双重膜滤过式血浆置换清除肾移植受者供体特异性抗体的临床观察

第８卷第６期２０１７年１１月Ｖｏｌ．　８ Ｎｏ．　６　Ｎｏｖ．　２０１７
器官移植
Ｏｒｇａｎ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ【摘要】　目的　探讨双重膜滤过式血浆置换（DFPP ）对高致敏肾移植受者的供体特异性抗体（DSA ）的清除效果。

方法　4例肾移植高致敏受者共进行了7例次DFPP 治疗，采用Luminex 技术监测DSA 的变化，观察治疗效果、急性排斥反应发生情况及其不良反应。

结果　治疗后DSA 的MFI [1 036（0～4 113）]较治疗前 [6 446（2 999～12 905）]明显下降（Z =-2.503，P =0.012）。

4例高致敏肾移植受者均未发生超急性排斥反应，仅有1例发生急性排斥反应且通过术后DFPP 治疗及调整免疫抑制剂得到逆转。

受者随访至今移植肾功能良好，未发生排斥反应。

DFPP 治疗引起白蛋白水平下降。

结论　DFPP 可以有效清除受者体内的DSA ，可以安全、有效地预防高致敏人群肾移植术后急性排斥反应。

【关键词】　双重膜滤过式血浆置换；肾移植；供体特异性抗体（DSA ）；受者，高致敏；抗体介导的排斥反应（AMR ）；Luminex 技术；人类白细胞抗原（HLA ）抗体；白蛋白
【中图分类号】R617，R392.4　【文献标志码】A 【文章编号】1674-7445（2017）06-0009-05
【Abstract 】 Objective To investigate the effect of double filtration plasmapheresis (DFPP) upon the removal of donor specific antibody (DSA) in highly sensitized recipients with renal transplantation. Methods Four highly sensitized recipients undergoing renal transplantation received 7 cycles of DFPP. Luminex technology was adopted to monitor the changes of DSA. Clinical efficacy, incidence of acute rejection and adverse reactions were observed. Results After DFPP, the DSA MFI [1 036 (0-4 113)] was significantly declined than that before treatment [6 446 (2 999-12 905), Z = -2.503, P =0.012]. No hyperacute rejections occurred in four highly sensitized recipients undergoing renal transplantation. Acute rejection was noted in one case, which was mitigated by postoperative DFPP and adjustment of immunosuppressive agents. During postoperative follow-up, the function of transplant kidney was normal and no rejection reactions occurred. The level of albumin was decreased after DFPP. Conclusions DFPP can effectively remove the DSA in the recipients. It is an efficacious and safe approach to prevent the incidence of acute rejections in highly sensitized recipients after renal transplantation.
【Key words 】 Double filtration plasmapheresis; Renal transplantation; Donor specific antibody (DSA); Recipient, highly sensitized; Antibody-mediated rejection; Luminex technology; Human leukocyte antigen (HLA) antibody; Albumin
双重膜滤过式血浆置换清除肾移植受者供体特异性抗体的临床观察
廖琪 蒋秋艳 熊艳 王凤英 晏强 邹贵勉 眭维国
·临床研究·
Clinical observation on the removal of donor specific antibody by double filtration plasmapheresis in renal transplant recipients Liao Qi, Jiang Qiuyan, Xiong Yan, Wang Fengying, Yan Qiang, Zou Guimian, Sui Weiguo. Department of Nephrology, the 181st Hospital of People's Liberation Army, Organ Transplantation and Dialysis Treatment Center of People's Liberation Army, Guangxi Key Laboratory of Metabolic Disease Research, Guilin 541002, China DOI: 10.3969/j.issn.1674-7445.2017.06.009
基金项目：广西卫生厅计划课题（Z2013789）
作者单位：541002　广西桂林，解放军第181医院肾脏科 全军器官移植与透析治疗中心 广西代谢性疾病研究重点实验室通讯作者：邹贵勉，
·４５６·第８卷
器官移植
在肾移植中，通常高致敏受者是指群体反应性抗体（PRA）阳性的受者。

