低温保存技术在生物制品中的研究进展

生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 4 期 547 ~ 555
Current Biotechnology ISSN 2095‑2341
进展评述
Reviews
低温保存技术在生物制品中的研究进展
刘容麟1 ， 王宁2 ， 李岩异1 * ， 张卫婷1
1.华北制药金坦生物技术股份有限公司，石家庄 050035；
2.石家庄农业技术推广中心，石家庄 050000摘
要：生物制品在储存中易发生多种物理和化学降解，因此生物制品长期保存技术对于减缓生物制品降解、保持生物
活性、延长储存期限十分必要。

目前，低温保存技术是生物制品长期保存最常用且有效的方法，其能极大地减少生物制品储存时，由于液态水带来的多种物理降解和化学降解导致的活性降低现象。

然而低温保存技术在生物制品的保存过程中仍会发生损伤，这些损伤包括冰晶损害、冰水界面吸附变性、渗透伤害等，使用合适的冷冻工艺和冷冻保护剂（cryoprotectant agents, CPAs ）对减少低温保存过程带来的负面影响有重要作用。

综述了低温保存技术在生物制品保存过程中的研究进展，包括低温保存的影响因素（冷冻保护剂、冷冻过程和其他影响因素）以及最新的低温保存技术，以期为生物制品在长期保存过程中克服损伤和维持活性提供参考。

关键词：冷冻；低温保存；冷冻保护剂；冻融DOI ：10.19586/j.2095­2341.2023.0045 中图分类号：TQ464 文献标志码：A
Reasearch Progress of Cryopreservation Technology in Biological Products
LIU Ronglin 1 ， WANG Ning 2 ， LI Yanyi 1 * ， ZHANG Weiting 1
1.North China Pharmaceutical Jintan Biotechnology Co., Ltd, Shijiazhuang 050035， China ；
2.Shijiazhuang Agricultural Technology Extension Center ， Shijiazhuang 050000， China
Abstract ：Biological products are prone to various physical and chemical degradation during storage ， so long -term storage tech⁃nology for biological products is necessary to slow down degradation ， maintain biological activity and extend storage life. At present ， low -temperature preservation technology is the most commonly used and effective method for long -term preservation of biological products ， which can greatly reduce the activity decrease resulted from various physical and chemical degradation caused by liquid water during the storage of biological products. However ， there are still some damages in the preservation pro⁃
cess of biological products using low -temperature preservation technology ， such as ice crystal damage ， adsorption denaturation of ice water interface ， and osmotic damage. The use of appropriate freezing processes and cryoprotectant agents （CPAs ） plays an important role in reducing the negative impact of low -temperature preservation process. This article reviewed the research prog⁃ress of low -temperature preservation technology in the preservation of biological products ， including the influencing factors of low -temperature preservation （cryoprotectants ， freezing processes and other influencing factors ）， as well as the latest low -temperature preservation technologies ， in order to provide reference for overcoming damage and maintaining activity of biological products during long -term preservation.
Key words ：freeze ； cryopreservation ； cryoprotectant ； freeze thawing
低温保存技术是一种利用极低的温度（一般为-80 ℃/-196 ℃），通过冷冻、低温保存和解冻的过程来实现对生物制品的长期储存和再使用的方
法［1］。

通过低温保存，生物制品可得到优质、有效和安全的保障，从而延长细胞、蛋白、病毒和疫苗原液等生物制品的储存期限，扩展生物制品使用
收稿日期：2023⁃04⁃04； 接受日期：2023⁃04⁃28联系方式：刘容麟 E -mail:*******************； *通信作者 李岩异 E -mail:*****************
生物技术进展Current Biotechnology
的灵活性。

然而，低温保存中仍然存在生物制品失活、降解和变性等现象（图1），因此需要选择合适的冷冻保护剂（cryoprotectant agents ， CPAs ）和优化低温冷冻工艺以减少生物制品长期储存过程
带来的损伤［2］。

