细胞分裂后分装的细胞继续培养。
通过原代培养和传代培养，可以获取大量的纤维细胞，用于后续的生物学研究和应用。
三、实验材料1. 实验动物：新西兰大白兔2. 试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、D-Hank's平衡盐溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液3. 仪器：超净工作台、倒置显微镜、CO2培养箱、移液器、培养皿、细胞培养瓶、酒精灯、剪刀、镊子等四、实验方法1. 纤维细胞原代培养（1）取新西兰大白兔后腿肌肉组织，置于D-Hank's平衡盐溶液中清洗。
（2）将肌肉组织剪成1mm×1mm×1mm的小块，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，37℃消化10-15分钟。
（3）消化结束后，用D-Hank's平衡盐溶液终止消化，用吸管吹打组织块，使细胞完全释放。
（4）将细胞悬液用200目筛网过滤，收集滤液。
（5）将滤液加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，吹打混匀，计数，调整细胞密度为1×10^5个/ml。
（6）将细胞悬液接种于培养皿中，置于CO2培养箱中培养，温度为37℃，CO2浓度为5%。
2. 纤维细胞传代培养（1）当细胞铺满培养皿底部时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞。
（2）消化结束后，用D-Hank's平衡盐溶液终止消化，收集细胞。
（3）将细胞悬液加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，吹打混匀，计数，调整细胞密度为1×10^5个/ml。
（4）将细胞悬液分装到培养瓶中，置于CO2培养箱中培养。
MEF及饲养层的制备(实验记录)
MEF及饲养层的制备(实验记录)mef及饲养层的制备（实验记录）1.mef的获取：（步骤4－12已经进行实践）（1）激素处理小鼠，同期发情和超数排卵（2）2：1合笼过夜(雌：雄)*r%m)e3y6i\（3）取出有阴道栓（即乳白色或淡黄色冻胶状物，确定其已经怀孕）的开始记时间为0.5天-u1}-b)o*p（4）抽出胎儿12.5-14.5天的小鼠为实验材料（5）颈椎脱臼法处死孕小鼠，放于盛有75%酒精的烧杯中消毒，拿到超净工作台上解剖，先剖开腹部皮肤，暴露子宫，然后换另外一套手术器械，用眼科镊提起近子宫颈端,分离子宫系膜,剪断子宫角，取出子宫，置于装有pbs的培养皿中。
（6）抽出胎鼠，在pbs中冲洗数次。
除去头、尾、内脏和四肢，仅领躯干部。
在pbs 中充份冲洗，弃除红细胞。
(用两个镊子协调即可除去羊水膜、胎盘、头尾、内脏、四肢)（若是想要培育神经干细胞，则用剪刀穗序前脑展开培育即可）（可以一起处置多个胚胎）1n.s#@$g$@（7）在新的培养皿中加入少量pbs，放入躯干部分，用眼科剪刀剪成1mm3以下的组织块碎片（可以剪的更碎一点，下步的消化时间就可以缩短）。
（8）重新加入2~4ml0.25%胰蛋白酶，培养箱中消化10―15min，消化完结后重新加入等体积（多加点也行及，只要不是太少提，确保全盘的中止消化反应）的mefmedium中止消化反应，轻轻王繇，并使细胞集中。
（搞原代消化的时间稍长，胰酶用量也小，若是搞传代，则只需重新加入500持续上升，最多1ml的胰酶，消化1~3min。
）（躯干非政府难于消化，搞原代和传代时，故都用0.25%胰蛋白酶；而脑组织较易消化（脑肿瘤非政府），原代和传代都用0.05%胰蛋白酶。
）（消化可能将不全然，也可以室温静置5－10min，弃非政府块，这样下面过滤器就相对难。
）（如果消化获得的细胞太太少，可以Vergt弃上清，pbs冲洗，再次提胰酶消化）（胰蛋白酶，trypsin,拉沙泰格赖厄县条件ph8.0，37度，溶液中钙镁离子和血清可以减少其活力，故消化用的胰蛋白酶中重新加入了edta。
纤维细胞资料
• 细胞周期：纤维细胞具有较高的增殖能力，细胞周期较
• 细胞表型：纤维细胞分化过程中，细胞表型会发生改变，
短，具有较高的更新速度
如α-平滑肌肌动蛋白的表达增加
纤维细胞的信号传导途径
纤维细胞内的信号传导途径
• 生长因子受体：纤维细胞表面表达多种生长因子受体，如PDGFR、FGFR等，通
过与其相应的生长因子结合，激活细胞内的信号传导通路
与纤维化的过程
• 细胞外基质：纤维细胞分泌的细胞外基质，如胶原蛋白，参与纤维化的过程
纤维细胞在肿瘤发生与进展中的作用
肿瘤发生
• 纤维细胞：纤维细胞在肿瘤发生过程中，通过增殖和分化，产生和分泌生长因子，
参与肿瘤的发生
• 细胞外基质：纤维细胞分泌的细胞外基质，如胶原蛋白，参与肿瘤的发生
