慢病毒包装和滴度检测方案流程

慢病毒包装、滴度测定方案流程
一、背景：四质粒的包装体系
1.含有目的基因的转染质粒
2.VSV-G：pMD2.G（包膜质粒）
3.Rev：pRSV-Rev
4.Gag/Pol：pMDLg/pRRE
二、包装细胞：293T
293T细胞由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，是经过腺病毒E1A基因的转染，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区。

该细胞贴壁松散，操作时请尽量轻柔；换液时需预热培养基。

培养条件：DMEM ＋10% FBS＋1% P/S
三、主要试剂
1.93T培养基：高糖DMEM（含丙酮酸钠、谷氨酰胺）+ 10% FBS + GlutaMAX
2.病毒收获培养基：取50 ml 293T培养基，加入0.5 g BSA（Sigma A9418）
和终浓度为10-15 mM的HEPES，0.22 µm过滤。

3.无内毒素质粒抽提试剂盒
4.Polybrene (10 mg/ml)：促转染试剂，提高转染效率。

四、包装步骤
1.Day1:汇合度90%的10cm dishs HEK293T细胞（~ 6×107/dish）按1：
1比例传代至15cm dishs，第二天细胞汇合度达到90%-95%（~
1.5×108/dish），培养基为Gibico高糖DMEM培养基（含10%FBS）。

2.Day2:
1)转染前2-3个小时更换培养基（含10%FBS)；
2)按照以下比例配制转染试剂：
Mix 1体积μlMix 2量DMEM（无FBS）1000μlDMEM（无FBS）1000μl
目的基因质粒25μgVGF190μl（1μg/μl）PMD2G7.5μgPSPAX215μg
Mix 1和Mix 2分别混合后，室温5-10min, 后将Mix 1和Mix 2混合，室温30min，加入至15cm dish中。

（细胞达到汇合度90%，细胞过少会
影响转染效率）。

3.Day3
6h-24h内更换新鲜培养基（含10%FBS），观察转染效率并拍照。

4.Day5
72h观察细胞状态并拍照。

收取上清培养基，过0.45μm滤膜，上清培
养基加入离心管中，根据体积上清加入5×PEG8000。

放在4℃静置过
夜。

5.Day6：含有病毒上清的离心管配平后离心，4000 g，4℃离心20 min。

弃
上清，用适当病毒保存液回溶混匀溶解，-80℃保存。

五、病毒滴度检测
实验室载体构建的时候，都插入了GFP标签，因此测定滴度就直接用流式检测。

1.病毒感染细胞
①感染前24h在12孔细胞培养板中以5×105个细胞/孔，均匀接种293T细
胞。

②将慢病毒进行梯度稀释，共做3个梯度，即每孔（500μl 无双抗、无血
清的DMEM培养基）中含50 μl、5 μl、0.5 μl病毒，振荡混匀后加至接种好细胞的24孔板中，加病毒之前将培养板中的培养基吸净。

③感染24h后，将培养板中的培养基更换为新鲜的DMEM完全培养基。

④感染48h后收集细胞进行流式检测GFP阳性细胞比例。

2.流式上机检测
收取细胞，实验组、空白组（未加病毒感染的293T细胞）。