金铁锁三萜皂苷生物合成及分子机理分析
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2022年第16期现代园艺
金铁锁(
)为石竹科金铁锁属多年生单种属植物,生产地主要集中在云南、四川等西南地区,是当地一种特有药用植物。
《滇南本草》第一次记录了金铁锁,其根入药,可以起到散瘀、止痛以及消炎之效,是云南白药的一个重要组成部分。
之前针对金铁锁研究中,主要是对其有效成分开展研究,结果发现,成分主要为齐墩果烷型五环三萜皂苷类物质。
金铁锁在开采中完全依靠的是野生植物,同时这一植物生长非常缓慢,资源较少,长期开采进一步降低了野生资源,产量更低。
当前,金铁锁已被纳入到《中国植物红皮书》中。
金铁锁天然资源有限,同时三萜皂苷结构非常复杂,在应用中无法有效满足市场需求,急需寻找和扩大新的资源途径。
随着深入三萜合成途径研究,大量研究表明,三萜类的生物合成可以分为3个阶段,分别为前体的形成、骨架构建以及后期修饰,合成前体主要为乙酰辅酶A,再将其通过甲羟戊酸途径(MVA),实施一系列合成酶催化后可以合成三萜类骨架,进一步对其实施萜类后期修饰酶,在继续对骨架实施结构修饰后,可以得到三萜类皂苷化合物。
其中在萜类生物合成途径中,主要依靠关键酶的催化作用,直接影响萜类次生代谢的最终产物[1]。
首次植物萜类关键酶基因克隆报道出现在20世纪末,已经实现对多种药用植物萜类化合物关键酶基因的鉴定,并完成了克隆。
启动子()是特定的DNA序列,常位于基因5'端上游,是重要的基因调控元件,RNA聚合酶(RNA polymerase,RNA poly)能够准确识别启动子,并结合在启动子特定位点上进行启动转录。
启动子一般情况下采用的是GCN4-motif、G-box、TATA-box、CGTCA-motif等顺式作用调控元件,不但可以在种子中实现特异表达,也可以实现对MeJA或脱落
酸等激素的响应,所以不管是在种子萌发、衰老,还是在产物合成等生物过程中,都可以起到重要的基因表达调控作用。
如使用不同浓度的茉莉酸甲酯(methyljas monate,MeJA)诱导调控刺五加启动子(Eleutherococcus senticosus L.MDD mevalonate diphosphate decarboxylase)从而实现调控相应皂苷类化合物的含量。
其中在调控萜类合成酶基因启动子表达过程中,也会直接影响植物萜类产物合成,在分析过程中针对药用植物次生代谢相关功能基因启动子实施克隆,并进一步实施药物分析,更有助于了解药用植物的萜类合成机制[2]。
目前,对金铁锁三萜皂苷生物合成途径中鲨烯环氧酶基因的克隆与调控已有一定的研究和报道,但金铁锁鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因上游启动子对鲨烯环氧酶基因表达和转录的调控作用机理仍是未知领域[3]。
本次在针对金铁锁三萜皂苷分子机理分析基础上,探讨其生物合成技术,以此揭示SE启动子在金铁锁齐墩果烷型五环三萜皂苷合成过程中所具备的生物机理,为利用生物合成手段获得中药有效成分,提高濒危药用植物重要药用次生代谢化合物的含量提供研究基础。
1金铁锁三萜皂苷分子机理
在金铁锁中通过分离鉴定,可以得到的三萜皂苷主要为五环三萜类成分,通过分析金铁锁皂苷母核结构,发现其分布为齐墩果酸型,经过调控可以转化为3位(R1)以及28位(R2)接长度不同的糖链。
一般情况下,金铁锁苷元为丝石竹酸或皂角酸,之间不会出现太大改变。
在对其实施分离后所得产物为3—0—6'-0一甲基一13一D葡萄糖醛酸丝石竹苷,测定发现在原药材中的含量为3.75%。
通过金铁锁根也可以实现对两个齐墩果烷五环三萜皂苷的分离鉴定,最终分离产物为齐墩果烷-3α,16α-二羟基-12烯-23-酸-28-O-β-D-葡萄吡喃糖基(1—3)-β-D-葡萄吡喃糖基(1—6)-β-D-葡萄吡喃糖甙(Ⅰ)和齐墩果烷-3α,16α-二羟基-12烯-23-酸-28-O-β-D-葡萄吡喃糖基1—6 [-β-D-葡萄吡喃糖基(1—3)-β-D-葡萄吡喃糖甙(Ⅱ)。
进一步针对金铁锁根部的三萜皂苷成分实施,鉴
金铁锁三萜皂苷生物合成及分子机理分析
江舟
(云南中医药大学,云南昆明650500)
摘要:金铁锁,是我国西南地区独有的单种属植物,种群多在横断山区,为国家二级保护珍稀濒危药用植物。
三萜皂苷类化合物是金铁锁的主要活性成分,当前在其生物合成中主要采用酿酒酵母细胞工厂建构生产,也为微生物发酵生产三萜皂苷成分提供了可行性。
