双向电泳技术.

溶的目标：
1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体 完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液
（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使 2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个 多肽的点的强度会下降）
2、溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、 脂类、 多糖和核酸等物质的去除
3、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解 状态
大基本支撑技术。
双向电泳 定义
双向电泳 （two-dimensional electrophoresis)是 一种平板电泳技术 ，是等电聚焦电泳和SDSPAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照PI 分离），然后再进行SDS-PAGE(按照分子大小）， 样品中的蛋白经过等电点和分子质量的两次分离 后，可以得到分子的等电点、分子质量和表达量 等信息。
待研究样本(如临床样本)常是各种细胞和组织混杂，而蛋 白质组研究的通常是单一的细胞类型。
样品处理
一般性原则：样品制备是双向电泳中最为关键的一 步，这一步处理的好坏将直接影响 2-DE 结果。 目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法 是多种多样，但都遵循几个基本的原则：
1.尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的 总蛋白，减少蛋白质的损失；
4、蛋白样品应在等电聚焦前新鲜配制，或80度分装冻存，绝对避免将样品反复冻融。
5、通过超离心去除所有颗粒性物质，因为颗 粒性物质或脂会阻塞凝胶孔路。
6、为了防止蛋白质被修饰，加入尿素后不要 加热蛋白质样品。当样品中含有尿素时绝 对不要超过37度，升高温度会使尿素水解 成异氰酸盐，使蛋白发生氨甲酰化修饰。
双向电泳的基本原理与流程示意
两性电解质
样品
pH 9 -
等点聚焦 (第一向)
聚丙烯酰胺
pH 3 +
分子量
第二向
pH 梯度(pI)
SDS-PAGE
2DE仪器系统
恒温水浴 垂直板电泳 仪（第二向）
电源
等电聚焦仪 （第一向）
双向电泳的优缺点
优点：根据电荷差异和分子大小分离蛋白，因此 能分离分子电荷相同但分子大小不同或者同分异 构体（分子量相同但构象不同）以及经过翻译后 修饰的蛋白（如电荷数不同的磷酸化蛋白和非磷 酸化蛋白，在双向电泳胶上出现一串水平斑点）。
双向电泳（2DE）示意图
等电聚焦，实现蛋白质按等电点进行分离
提取的总蛋 白溶液
大 分子量
SDS-PAGE 分离，使得 蛋白质按分 子量大小排 序
小
通过双向电泳使得不同等电点和分子量的 蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同
位置从而实现蛋白质的双向分离
由于2DE是依据蛋白质的两种不同性质，即等电 点和分子量进行分析，因此分辨率远高于其它任 何一种单一的电泳方法，是目前分析混合蛋白质 样品最有效的手段。另外，经染色得到的电泳图， 是个二维分布的蛋白质图并且双向电泳分离的结 果是蛋白质呈现斑点状而不是条带状。
提出生物学问题 实验组和对照组样品制备
双向电泳(2DE/DIGE)
凝胶图像分析
差异蛋白点选取
蛋白酶解及质谱分析 差异蛋白点的成功鉴定
生物学问题的解释
双向电泳技术应用中的关键步骤： 1、样品制备（蛋白提取）：
（1）细胞培养、处理和收集； （2）将细胞在IEF裂解缓冲液中溶解； （3）将样品离心以去除不溶的细胞碎片和DNA，提取
蛋白质组分析的首要要求
将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种 混合蛋白质进行分离、检测和分析 。
双向电泳技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋 白质混合物的首选技术。对于蛋白质组学的研究来说，它的 最基本的实验手段就是利用双向凝胶电泳在整个基因组水平 上检测蛋白质表达的情况。
蛋白质组学技术流程
2.表面活性剂 ： 经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少 一种表面活性剂来溶解疏水基团。强离子型去垢剂如SDS 会影响蛋白所带的电荷，不适合在等电聚焦中使用，因此 尽量选用非离子型或两性离子表面活性剂，从而保证蛋白 质仅依靠其自身的电荷进行移动，其中CHAPS和SB3-10 最好。