本文综述了低温保存技术的最新应用进展，以期为生物制品低温保存相关研究提供技术参考。

1　低温保存技术
低温保存技术是利用低温条件，将体系中一切物理化学反应变得极为缓慢甚至停止为一种保存技术，常用于不稳定物质的储存。

低温保存技术在生物制品中，主要是通过降低生物、组织、细胞、微生物的酶活性，减缓代谢速度，防止生物大分子物质发生降解和氧化，从而实现生物制品的长期保存［2］。

低温保存技术可以分为一般冷冻、超低温冷冻和液氮冷冻。

一般冷冻是将样品置于温度为-40 ℃或更低的环境中，使体系的温度处于玻璃转变温度（glass transition temperature ， Tg ）或共晶温度（eutectic temperature ， Te ）以下，适用于细胞、细菌、酵母等微生物的保存。

超低温冷冻是
将样品置于温度为-80 ℃或更低的环境中，可长期保存DNA 、血液等大分子物质和生物组织。

液氮冷冻是将样品浸泡在液氮中保存，温度为-196 ℃，是保护珍贵生物遗传资源的最有效方法之一［3-5］。

2　低温保存技术的影响因素
生物制品是指由普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的，用于人类疾病预防、治疗和诊断的产品，主要包括生物大分子、细胞和组织等。

由于生物制品具有复杂度高和特异性强的特点，其生产和制备过程异常繁琐，质量控制极为严格，经济价值和社会价值非常高，
所以对于生物制品的保
A: 冷冻过程损伤；B: 解冻过程损伤；C: 低温储存过程损伤
图1　细胞及生物分子在低温保存中的损伤因素
Fig. 1　Damage factors of cells and biomolecules during cryopreservation
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刘容麟，等：低温保存技术在生物制品中的研究进展
存技术提出了很高要求。

目前，低温保存技术是生物制品实现长期保存最有效的手段之一，如何利用低温保存技术实现生物制品的长期保存，延长保存期限，维持其生物活性和功能完整性，是当前生物制品研究的一个重点关注领域。

低温保存技术虽然可以长期有效地保持生物制品的功能和活性，但各种条件和因素均影响其保存效果，主要影响因素包括冷冻保护剂、冷冻过程、冷冻速率、储存温度和解冻速率等。

通过对这些影响因素的研究，可以更好地解决生物制品在长期保存中存在的问题。

2.1　CPAs
CPAs是一种用于保护生物组织免于因冷冻而受损害（即由于冰晶形成的损害）的物质，目前被广泛应用于生物制品的低温保存中。

CPAs可以分为传统型保护剂和复合型保护剂2大类，在生物制品的低温保存中发挥着重要作用。

2.1.1传统CPAs 传统CPAs分为渗透性和非渗透性2种。

渗透性CPAs包括二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）、甘油、乙二醇、丙二醇和乙酰胺等，这些物质可以在细胞冷冻悬液完全凝固之前穿透细胞膜，提供细胞内的冷冻保护，也可以通过极性相互作用，定位在细胞膜磷脂的极性区域，取代水分子渗透到细胞膜内。

20世纪40年代，Polge 等［5］首次报道了10%~40%甘油对精子具有冷冻保护作用，其机制主要是能够避免因冷冻引起的细胞内电解质浓度升高问题［6］。

然而，后续研究发现有些细胞对甘油不敏感，如牛红细胞。

之后，研究者又发现DMSO是一种渗透性更强的物质，对人、牛红细胞和牛精子的冰冻损伤具有明显的保护作用。

Mokoena等［7］通过使用DMSO建立了海洋单细胞藻类的低温保存方法，保存后其存活率达到与冻存前相同的水平。

Prieto-Guevara等［8］研究了DMSO和甲醇（methanol， MET）作为CPAs在微藻保存中的效果，发现DMSO浓度在5%时微藻的细胞损伤率最低。

Nikitin等［9］发现甘油（90%培养基和10%的甘油）或乙二醇（90%培养基和10%乙二醇）作为CPAs，能长期储存溶血性曼氏杆菌，存活率分别为98.6%、95.7%，而不使用CPAs时，存活率仅为40.0%。