肿瘤进展
• 纤维细胞：纤维细胞在肿瘤进展过程中，通过增殖和分化，产生和分泌纤维蛋白，
• 细胞形态：长梭形，细胞核呈椭圆形或棒状
• 细胞功能：产生和分泌纤维蛋白，参与组织修复和纤维化过程
⌛️
纤维细胞的类型与特点
纤维细胞的类型
• α-平滑肌纤维细胞：主要存在于血管和气管等器官的平滑肌组织中
• β-纤维细胞：主要存在于心脏和肌肉等器官的结缔组织中
• γ-纤维细胞：主要存在于肝脏和肾脏等器官的间质组织中
• 细胞筛选：通过细胞筛或免疫磁珠筛选的方法，将纤维
• 细胞条件：通过无菌条件、恒温恒湿、5%CO2等条件，
细胞与其他细胞分离
保持纤维细胞的正常生长
纤维细胞的功能基因组学研究
纤维细胞的基因表达谱分析
• 基因芯片：通过基因芯片技术，分析纤维细胞的基因表达谱，从而了解纤维细胞
的生物学特性
成纤维细胞的培养
成纤维细胞的培养1前言成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起。
根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞。
成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。
在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。
不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。
通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位[1,2]。
成纤维细胞的分离培养一开始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究细胞的老化、各种外来因子对细胞的损伤、细胞在体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。
由于皮肤成纤维细胞易于获取，又易于在体外生长，故目前皮肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛的运用，其分离培养技术已相对成熟，对其体外生长规律也有了较全面的认识。
成纤维细胞的原代培养可用酶消化法或组织块法，其中组织块法又因其操作简便、条件易于控制而应用更为普遍[3]。
2材料和方法2.1材料玻璃器材：细胞培养瓶、500ml盐水瓶、青霉瓶、刻度吸管塑料器材：细胞培养板橡胶器材：细胞培养瓶胶塞、青霉素瓶塞、翻口胶塞和胶管滤器；玻璃漏斗、微孔滤膜2.2试剂的配制水、0.4%酚红液、Hank’s液、MEM、无钙PBS液、双抗的配制、NaHCO3配制、新生犊牛血清（FCS)、原代和传代细胞分散液、3％谷氨酰胺、细胞生长液和细胞维持液、其他液体；洗液、无钙PBS胰酶液、Hank's液、2.3方法2.3.1试剂配制（1）细胞分散液：无钙胰蛋白酶加4倍无菌蒸馏水（2) 组织冲洗液：无血清MEM（3）细胞生长液：含10％FCS MEM2.3.2实验分配：每人1枚鸡胚，每人制备1瓶100mL培养瓶细胞。
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MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结2008-06-19 00:00 来源：丁香园点击次数：1517 关键词：MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网小鼠胚胎成纤维细胞的富集1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。
当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。
2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。
用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。
将子宫角移到10cm的皿里。
用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。
3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。
4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。
将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。
