食源性致病菌快速检测技术研究进展

食源性致病菌快速检测技术研究进展
食品是人类赖以生存的物质基础，其安全性直接关系到环境安全和人类健康。

近年来，随着
经济全球化进程的加快，食品安全已成为当今世界性公共卫生热点[1]。

据WHO估计，全世
界每年发生食源性疾病数十亿人，每年约有二百万儿童死于腹泻，其中66%以上是由细菌性
致病菌所致[2]。

食源性致病菌导致的疾病是食品安全的关键问题，而食源性致病菌是影响食
品安全的主要因素，因此，检测食源性致病菌是食源性疾病预防与控制的关键环节。

传统的
微生物检测方法主要包括细菌的分离培养和生化鉴定等，在实际检测中周期较长、工作量大,
对致病菌的检测特异性不高、灵敏度低、操作烦琐耗时，不能实现及时有效的监测。

随着免
疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，近年来已创建不少快速、简便、特异、敏感的微
生物学检测方法，明显加快了微生物检验速度，显著提高了检测水平，采用快速、准确而简
便的食源性致病菌鉴定方法已成为食品安全质量控制中的重要问题，因此快速、简便、特异
的检测方法成为研究的热点。

1、酶联免疫法
酶联免疫法是以酶或者辅酶作为标记物，标记抗原或者抗体，用酶促反应的放大作用来显示
初级免疫学反应。

既可测抗原，也可测抗体，可进行定性和定量测定，该法具有灵敏度高、
选择性好、结果判断客观准确、实用性强、样品处理量大等优点。

酶联免疫法主要分3类：
间接法测抗体、双抗体夹心法测抗原、竞争法测抗原。

前两种方法主要用于测定抗体和大分
子抗原，适用于临床诊断，而竞争法是测定小分子抗原的方法，尤其适用于食品安全检测[3]。

酶联免疫技术现已广泛地应用于病原微生物的检验，酶联免疫法可检测食品中沙门氏菌、军
团菌、大肠埃希菌0157等微生物。

其中沙门菌是引起细菌性食物中毒的最主要的致病菌，
严重影响着食品安全。

传统的沙门菌检测试剂复杂、周期长，远远不能适应实际需要，而酶
联免疫法则能方便、快速地检测出食品中污染的沙门菌。

文其乙等[4]应用直接酶联免疫法对500份蛋品进行检测，表明方法可靠，且阳性率比国标法高，经用生化实验进一步验证，确
认国标法存在一定的漏检。

范红结[5]采用单抗酶联夹心法检测李斯特氏菌，可测出每克样品
中5个细菌，且在48h内得出结果。

黄韬奋等[6]研究获得了抗肠出血性大肠埃希菌0157 : H7
的多克隆抗体，建立了用于食品样品检测的双抗酶联免疫检测法。

该方法对纯培养菌液检测
限为103—104 cfu/mL，对非0157菌株无交叉反应；经过增菌，鸡肉与牛奶染菌样品中的大
肠埃希菌0157的检出下限均为0.1 cfu/g(mL) 。

姜迪来等[7]将SPA-ELISA成功地应用到了对肉
制品中单核细胞增生李斯特菌的快速筛选检测中。

2、PCR技术
PCR技术即聚合酶链式反应，也称无细胞克隆系统，是1985年诞生的一项DNA体外扩增技术，该技术自问世以来，就以惊人的速度广泛地应用于生命科学的众多领域。

目前在食品工
程领域中致病微生物、转基因食品的检测等方面的应用也越来越受到关注。

PCR是近十多年
来应用最广的分子生物学方法，在食源性致病菌的检测中均是以其遗传物质高度保守的核酸
序列设计特异引物进行扩增，进而用凝胶电泳和紫外核酸检测仪观察扩增结果。