本研究在针对金铁锁三萜皂苷分子机理分析基础上,探讨其生物合成技术。
关键词:金铁锁;三萜皂苷;生物合成;分子机理
基金项目:云南省教育厅科学研究基金项目“金铁锁三萜皂苷合成途径关
键酶SE基因启动子的克隆及分析”(编号:2022J0361);云南省科技厅中
医药基础研究联合专项“转录因子对金铁锁三萜皂苷合成的调控研究”
(编号:2017FF117(-033))。
作者简介:江舟(1981-),女,汉族,山东滨州人,硕士,实验师,研究方向:
中药资源开发与利用。
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定后所得产物为9个齐墩果烷型五环三萜皂苷(见图1)。
三萜类化合物的组成为6个异戊二烯结构单元联结所得,大部分为五环三萜形式,同时也存在有30个碳原子。
五环三萜皂苷元碳架存在有以下类型,分别为:齐墩果烷型、木栓烷型、羽扇豆烷型等。
在中草药中,三萜
类化合物是重要组成成分之一,
相应的生物合成途径即为甲羟戊酸(MVA )途径。
2金铁锁三萜皂苷生物合成2.1金铁锁皂苷合成途径
MVA 途径是植物体内皂苷实施生物合成的主要途径,在合成过程中将乙酰辅酶A 作为主要供体,乙酰辅酶A 通过一系列步骤,比如缩合、还原后也会合成MVA ,之后继续对其实施焦磷酸化、脱水等处理会生成异戊二烯焦磷酸(IPP ),所生成物质能够构成为二甲丙
烯焦磷酸(DMAPP ),通过香叶二磷酸合成酶
(GPS )的作用,可以促进IPP 及DMAPP 合成新物质栊牛儿基焦磷酸(GPP ),进而在基焦磷酸合酶(FPS )影响下,可以促进IPP 与GPP 头尾连接下的转化,生成法尼基焦磷酸(FPP ),在鲨烯合成酶(SQS )的作用下能够转变为烯(SQ ),继续实施氧化处理能够获取2,3-氧化鲨烯,通过氧鲨烯环化酶(OSC )的影响,且对其实施相应的处
理,其中包括质子化、重排以及去质子化等,
可以将其转变为不同的三萜骨架,进而受到糖基转移酶(GT )、细胞
色素P450单加氧酶(CYP450)以及B 一糖苷酶等共同修饰影响,最终形成特定三萜皂苷[4]。
在金铁锁中所分离的皂苷,大部分是为齐墩果烷型五环三萜皂,随其实施SQS 处理可以转变为三萜前体SQ ,将其合成2,3-氧化鲨烯,最后在β-香树素合成酶(-AS )作用下能够合成五环三萜皂苷的骨架-香树素。
在合成途径中,SQS 对两分子FPP 起催化作用,在
头对头方式下合成SQ ;SQE 对鲨烯具有催化作用,
可以在C=C 双键间增添氧原子,进而将其转化为环氧化物,合成2,3-氧化鲨烯;2,3-氧化鲨烯在受到OSC 家族催化作用下,可以将其转变为结构功能不同的植物甾醇以及三萜类骨架,在三萜皂苷生物合成过程中为关键酶;植物三萜合成途径中,CYP450的作用即为后修饰,能够对其合成发挥羟基化及氧化等作用,可实现对不同种类底物的催化,但在此过程中也需要有多个CYP450s 参与,才能够合成最后产物;GT 在对皂苷元与糖产生催化作用中,可以实现和糖苷键的相连,
与之同时也具备高度转移性,实现对不同糖基或糖基受体的转移,在此过程中相应的糖基转移酶也存在差异。
在生物合成途径中,SQS 、SQE 、OSC 后修饰酶都是非常重要的酶,然而在三萜、甾醇、胆固醇等萜烯类物合成过程中SQ 为共同前体,在这些物质形成过程中SQ 为重要步骤之一,同时SQS 含量以及活性直接影响之后产物生成量[5]。
2,3-氧化鲨烯在-AS 催化作用下,
能够形成母核-香树素,是以上物质形成中的重要分支步骤之一。
通过以上分析可知,两个酶都在重要分支步骤上,同时对催化物质前后结构存在较大影响。
当前,在针对SQS 以及-AS 研究过程中,重点是关于基因克隆以及表达展开分析,在基因工程手段应用下实现对SQS 以及-AS 表达的调控,以此获得产物,截至目前甘草、人参以及青蒿等植物SQS 以及-AS 都已经成功被克隆和表达。
在本次研究
前期已进行了金铁锁的转录组测序工作,
并已克隆鉴定了金铁锁齐墩果烷型五环三萜皂苷生物合成途径中的鲨烯环氧酶(SE )关键酶基因长的全长cDNA 。
2.2金铁锁皂苷合成生物学
2.2.1常用菌株。
在合成生物学中,
当前可作底盘菌株的微生物种类较多,主要可以将其分为两大类,分别为具有遗传背景的微生物以及阿维菌素产出的微生物。
前
者常用的有链霉菌、大肠杆菌;
后者常用的有阿维链霉菌、恶臭假单胞菌等。
2.2.2底盘菌株酿酒酵母。