Kardorff等［10］研究发现低温保存人间充质干细胞和人真皮成纤维细胞时，使用渗透性CPAs如尿素和葡萄糖时，其细胞存活率与DMSO相当。

鉴于DMSO具有一定的细胞毒性，尿素和葡萄糖可作为替代DMSO的安全低温保护剂。

腺相关病毒一直是体外和体内基因转移最常见和最通用的载体之一。

腺相关病毒的生产过程难度大、周期长，其中一个关键问题是纯化后病毒载体的感染能力恢复。

一项研究发现缓冲液组和实验组（5%甘油和0.001% Pluronic F68）在4 ℃储存时，病毒的滴度损失程度相似［11］。

但是，在经过数次-80 ℃的冷冻/解冻循环后，与缓冲液组相比，实验组的病毒感染能力最为稳定。

非渗透性CPAs主要包括一些聚合材料和小分子物质，其中聚合材料主要为聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉（hydroxyethyl starch， HES）、聚乙二醇、葡聚糖等，小分子物质主要为蔗糖、海藻糖、明胶等。

这些物质可以和细胞外的自由水分子结合，减少冷冻过程中细胞外冰晶的形成，但不能防止细胞内冰晶的形成，因此在细胞冷冻保存中，不能单独使用非渗透性CPAs，需与渗透性CPAs结合共同使用，通过稀释溶质效应，改变溶液粘度提高保护效果［12］。

Marton等［13］使用1%大分子聚合物聚乙二醇（poly ethylene glycol， PEG）作为保护剂进行冷冻时，噬菌斑形成单位回收率接近100%。

通过冷冻和解冻的实验数据表明，在改变聚乙烯醇骨架结构后，无规则聚乙烯醇比有规则聚乙烯醇表现出更明显的冰重结晶抑制（ice recrystallization
inhibition， IRI），聚脯氨酸也具有冰晶抑制活性，可保护生物体免受冰冻损伤［14］（表1）。

2.1.2复合型CPAs 为了平衡渗透性CPAs毒性和保存效率之间的矛盾，有效的策略是将渗透性CPAs与非渗透性CPAs两者相结合，即形成复合型CPAs。

通过降低渗透性CPAs的浓度，减少毒性，利用非渗透性CPAs减少体系冰晶的形成，实现细胞更好的保存。

Boafo等［26］研究发现不同类型的低温保护剂具有不同的作用机制，而复合型CPAs对脂质体的低温储存效果更好。

Fujita等［15］尝试探索不含DMSO的低温保存液冷冻人脂肪源间充质基质细胞，结果表明，在乳酸林格氏溶液中加入3%海藻糖、5%右旋糖酐和2.5%~5.0%丙二醇，可以较好地恢复冻融后的人脂肪源性间充质基质的细胞活性，这在细胞治疗中具有很好的前景。

Guo等［27］发现复合型CPAs在-80 ℃和-196 ℃均可以显著提高法氏诺卡氏菌和鼠疫耶尔森氏菌疫苗株的存活率。

法氏诺卡氏菌保存最佳复合CPAs为0.292 mol·L-1蔗糖、0.62 mol·L-1
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左旋肉碱和2.82 mol·L-1甘油，鼠疫耶尔森氏菌疫苗株保存的最佳复合CPAs为左旋肉碱0.62 mol·L-1、甘油8.46 mol·L-1、蔗糖0.292 mol·L-1。

Xin等［28］研究发现，通过使用甘油和海藻糖等组成的复合型冷冻保护剂进行冷冻保存时，可以有效保护DNA 折纸纳米结构免受冻结损伤，并不会对其形态产生不良影响，为DNA折纸纳米结构在低温下长期保存提供了基础。

2.1.3新型CPAs CPAs的研究和应用有着更广阔的前景，随着现代科技的不断发展，CPAs种类也越来越多，并不断涌现出新型的冷冻保护剂，如抗冻（糖）蛋白、大分子聚合物等，这些新材料的应用，不断推动着低温冷冻保护技术的进步。

生存在极冷环境中的生物拥有一种特殊的冷适应能力，能产生一类抵御寒冷的蛋白质。

这类保护性蛋白质被称为抗冻蛋白（antifreeze proteins，
AFPs）或抗冻糖蛋白（antifreeze glycoproteins，AFGPs），其具有独特的冰晶控制功能。