3.还原剂： 变性剂和表面活性剂是用来变性蛋白、暴露和溶解其疏水 区域的，为了让大多数蛋白完全展开需要还原二硫键，加 用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。 常用含自由巯基的DTT，DTT带电荷，在等电聚焦时迁移 出PH梯度，导致一些蛋白的溶解性丢失。 不带电荷的三丁基膦（TBP)效果更好，不但能增加蛋白溶 解性，而且有助于样品从第一相转移到第二相，另外 TBP 不带巯基，不需被烷基化，从而简化了IPG的平衡过程。
上清，-80℃保存。 2、蛋白质定量和上样：
（1）固相PH梯度干胶条（immobiline PH Gradient,IPG）水化、等电聚焦；
（2）IPG的平衡； （3）SDS-PAGE；
(4)蛋白质检测：考马斯亮兰染色或银染色； 3、图像分析及数据处理：
将染色后凝胶放在光密度扫描仪上，扫描后的图像用 PDQUEST 2DE软件分析，选择部分匹配的蛋白质斑点进行 比较。
样品裂解液
7M Urea，2M Thiourea，4％（w/v）CHAPS，40mM TrisBase，40mM DTT，2％ Pharmalyte pH 3-10
制备好的裂解液分装冻存-20度备用。
样品制备的基本步骤
破碎——最小限度的减少蛋白水解和其它形式的 蛋白降解原则,必须在低温下进行（蛋白酶活性 低）。
硫酸铵沉淀法 三氯乙酸(TCA)沉淀法 丙酮沉淀法
TCA-丙酮沉淀法 醋酸铵沉淀法
沉淀方法有可能改变样品蛋白的成分，如果双向电泳想要完全和精确 地得到样品中的蛋白质，避免使用沉淀和重溶的方法。
样品的溶解——是2-DE成功分离蛋白质的 最关键因素之一
样品的溶解直接关系到分离的分辨率，为使尽可能 多的蛋白质溶解，必须完全破坏分子间的相互作用，把 蛋白质复合物解聚和变性为单体形式，使其在整个分离 过程以多肽链形式存在，同时要避免对蛋白质的任何化 学修饰。
4.起载体作用的两性电解质
即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些 蛋白质也需要在盐离子作用下才能保持其处于溶 解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生 沉淀。
两性载体电解质的作用在于补充样品中的少量盐 分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电 解质的浓度应小于0.2%（W/V)。浓度过高会使 IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性， 在选择不同PH范围的IPG胶条时，也应使两性电 解质的pH值与之相符合。
2.减少对蛋白质的人为修饰； 3.破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使
蛋白质处于完全变性状态。
制备样品的具体原则
1、样品制备步骤越简单越好，避免目的蛋白 的损失或丢失。
2、裂解细胞或组织要防止蛋白降解。裂解细 胞应在低温下进行（冰水浴或者4度），最 好用加有蛋白酶抑制剂的裂解液直接裂解。
3、样品裂解液应新鲜配制，或分装冻存，而 且要采用高纯度的去离子尿素。
增加样品溶解性的手段
一些疏水蛋白尤其是膜蛋白很难溶解，为了促进其溶解， 常加入一些增溶剂如变性剂、表面活性剂、还原剂等。
1.变性剂 ：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展， 将其疏水中心充分暴露，降低接近疏水残基的能量域。其 典型代表是尿素和硫尿。 尿素是2D-PAGE中最常用的变性剂，其作用是可逆的，在 凝胶中的浓度必需保持在8mol/L以上。过低则达不到完全 溶解样品的目的，当尿素与硫脲结合使用时，极大地提高 了膜蛋白的溶解。由于硫脲难溶于水，高浓度的尿素能促 进硫脲的溶解，因此2mol/L硫脲常在5-7mol/L尿素浓度下 使用，硫脲浓度大于2mol/L会影响蛋白从第一向向第二向 转移，同时也抑制SDS与蛋白的结合，并提高脂的溶解度 从而降低等电聚焦(IEF)分辨率。
双向电泳经典工作流程
1、样品制备的基本步骤： ⑴破碎、⑵沉淀、⑶溶解、 ⑷去除杂质
2、等电聚焦电泳 3、两维间的平衡 4、SDS—PAGE电泳 5、染色 6、结果分析
为什么要进行样品制备 ？
目前双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质点(spot)， 而样品中的蛋白种类可达到10万种以上，复杂蛋白溶液的 跑胶如果不经过样本预分级处理，双向电泳结果图往往布 满斑点，使结果解释非常困难。很多感兴趣蛋白（特别是 低丰度蛋白）会被掩盖。。