5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/ED TA继续剪。
再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。
此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。
6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。
7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。
将皿放回培养箱再孵育10分钟。
8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。
9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。
每个培养瓶中装大约3个胚胎。
10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。
11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。
12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。
13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。
一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。
这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。
注释：我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。
培养基成分：88％DMEM10％FBS1％NEAA1% 双抗对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。
小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代1、移去MEF培养基2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。
3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。
4、为了使细胞分散开，轻轻吹打细胞。
5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。
6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中，吹打几次，使细胞分散为单个的。
7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。
8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中，放在37℃培养箱中进行培养。
注释：MEF培养基成分：89% DMEM (Gibco # 12100-046)10% FBS (Gibco # 16000-044)1% NEAA (Gibco # 11140-050)MEF每传一代就会生长得更慢些。
你第一次传代的比例可以是1:5，但是最后一次的传代（第4代或第5代）比例应该是1:2。
小鼠胚胎成纤维细胞的冻存重悬培养基：80% DMEM20% FBS1% NEAA冻存培养基：60％DMEM30％FBS20％DMSO1、用不含钙镁离子的PBS洗一次细胞。
2、加入胰蛋白酶/EDTA37℃消化大约5min。
3、将细胞吹打下来。
4、加入与胰蛋白酶/EDTA等体积的培养基以终止胰蛋白酶的消化。
5、吹散大块组织。
如果还有大块组织存在，可将悬液加入到50ml的管中使其沉淀。
6、取上清液，将其分装到锥形管中，1000rpm离心5min。
7、每个冻存瓶中加入0.5ml（冻存液的一半体积）的重悬培养基重悬细胞。
8、逐滴加入等体积的（0.5ml/瓶）冻存培养基，混匀。
现在DMSO的浓度是10％。
9、每个冻存瓶中加入1ml的细胞。
10、迅速将细胞转移到冻存的容器中，-70℃冻存过夜。
（细胞不能长时间放置在室温而含有DMSO 的情况下）11、第二天将细胞放于液氮中长期保存。
注释：提前标注好冻存细胞的以下信息：细胞系名称传代的代数冻存细胞的数目日期Initials注明冻存/解冻形式小鼠胚胎成纤维细胞的解冻/复苏1、将冻存瓶从液氮中取出。
2、放在37℃水浴中快速解冻，being careful not to immerse the vial above the level of the c ap.3、当仅还有一点冰晶残留时，用95％的乙醇消毒冻存瓶的外面，并将其置于hood中。