在合成生物学中,酿酒酵母遗传背景清晰,应用中的优点主要为发酵密度大、遗传
改造,另外,还拥有较为成熟的发酵方法、
具有较高生物安全性等,所以在工业生产中的应用较为广泛,
尤其是在遗传学分析、基因工程等中的应用较为广泛。
酿酒酵母体中所含成分,可以提供MVA 途径,进而促进萜类化合物的合成,也可以进一步完成麦角甾醇为主要产物
固醇类物质的代谢合成,
所以可在β-香树素等高修饰型外源天然产物生产中得到应用,所在生产天然产物底盘工程菌株中的应用较为广泛。
当前实施酿酒酵母基因工程菌建构中,研究重点主要集中在细胞工程高产所需有效成分上,同时已经具备较多完成天然产物细胞工程建构的实际案例,比如Keasling 团队在酵母中,通过合成生物学的应用成功实现了对青蒿素前体物青蒿酸的合成,且产量能够达到25g/L 。
在青蒿酸生物合成路线上,酿酒酵母菌的应用路线已经较为清晰,进而提出了相关的基因调控方法,以能够在酵母代谢工程菌的应用下实现对青蒿酸的合成,产量能够达到100mg/L ,在此基础上,能够大量合成青蒿素前体物质,这一物质对抗疟疾药物的主要成分。
另外,也有学者在研究过程中,通过酿酒酵母底盘细胞中,有效针对原人参二醇生物合成建构了相应途径。
在实验过程中
通过图1三萜皂苷类化舍榜1-9的母核结构(下转第200页)
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补植的秋色叶树种与常绿的树种相得益彰,季相分明,景观丰富,春季开花的树种繁华似锦,争奇斗艳。
5.4保护生物多样性维持森林生态平衡
通过林相改造,森林枝叶日趋浓密,林内植物变得丰富,为鸟类、兽类等野生动物提供良好的栖息和繁衍环境[6]。
同时,丰富森林公园的树种多样性,优势树木种类明显增多,为野生物种的保存和生物多样性的保护发挥重要作用。
5.5生态效益和社会效益不断提升
通过项目的实施,可改善森林生态环境,增加现有的森林资源,改善林区林种树种结构,提高森林生态功能等级和人们对生态公益林的认可,增强人们的环境保护意识,防止水土流失,减少自然灾害;进一步完善生态保护体系,美化环境,提高森林生态和社会效益。
6相关建议
6.1建议财政部门予以资金支持
森林公园公园通过林相改造后效果显著,但由于林木生长具有周期性,要不断进行日常管护,需要资金投入,建议按不低于1000元/667m2的标准对改造后的林木进行补贴,保障其良好生长。
6.2建议相关部门加强对松材线虫病防治的宣传及监管
希望相关部门加大宣传力度,提高市民对松材线虫病防治的认识,同时也要加强疫木监管体系,严格落实疫木源头管理,真正做到疫木源清除干净彻底,坚决阻断松材线虫疫情人为传播。
7总结
经过林相改造,逐步淘汰以马尾松为主的纯林,使整个森林公园园区内形成以针阔混交林为主的森林群落,增强森林自身抗病能力,加快优质后备森林资源培育,并丰富了景观,大大提高了森林覆盖率,优化林分树种结构,完善了生态保护体系,提高了森林质量。
(收稿:2022-04-18)参考文献:
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(上接第196页)
建构酿酒酵母工程菌株,可以实现对药用有效成分及其中间体的迅速生产,便于促进濒危药材的保护以及利用。
另外,在酿酒酵母的应用下,也可以有效完成人参中原人参二醇合成酶基因CYP716A47异源表达鉴定菌株的建构。
在此基础上,真正实现人参中达玛烯二醇合成酶基因PgDDS和原人参二醇生物合成酶基因CYP716A47的异源共表达,可见,在CYP716A47的应用下实现对目标化合物的生产。
通过以上分析可知,酿酒酵母的应用也为三萜皂苷异源代谢合成提供了相应的表达系统,有助于实现工程中的三萜皂苷异源工业化生产以及发展。
本次研究中主要分析金铁锁三萜皂苷合成下游途径,也可以将酿酒酵母作为底盘菌株。
3结语
综上所述,针对金铁锁三萜皂苷生成中,可以在合成生物学的应用下在微生物体内完成重建,进而一一解析其药用有效成分的生物合成途径,也可以进一步深入挖掘及调控生物合成途径以及关键酶基因,也有助于提升药用植物的有效成分含量,进一步提升中药材品质,能够为重要的良种选育、质量管控等提供相应的技术支持。
另外,在直接发酵法的应用下,将金铁锁三萜皂苷人工细胞有效成分实施生产,也是取得新资源的有效方式,进一步补充这一理论研究。
(收稿:2022-06-16)参考文献:
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