7、最好用强烈变性剂直接裂解样品，这样可 以使蛋白水解酶立即变性失活。
样品制备
根据这些原则，样品制备需要4种主要的试剂 1、离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲
（thiourea） ； 2、表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，早期常使用
NP-40、TritonX-100 等非离子去垢剂，近几年较多的改 用如 CHAPS与 Zwittergent 系列等双性离子去垢剂； 3、还原剂（reducing agents） ，最常用的是二硫苏糖醇 （DTT） ，也有用二硫赤藓糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯 （TBP）等。 4、当然，也可以选择性的加入Tris-base，蛋白酶抑制剂 （如 EDTA、PMSF or Protease inhibitorcocktails）以及 核酸酶。
在的全部蛋白质。蛋白质组在生物学界得到了充 分关注，而蛋白质组的开门技术— — —双向电泳 由O ’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli蛋白 ,从此拉开了双向电泳在蛋白组
学中的研究序幕。
蛋白质组学
蛋白质组学：研究一种生物或一种细胞组 织内全部蛋白质组成及其活动规律的科学。
机械破碎 捣碎法、研磨法、匀浆法 物理破碎 温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法
化学破碎
有机溶剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿 表面活性剂：Triton、Tween
酶促破碎 自溶法、外加酶制剂法
沉淀蛋白——可溶性是关键（可选步骤）
蛋白质沉淀被用来从污染杂质（如盐、去污剂、核酸、脂类等）中有 选择性地分离蛋白质，否则这些污染杂质能影响双向电泳的结果。此 后再将沉淀物溶在样品液中。
双向电泳的作用和地位
双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是一种分析从细胞、 组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合 物的有力手段， 是目前唯一能将数千种蛋 白质同时分离与展示的分离技术， 其高分 辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是
其他分离方法所无与伦比的。 双向电泳技 术、计算机图像分析与大规模数据处理技 术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三
双向电泳 two-dimensional electrophoresis
段慧明 广西中医药科学实验中心
应用对象：蛋白质混合物的分离
运动方向：
等电聚焦电泳（第一向：水平方向）-重点介绍 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（第二向：垂直方向）
1994年Wilkins和Williams首先提出蛋白质组 （Proteome)的概念，其定义为在一种细胞内存
缺点： 不能分离疏水性及强酸强碱性蛋白； 不能分离低丰度蛋白； 灵敏度受样品量限制及染色效果影响； 不能完全自动化，耗时较长。
双向电泳的应用
分离复杂的蛋白质组，包括系统分离、鉴 定及定量；
预测蛋白质的翻译后修饰；
差别表达蛋白质组分析，研究细胞分化、 寻找疾病相关的生物标记分子、进行疾病 治疗情况的监测、药物开发及癌症研究等。
可视为分子生物学的大规模筛选技术。 目的在于： 1.归类细胞中的蛋白质的整体分布； 2.鉴定并分析感兴趣的个别蛋白； 3. 最终阐明它们的关系与功能。
蛋白质组学可分为三个领域：
1、经典表达蛋白质组学 2、差异蛋白质组学：通过某种方法和技术对
某些过程中的生物样品（细胞、组织或体 液等）的蛋白质表达丰度进行比较分析， 从而发现不同生理和病理条件下蛋白质表 达水平的变化情况。 3、功能蛋白质组学。
去除杂质—— 关键是尽量不丢失蛋白和 减少蛋白修饰
在样品中常常会含有像核酸、多糖、去污剂和代谢物等非蛋 白杂质，需要去除，否则会影响双向电泳的结果，这个过 程有时会造成蛋白的丢失以及蛋白的化学修饰和解聚，特 别是后者会导致双向电泳图谱中蛋白点的增多（由于电荷 的改变），所以操作中要多加注意。
1.核酸的清除 对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出