迄今为止，在天然鱼类、昆虫、细菌等体内发现了各种各样的AFPs和AFGPs。

AFPs平面与冰晶之间的优先结合导致冰表面的微曲率变平缓，从而抑制了冰晶的生长，使其能够作为抑制冰再结晶的冰重结晶抑制剂（ice recrystallization inhibitors，IRI），AFGPs 是迄今为止最有效的IRI［29］。

Sreter等［17］研究了来自光滑鳖甲的抗冻蛋白在人胚胎肾细胞低温保存的效果，发现该抗冻蛋白与DMSO联合使用能够显著提高低温保存细胞的存活率。

另外，Sun等［18］研究表明，在人胚胎皮肤成纤维细胞低温保存缓冲液中，添加AFGPs可显著提高细胞的存活率，与非糖基化AFPs的研究结果相符。

AFGPs经半乳糖部分化学修饰后，具有额外的疏水性基团，相较未经修饰的AFGPs，显著提高了人红细胞恢复活力。

此现象可能的作用机制是AFGPs通过疏水相互作用插入细胞膜中，改变了酰基链的构象，降低了膜通透性，从而提高了细胞的存活率。

聚合物具有良好的物理和化学稳定性、可调性和生物相容性，已成为广泛应用的低温保护剂。

它们可以有效地调节低温下的水分子运动和
表1　低温冷冻保护剂及特性Table 1　Cryogenic protection materials and their characteristics
保护剂渗透类型
渗透型
渗透型
渗透型
渗透型
甲醇非渗透型
非渗透型
非渗透型
非渗透型
非渗透型
非渗透型
非渗透型
非渗透型
非渗透型
非渗透型
非渗透型
非渗透型
非渗透型
非渗透型
非渗透型
非渗透型
种类
有机小分子
有机小分子
有机小分子
有机小分子
糖
糖
糖
糖
聚合物
蛋白质
糖蛋白
蛋白质
氨基酸
纳米材料
聚合物
聚合物
聚合物
聚合物
聚合物
聚合物
名称
甘油
二甲基亚砜
乙二醇
丙二醇
蔗糖
海藻糖
甘露醇
葡萄糖
羟乙基淀粉
抗冻蛋白
抗冻糖蛋白
白蛋白
半胱氨酸
氧化石墨烯
海藻酸盐
聚乙二醇
海藻糖基聚合物
水凝胶
聚乙烯醇
聚脯氨酸
保护作用
渗透保护、抑制冰晶
渗透保护、抑制冰晶
渗透保护、抑制冰晶
渗透保护、抑制冰晶
抑制胞外大冰晶、提高玻璃转化温度
抑制胞外大冰晶、提高玻璃转化温度
抑制胞外大冰晶、提高玻璃转化温度
抑制胞外大冰晶
抑制胞外大冰晶
抑制胞外大冰晶、抑制冰重结晶
抑制胞外大冰晶、抑制冰重结晶
抑制胞外大冰晶
抗氧化
封装保护，快速导热
包封保护
包封保护
包封保护
包封保护生物材料、抑制胞外大冰晶
抑制冰重结晶、影响冰形状
包封保护生物材料、抑制冰晶、抑制重结晶
参考文献
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晶体生长过程，从而起到保护生物制品活性的作用。

聚合物通常具有较高的Tg。

Tg值越高，其结构越稳定，越能够保持在低温环境下的形态和活性。

聚乙二醇、聚乙烯醇、海藻糖聚合物以及多聚脯氨酸等是聚合物中典型的低温保护剂。

Diaz-
Dussan等［23］使用皮肤成纤维细胞、HeLa（宫颈癌）和PC3（前列腺）癌细胞系，在控制速率和超快速冷冻方案下孵育24 h，成功地保持了高水平解冻后细胞膜的完整性，并通过差示扫描量热法证实了海藻糖聚合物作为CPAs具有独特的冰再结晶抑制活性。