（为什么用95％的乙醇消毒？hood是什么？）4、轻轻地上下翻转细胞一次，将它们放入15ml锥形管中。
5、想管中逐滴加入10ml培养基。
这一步操作不能少于两分钟。
做快了对细胞将是一种打击，你将得到比其他方法具有更低生活能力的细胞。
6、1000rpm离心5min。
7、将细胞重悬于10ml培养基中，然后放入T75培养瓶中。
8、放入37℃培养箱。
9、注明冻存/解冻的形式，以更新数据。
1、关于如何确底胚胎期12.5d~13d的小鼠？希望大家能够介绍一下自己所采用的方法，集思广益。
我所采用的方法是选择同一天出生的三对小鼠，到成熟（8~10 w）后，分三周合笼，（每周合笼一对），然后待最早合笼的小鼠产崽后，再取另两个雌鼠的胚胎。
不知道这样行不行，也没注意别人是怎样做的。
另外问了几个外科的同学也没找到可以查出小鼠孕期的仪器。
2、关于提取MEF的比较好的protocol3、关于MEF转染时起耐受性如何？这个我以后主要做这些，可能会积累一定的经验，但现在肯定有各位朋友已经从事或正在从事着方面的工作，希望能够分享经验。
4、关于其分泌细胞因子能力？我从一些文献上发现，MEF除了作为胚胎干细胞的饲养层以外，也是研究天然免疫的重要材料，如日本东京大学的AKIRA的实验室，大板大学的takashi fujita实验室就发了相当多的文章。
从这些文献可以看出，MEF分泌细胞因子能力远远强于HEK293等工程细胞，相当于肝实质细胞，略低于几种免疫细胞。
但较免疫细胞，我认为有其不可替代的优势：（1）其并不是主要发挥免疫功能的细胞，只有在受到外界刺激时才会应答，分泌细胞因子，免疫细胞在不受刺激时也会为了维持稳态而不断产生细胞因子，即使有严格的control 组，但专门的免疫细胞即使是同一种细胞（DC，NK，T）但不同的细胞分泌细胞因子的能力也是参差不齐的。
会造成control 相对不一致。
（2）另一方面，由于这些免疫细胞大部分都是悬浮的，不太容易转染，结果阳性率也会较低。
（3）现在的分离MEF的方法很便宜，不复杂，而分离纯的免疫细胞（如NK，DC），需要MACS，FACS等，这对目前国内的实验室经费相对紧张的情况来说，不是很划算。
因此除非是需要研究某一种免疫细胞，如果是为了研究天然免疫或者adaptive immune过程中某中基因，或者蛋白，或者某一信号通路等的作用，MEF 细胞不失为一种选择。
网友crepi 的观点：1、我每次取的是16~18天的胚鼠个人觉得无碍我倒更喜欢大一点的胚胎更好操作一点2、我取的是皮肤然后胰酶4度消化过夜第二天终止消化撕掉表皮留下真皮减碎用的100目滤网过滤这个胰酶消化的时间是个关键时间长了细胞容易死时间少了，表皮不容易揭下来我有此就是这样消化了15个小时结果接种下来的细胞不能贴壁全死了3、我用的培养液是DMEM+10%小牛血清培养液也是关键因为虽然都是成纤维细胞比较泼辣但总归是原代可能还是比较娇嫩我前几天就是这样后来发现是培养液出的问题测的PH值都8.3了细胞不死才怪毕竟细胞耐酸不耐碱4、原代培养的最大天敌还是污染网友baichangming的观点：MEF对培养基和血清的要求不高，一般的都行我用过高糖DMEM和D/F-12，生长情况都行，而且看不出什么差别。
血清也是以前用几百块钱的国产标准胎牛血清也长得也不错，因为要养干细胞，所以现在换成进口Gibco胎牛的血清（两千多/500ml），感觉细胞的状态确实好了一些。
我的血清浓度一般是1 6.66666%。
网友北羽迦楼的观点：细胞没别的，就是很容易老化，一般我都是1:5~1:3传代，3代之后细胞就出现衰老了，我感觉年轻增殖能力强的MEF应该有着清晰的细胞轮廓，细胞立体效果不错，在相差显微镜下，细胞核清晰，细胞纤长，正在分裂或是刚刚分裂的细胞没有伸出伪足，但是同样有着更加明亮的轮廓，与细胞边缘相比，细胞呈深色（我觉得是透光效果不好）。
一般在4×下观察最能看出细胞的状态，此时能看到细胞呈梭形或是三角形。
细胞铺展很厉害，细胞的透光效果增加，说明开始衰老。
衰老的MEF最好不要做feeder,但是也不是完全不好。
但是要是做转染或是感染的话，出现衰老的MEF就不行了。
所以一般就是3代以内做。
我们用的就是WiCell的protocal养，和前面那位战友发的差不多。
只是我们用1mg/ml Collengase IV消化40min，用什么酶不重要，我觉得最重要的就是种盘后的换液。
原代2小时不管还有多少米贴都不要，传代复苏后一小时就换。
消化的时候也是要舍得，0.05%Trypsin-EDTA(GIBCO)，5min消化不下来的也统统不要。
因为健康的MEF就是易消化易贴壁。
老化以及混杂的其他细胞（神经、上皮）就没那么快了。
附带一句，易消化易贴壁是fibroblast的共性。