石蜡切片免疫组化中抗原修复方法的选择和注意事项

石蜡切片免疫组化中抗原修复方法的选择和注意事项

免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是一种通过抗原抗体特异性反应来检测并定位蛋白的方法，目前广泛应用于组织病理学诊断。其中，抗原修复（Antigen repair，AR）是免疫组化过程中不可忽略的关键步骤。原因是组织经福尔马林等固定液固定和石蜡包埋后，抗原决定簇与核酸易发生交联，引起蛋白质空间结构的改变，导致抗原决定簇被封闭，使抗原与抗体的结合点减少，从而令抗原的阳性检测率及着色强度相对减弱。这种交联在高温加热或是蛋白酶水解的作用下会发生可逆反应，恢复蛋白的原有构象，这一过程就是抗原修复。

一AR常用的方法是否进行AR、采用什么方法进行AR 要按抗体说明书的要求决定，不同的抗体选择适合该抗体的AR方法，有的要求高温修复，有的要求酶消化。

➤微波法

方法：切片于抗原修复液中经微波炉内微波辐射5-20min。

它是利用微波每秒以24亿5千万次的快速运动产生瞬间热。微波辐射可以使各物质分子作极性运动，促进形成的醛键断裂开。分子间运动所产生的瞬间热可导致甲醛固定后的蛋白的变性。该法的特点是：产热迅速，容易操作，但也容易引起抗原修复液的沸腾，使得修复液温度不稳定。

➤高温高压法

方法：切片于抗原修复液中在高压锅中加热至沸腾，盖上压力阀至喷汽后持续1-5min。

该法利用高压和高热来促进醛键的断裂，当加热至开锅，加上高压阀后，汽体喷出，此时的温度在100℃-120℃之间，而高压也易使蛋白变性。

➤真空负压法

方法：切片于抗原修复液中在预先调至95℃的真空负压干燥箱中真空负压处理5-10min。

这是一种操作简单，效果特佳，温度恒定，能一次性处理大量切片的方法。该法特点是分子在失重的情况下四处飘游，可以增加各分子间的碰撞机会，而且恒定的温度能保证使甲醛固定的蛋白发生变性又不会使抗原修复液达到沸点。

➤酶修复法

方法：0.10%胰蛋白酶或0.40%胃蛋白酶在室温或37℃消化切片15-30min。

除上述两种常用蛋白酶，链霉蛋白酶、无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶等也可被用来消化切片。现今应用酶来消化切片，主要是根据抗体的要求来进行的，或者是在前面几种修复方法都达不到理想染色效果时才考虑选择和叠加的，因为酶消化容易引起脱片，甚至会破坏抗原性和组织结构，在消化的温度、时间上也较难把握。

目前微波法和高压锅法是常用的两种修复方法，其中高温高压比微波处理的染色结果的好。这可能是因为高压锅加压后可使温度达到120℃，而微波的温度仅能达到100℃，组织在120℃的高温下，使维持蛋白质三级结构的氨基酸侧链基团的次级链断裂，产生较多有功能的特征性的蛋白质三级结构，为抗体的结合提供了更多的机会。但因

其修复温度过高，脱片现象也较微波法严重。

一般而言，对于大部分胞质和胞膜表达的抗原，多采用微波修复法进行抗原修复，对于胞核表达的抗原和少部分胞质表达的抗原（如CD5、Bcl-2等），建议使用高温高压法修复。

二抗原修复液的选择

抗原修复缓冲液有多种，常用的有0.01M柠檬酸缓冲液（pH 6.0）、2-氨基-2-（羟甲基）-1，3-丙二醇缓冲液（Tris，pH 7.0～9.0）和乙二胺四乙酸缓冲液（EDTA，pH 8.0～9.0）修复液。

这几种缓冲液最大的区别在于pH值不同和是否存在EDTA。pH 对抗原修复影响很大，有些抗原可以在较大的pH范围内进行修复，而有些抗原只能在某一特定的pH值被修复。此外，高pH缓冲液更容易造成脱片和使组织中内源性生物素暴露。因此，在使用SP法进行实验时，对酶系丰富的组织，如肝、肾等，应优先使用低pH缓冲液进行实验。EDTA是一种钙或其他二价离子的螯合剂，钙离子可以诱导蛋白构象发生改变最终引起免疫活性的改变，即对于信号较弱的抗原能起到很好的修复效果。

对于大部分抗原的修复，我们建议优先使用0.01M柠檬酸缓冲液（pH 6.0），若是修复效果不理想，再考虑提高pH值或加入EDTA进行尝试。

三AR时温度和持续时间

蛋白经福尔马林等固定液固定后，要使其发生变性，温度必须在高于90℃，尤其是恒定在95℃时最好，这是因为：①修复液温度未达到沸点，不容易造成脱片；②能够解离和破坏与蛋白交联的甲醛醛键等；③处理时可以稳定控制和确定抗原修复的作用时间。

不同抗原修复方法，所需温度和持续时间也不同。例如：真空负压法需达到预定的温度和所需的负压（66.7KPa）后持续5-10min，微波修复时温度不好控制，抗原修复液容易沸腾，一般任凭其沸腾持

续5-10min，但要保证修复液足够防止干片。如果切片容易脱片，可以在修复液沸腾后关掉电源，待温度下降后，再重开电源。如此反复数次，使之持续10-15min。如果修复效果较差，也可以延长修复时间至20min。而高温高压修复法因其温度可达到120℃，只需在抗原修复液沸腾后，加上压力阀，出现喷气后，持续1-5min即可达到很好的修复效果。

应用不同的方法进行抗原修复时，应在达到其有效温度后再计算修复时间，才能更好地进行质控和达到理想的修复效果。

四AR时需要注意的问题

✤ AR后需自然降温

抗原修复持续时间过后，需放于室温中让其慢慢地降温，决不能为了争取时间，强行用冰块或冷水令其降温。这是因为当高温中的抗原蛋白分子链脱离了其它的束缚或联结，要有一个自然环境让其自然放松下来，随着温度的降低，它们会慢慢地恢复原来的形态和构型。如果用冰块和冷水强行令其降温，松开后的蛋白分子肽链突遇降温而固定下来，恢复不了原有的构型，则达不到预想的效果。

✤抗原修复液需足量

由于抗原修复多采用加热的方法使修复液沸腾，尤其是微波法产热更快，修复液容易挥发导致干片，从而造成假阴性以及背景着色。而足量的抗原修复液，也可以使得修复时温度更加稳定，有利于我们更好地对实验进行质控。

✤抗体与AR关系

在进行免疫组化实验之前，我们不仅要了解抗体的种属，还应知道其表达位置，是否需要AR和AR方式以及是否适用于石蜡切片