Feyzmanesh等［22］研究也表明使用海藻糖聚合物作为保护剂可以有效保存人类精子。

使用DMSO和乙二醇等小分子时，需要较高浓度，而这些分子在化学和遗传学上对细胞有毒害作用，因此在临床使用中受到限制。

Qin等［30］研究表明冻存液中使用L-脯氨酸低聚物后，DMSO和乙二醇用量大大减少，同时大幅提高了卵母细胞存活率。

此外，有研究表明使用圆二色光谱、动态冰成形和傅里叶变换红外光谱等方法检测对聚L-丙氨酸-co-L-赖氨酸与聚乙烯醇，发现二者的IRI活性与其α螺旋度、疏水/亲水平衡、分子量以及聚合物与冰晶相互作用的程度有关［22，25］。

氧化石墨烯是一种高导热性材料，在低温保存方面具有广泛的应用价值。

它可以制成非常薄且坚韧的保护层，为冷冻样品在极低温度下提供有效的保护。

此外，氧化石墨烯还可以作为传热介质，通过快速降温来避免结晶和变性或者通过快速升温来避免重结晶带来的冰晶损伤。

传统的胚胎低温保存技术面临着加热和冷却速度较慢的瓶颈，而氧化石墨烯的高导热性可以改善这一问题。

在一项研究中，氧化石墨烯纳米颗粒被添加到新型导热冷冻溶液中，可以用于小鼠囊胚的低温保存［26］。

与传统的糖溶液相比，氧化石墨烯可以使胚胎冷冻玻璃化后再膨胀、孵化和着床不受影响，同时还可以防止细胞和分子的应激，下调促凋亡基因Bcl⁃2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein， BAX）和转化相关蛋白53（transformation related protein 53， Trp53）的表达，体现出其作为胚胎CPAs的潜力。

另一项研究评估了氧化石墨烯作为CPAs对奶牛动物精子活力的保护效果，结果显示将氧化石墨烯添加到三羟甲基氨基甲烷蛋黄甘油扩展剂中可以改善牛、水牛精液解冻后的品质［31］。

综上，氧化石墨烯作为导热材料在生物
制品低温保存领域具有巨大的应用前景。

2.2　冷冻过程
冷冻过程会对生物制品的质量有多种影响，如生物制品结构和功能的改变、生物反应速率的变化、溶解性和稳定性的改变。

由于生物制品具有复杂的结构和成分，因此冷冻过程需要精确控制以最大限度地减少损伤。

冷冻过程中需要注意的重要因素包括：储存温度、冷冻速率、解冻速率和其他因素。

通过对这些冷冻过程机制的研究，可以更好地解决在生物制品冷冻过程中造成的质量损害。

2.2.1储存温度在生物制品冷冻过程中，应选择足够低的储存温度，使整个溶液体系降至Tg以下，整个物质体系变为固态，以避免降解反应和溶质对细胞或生物分子的破坏。

在Tg附近或之上，体系仍会有粘稠的液体水流动，引起可能的物理或化学降解反应以及溶质浓缩效应，造成生物制品活性的破坏。

研究表明，在Tg以下长时间存储的人类精子，大部分在解冻后表现出良好的运动性能［5，16，32］。

细胞在低温储存过程中，传统的手动储存方法常常因反复暴露于室温而给细胞储存带来极大影响。

为了解决这一问题，Xu等［33］开发了一个自动化冷冻保存系统，在受控温度下（-150 ℃以下）进行细胞处理，最大程度减少环境温度波动对储存细胞的影响。

该团队以人类脐带间充质干细胞作为研究对象，比较手动和自动冷冻保存方法储存效果的差异，研究结果表明自动系统处理比手动处理的人类脐带间充质干细胞表现出更高的细胞活力、恢复率和细胞增殖能力。

输血用血小板的保质期只有7 d，大大限制了血小板的使用。

近期，Guinness等［34］研究表明，通过在
-80 ℃下进行冷冻保存，可将其保质期延长至少1年。

血小板的冷冻保存和体液储存方法的安全性并无差异。

这项研究通过可靠的数据支撑了干预方案的可行性，研究证明这种方案在术中或重症监护病房患者中可以应用，从而增强了对该方法安全性的支持。

Zhan等［35］通过向黑腹果蝇胚胎中添加CPAs，成功使50%以上的胚胎孵化，25%以上的幼虫成功发育为成虫。

在连续冻存5代和6个月后，幼虫仍保持正常的性别比、生育力以及原始突变。

此外，Zhang等［36］也使用CPAs保存新鲜的人体脂肪组织，在-196 ℃液氮中保存1个月后，发现使用
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70%甘油处理的组织中甘油醛-3-磷酸酶活性最高，效果最好，组织结构也更完整。