其中，依赖PCR的DNA指纹图谱、多重PCR、荧光PCR、定量PCR检测技术等应用最为广泛。

沙门氏菌属是肠杆菌科中最重要的病原菌属，在世界各地的食物中毒中沙门氏菌食物中毒常
占首位或第二位[8]，目前共发现2541个血清型。

黄金林[9]等从上个世纪90年代就开始尝试
利用PCR技术检测食品中以及临床样品和环境中的沙门氏菌。

范宏英[10]等建立了沙门氏菌
的实时定量PCR检测方法和同时检测沙门氏菌和其他菌的多重PCR体系，但在特异性方面还
存在一定的欠缺。

金黄色葡萄球菌广泛分布于自然界中，是引起食物中毒的主要病原菌之一。

目前，金黄色葡萄球菌常用的目标基因主要包括毒素相关基因和特异性鉴别基因。

王韶等[11]利用nuc基因序列建立了葡萄球菌PCR检测体系。

鉴于多重PCR技术的诸多优点，研究者针
对金黄色葡萄球菌目的基因，进行了不同组合的多重PCR研究。

而针对金黄色葡萄球菌检测
的成品RT-PCR试剂盒也已被开发和应用。

志贺氏菌属是一类革兰氏阴性杆菌，是人类细菌性
痢疾最为常见的病原菌，通称痢疾杆菌。

目前，用于志贺氏菌PCR检测的相关基因有侵袭相
关的ial基因、virA基因或ipaH基因。

吴平芳等[12]基于ipaH基因对志贺氏菌进行了实时
PCR快速检测，大大缩短了检测时间。

金大智等[13]运用实时荧光PCR 技术建立了食品中单
增李斯特菌的快速检测方法，设计的引物和探针的序列特异性强，省去凝胶电泳过程，降低
了污染的可能性。

对26种病原菌进行的检测结果表明，用实时荧光PCR法检测单核细胞增
生李斯特菌，更快速、敏感，特异性更高。

3、生物传感器技术
生物传感器是一种小型、便携的分析装置，由固定化并具有化学分子识别功能的生物材料、
换能器件及信号放大装置构成。

其工作原理是待测物质与生物活性材料发生生物学反应，产
生的信号由换能器转换成可定量和可处理的电信号，经二次仪表放大输出，最终获得待测物
浓度的信息。

生物传感器按识别元件可分为酶传感器、微生物传感器、组织传感器、细胞器
传感器、免疫传感器等。

DNA生物传感器的识别元件为核酸探针，因其便于与PCR技术结合
而逐渐成为研发热点。

生物传感器技术具有灵敏度高、特异性好、样品前处理简单、响应和
检测迅速、操作简单、携带方便、可重复利用等优点[14]。

卢智远等[15]研制成一种能快速测定乳制品中细菌含量的电化学生物传感器，实验结果表明，该生物传感器能有效测定鲜奶中的微生物含量。

近年来生物传感器技术发展迅速，随着微加
工技术和纳米技术的进步，生物传感器将不断的微型化，各种便携式生物传感器的出现在市
场上直接检测食品成为可能。

4、基因芯片技术
基因芯片也叫DNA芯片、DNA微阵列、寡核昔酸阵列，采用原位合成或显微打印手段，将
数以万计的DNA探针固化于支持物表面，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行
杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效检测或医学诊断[16]。

基因芯
片技术是目前最热门的用于多种食源性致病微生物快速检测的现代检测手段，进展十分迅速，应用也日益广泛。

与传统的微生物检侧方法相比，基因芯片技术的先进性主要体现在高通量
检测、简便快速、敏感性高等方面，而且结果通过自动化分析，避免了由于操作人员之间差
异导致的错误结果，是食品安全方面的重大技术突破。

洪帮兴等[17]采用带正电荷尼龙膜为芯片载体，以23S rRNA基因为靶序列建立了寡核昔酸芯
片系统，能够有效地检测大肠埃希氏菌、沙门氏菌等10个种(属)的细菌，显示了较高的灵敏
度和特异性，但对金黄色葡萄球菌等4个种(属)的结果不理想。

聂萌[18]运用通用芯片技术平
台建立了快速、准确、高通量检测食源性致病菌的方法。

顾鸣[19]等将自行设计和制备的基
因芯片应用于食源性致病菌，可以为常规标准检验方法的最终鉴定提供进一步佐证，尤其在
一些培养条件苛刻的致病菌（单增李斯特菌、空肠弯曲菌等）的鉴定，以及在VITEK仪无法
鉴定和手工鉴定判断误差的情况下，基因芯片方法将发挥其独特的技术优势，可大大提高检
验鉴定结果的准确性。

然而，基因芯片技术刚刚发展起来，许多地方还有待改进，如在样品
目标物放大的过程中，容易造成样品污染，也会影响到检测信噪比，从而影响测定的灵敏度；基因芯片检测过程中需要专门的仪器设备，其昂贵的费用导致该项技术在我国很难推广。

食品安全问题关系到人类健康和国计民生，随着经济社会的不断发展，必然会对食品中致病
菌的检测提出越来越高的要求。

随着科学技术的进步，一些新的微生物检验方法和手段将不
断涌现，目前，分子生物学方法是食源性致病菌检测方法的主要发展方向，使致病菌的检测
逐步向灵敏度高、特异性强、重复性好、简易、经济的方向不断发展，特别是近年来兴起的
基因芯片及DNA生物传感器技术，将从根本上改变微生物的检测方法。

尤其是高通量基因芯片技术的发展，除了快速大量的鉴定新的致病相关因子，还可以进行不同微生物之间基因组
结构和功能基因的比较。

利用基因芯片还可以进行病原菌及生存环境相互关系的研究，找出
抑制细菌生长的措施，减少病原菌对人类及环境的伤害。

随着基因芯片技术的不断成熟完善，试验和使用成本的降低，广大研究者利用自己量身定做的芯片进行特定微生物的检测，研究
特定生物的基因功能成为可能。

这些新技术的开发和发展必定对人类公共卫生、食品安全、营养健康与疾病预防等做出巨大贡献。

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