2.2.2冷冻速率在冷冻过程中，采用不同的冷冻速率会对生物组织、细胞、蛋白质和核酸的回收率产生不同影响。

快速冷冻时会形成多而细小的冰晶，产生较大的冰水界面积，冰水界面易吸附蛋白，引发蛋白质变性。

在缓慢冷冻时，小冰晶会逐渐生长为大冰晶，大冰晶的机械损伤会对细胞的细胞膜、细胞器造成破坏［37］。

此外，缓慢冷冻容易导致溶质分子在冰晶形成过程中逐渐浓缩，从而未冻结的溶液部分形成渗透梯度，导致细胞脱水并造成不可逆性伤害［12］。

该现象被称为冷冻浓缩效应，冷冻浓缩会使溶质浓度增加，进而导致蛋白质聚集或沉淀，从而影响细胞内部结构和功能［38］。

因此，在不同的生物制品制备过程中，需要选取最合适的冷冻速率，以保证生物组织、细胞、蛋白质、核酸等生物制品的最大回收率［34］。

Zhang等［39］探讨了冻融过程中肌原纤维与冻融速率之间的关系，结果发现与快速冷冻相比，缓慢冷冻会导致解冻损失增加28%，肌原纤维形成大冰晶并且肌原纤维的持水能力下降，表面疏水性增加，更容易出现蛋白变性。

Cao等［37］研究了冷冻速率对乳酸脱氢酶活性的影响，发现在0.025 mg·mL-1浓度下，快速冷冻60 ℃·min-1比缓慢冷却0.8 ℃·min-1更具破坏性。

然而一些研究表明，双螺旋DNA在不同条件下的冻融对其影响并不明显。

例如，Shikama等［40］通过对小牛胸腺脱氧核糖核酸进行冻融，直接冻至液氮中，其构象和活性在前后未发生变化。

Fuchizaki等［41］则采用程序冷冻法和深度冷冻法冷冻红细胞，在4~ 8周后进行解冻和比较，发现程序冷冻法的回收率为85.9%，明显高于深度冷冻法的81.1%，而且程序冷冻法得到的红细胞抗溶血性更强。

James等［42］通过采用快速冷却法和在-7 ℃和-14.5 ℃的100%氘化甲醇中孵育方法，成功提高了史蒂芬按蚊的孵化率，进而实现长期储存。

2.2.3解冻速率解冻过程中，快速解冻不仅能促进体系整体快速融化，还能减少冰晶的重结晶，从而有效减少生物制品的活性损失。

相比之下，缓慢解冻会导致冰晶重结晶成更大的冰晶，从而造成生物制品的机械损伤。

此外，解冻过程中存在危险温度区（-15~-160 ℃），这些温度区域会促进小冰晶向大冰晶的转变，并且升温速度对胞外冰成核和生长有着重要的影响。

因此，在升温过程中，抑制冰晶的形成和生长对于提高低温保存效率至关重要。

冰的再结晶是一个复杂的过程，且与不同的增温参数密切相关。

从低温中恢复有活力的细胞和组织需要快速解冻，以减少重结晶的发生。

Farrant等［2］研究表明，少量肌肉样本对快速解冻具有较好的适应性，但较大的样本则无法达到同样的效果，因为样本在解冻时，热量的传递非常重要。

此外，解冻速率对生物体物质的活性损失也有显著的影响。

Cao等［37］指出乳酸脱氢酶的活性会随着解冻速率的加快而提高。

不过，也有例外情况，例如在解冻过程中，分泌型免疫球蛋白A的浓度和溶菌酶活性在25 ℃缓慢解冻时，活性显著高于快速解冻的水平［43］。

近年来，一些研究者尝试将细胞冷冻成薄片的形式，以减少在解冻过程中冰重结晶对细胞的伤害，进而提高细胞的生存率。

此外，有研究者尝试运用磁场、激光场、电场、声场等手段来促进细胞和组织快速均匀传热解冻，有效减少了冰晶对细胞和组织的危害，从而显著提高了细胞的存活率［24］。

冷冻和解冻程序是多种细胞疗法中的最后步骤之一［44］，无论是造血和非造血产品（如间充质干细胞和诱导多能干细胞），优化冷冻解冻程序和保护剂配比，都可以实现最佳的活力和有效的细胞剂量，为提高细胞治疗在临床使用中的安全性和有效性提供关键优势，使得细胞治疗成为经济上可行和可持续的药物。

此外，低温保存技术也成为红细胞罕见血型患者长期储存的有效方法。

然而，冷冻/解冻过程中冷冻红细胞有时在解冻后会引起严重的溶血。

Fuchizaki等［41］采用程序冷冻法和深度冷冻法冷冻红细胞，得到了高达85%的细胞回收率。

2.3　其他因素
2.3.1氧化应激氧化应激可导致蛋白质、脂质、核酸等大分子的破坏，最终导致细胞凋亡和坏死［45］。

为了维持细胞的抗氧化防御系统平衡，精子低温保存中通常需要添加抗氧化剂。

在-196 ℃下储存的精子解冻后存活率明显高于-80 ℃下储存的精子，这是因为在-140 ℃以上的纯水中仍有液态水存在，且液态水已被证明可支持细胞代谢并产生活性氧，从而加剧氧化应激损伤［46］。

Reda等［20］在保存水牛精液过程中分别添加半胱氨酸50和
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100 μmol·L-1，发现精子解冻后的活力和正常度明显提高。

研究表明，胱氨酸的加入显著提高了细胞膜的完整性，提高了体系在低温储存过程中的抗氧化能力，从而进一步提高了精子活性。

2.3.2缓冲液冷冻过程中缓冲液的pH、盐浓度是缓冲液对细胞的主要影响因素。

pH的升高可能导致蛋白质聚集，进而导致蛋白质降解。

而盐浓度的增加则可能影响敏感细胞的存活率，并导致生物大分子回收率降低［2］。

Thorat等［19］采用微流成像（micro flow imaging， MFI）技术研究牛血清白蛋白和β-半乳糖苷酶在磷酸盐缓冲溶液中进行冻融循环过程的聚集行为，并测量了溶液从20 ℃降至-25 ℃过程中pH的变化。

该研究发现在缓冲液浓度为100 mmol·L-1时，冷却导致BSA 和β-gal缓冲液的pH分别降低了3.1和2.7个pH 单位，这是由于磷酸氢二钠的结晶引起的。

2.3.3生物分子浓度在理想的冷冻保护曲线中，保护剂和目的蛋白的浓度比例会影响冻融后的产品质量。

研究表明，采用蔗糖作为CPAs对治疗性单克隆抗体的冻融具有积极作用。

对于高浓度单克隆抗体蛋白（30 mg·mL-1和40 mg·mL-1），蔗糖能够有效阻碍颗粒形成；然而在低浓度单克隆抗体蛋白的制剂中，蔗糖反而会诱导颗粒形成。

此外，蔗糖只有在高于10 mg·mL-1蛋白浓度下才能发挥单克隆抗体的保护作用［16］。

3　展望
低温保存技术是保证生物制品长期储存不可或缺的重要工具，而在新型程序化低温保存技术的基础上，新的生物制品需要同样先进的CPAs来保护宝贵的生物样本。

未来，智能化的低温保存设备和管理系统将通过数据分析和可视化，实现对低温保存条件的监控和调节，利用新技术优化生物制品低温保存的环境，提高低温保存效率和质量。

同时，生物制品的冷冻最佳工艺的探索将成为今后低温保存技术的重要趋势。

在这个背景下，新型低温保护剂如复合CPAs、抗冻蛋白、聚合物以及氧化石墨烯等将会推动生物制品的低温保存技术向更高级别的方向发展，为生物制品的低温保存提供更加有效的保存条件。

同时，继续探索新型低温保护剂向无毒、低用量、高保护效能的方向发展仍将是未来研究的热点领域。

随着新技术和新材料的不断涌现，低温保存技术将不断地发展和完善，为生物制品的保护和应用提供更加可靠和高效的支持。

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