这些高致敏受者血液中预存有包括人类白细胞抗原（HLA）Ⅰ、Ⅱ类抗体和一些非HLA类的抗体。

资料表明，移植前受者血清中预存有抗HLA抗体是导致器官移植排斥反应的一个重要原因，在所有排斥反应中，供体特异性抗体（donor specific antibody，DSA）起着重要作用，称为抗体介导的排斥反应（AMR）[1-2]。

在肾移植术后发生的急性排斥反应里，有20%～30%为急性AMR[3-4]。

为防治上述排斥反应，常常需要加强免疫抑制治疗，但常规药物治疗不良反应大，造成骨髓抑制、肝肾功能损伤等。

本研究对高致敏受者采用双重膜滤过式血浆置换（double filtration plasmapheresis，DFPP）血液净化的方式清除体内预存的HLA抗体，尤其是DSA、细胞因子和炎症介质，可有效预防和治疗AMR，使肾移植得以顺利进行，提高受者的人、肾存活率，现报道如下。

1 资料与方法
1.1 一般资料
以2013年6月至2015年10月解放军第181医院全军器官移植与透析治疗中心的4例肾移植受者为研究对象，其中男1例，女3例，年龄32～52岁，均为初次行肾移植术。

PRA阳性率为12%～26%。

入选标准（同时符合）：DFPP治疗前DSA阳性，平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）> 1 000；术后预存的DSA持续增强和（或）出现新生的DSA；术后移植肾病理活组织检查（活检）表现为体液性排斥反应；无感染、系统炎症性疾病；近3个月内无输血史。

受者或家属对治疗方案（经医院医学伦理委员会批准）均签署知情同意书。

1.2 抗HLA抗体的检测
采用Luminex单抗原微珠抗体技术检测DSA，检测结果采用MFI表示。

MFI参考范围：<1 000为阴性；1 000～4 000为弱阳性；4 001～10 000为中阳性；>10 000为强阳性。

将检测出的单抗原微珠抗体与供者HLA位点比对，匹配的抗体为DSA。

每次治疗前后均行抗HLAⅠ类和Ⅱ类抗体的MFI检测。

1.3 治疗方法
DFPP：第一级膜用血浆分离器（OP-08W，日本旭化成公司，孔径为0.3 μm）；第二级膜为血浆成分分离器（EC-30W，日本旭化成公司，孔径0.02 μm，对IgG和白蛋白的筛系数分别为0.33、0.51）。

血液泵流速80～100 mL/min，浆泵流速/血液泵流速25%～30%，以4%白蛋白溶液为置换液，每次治疗分离1.5～2.0倍血浆容量，血浆容量=（1-细胞压积）×体质量（kg）×6.5%。

根据受者耐受情况，弃浆为20%左右。

抗凝方法：治疗时间在4 h内，一般给予低分子肝素钙50～80 U/kg抗凝，治疗时间延长适当增加抗凝剂用量。

因肾移植术后存在出血风险，根据活化凝血时间（activated coagulation time，ACT）调整低分子肝素钙用量。

1.4 排斥反应的诊断标准
移植后排斥反应的诊断根据病史、临床症状、体征、实验室检查指标、彩色多普勒超声、移植肾病理活检等。

移植肾病理诊断参照Banff＇97分类。

1.5 抗排斥反应和DSA的药物治疗方案
原则上移植前受者出现DSA中-强阳性，暂缓肾移植手术。

移植后受者发生第1次排斥反应同时伴DSA弱阳性以上，移植肾病理表现为体液性排斥反应，定义为首次免疫事件，处理方案是加用小剂量抗代谢类免疫抑制剂。

发生第2次排斥反应同时伴DSA阳性，定义为第2次免疫事件，处理方案是在增加钙神经蛋白抑制剂的剂量和加用小剂量抗代谢类免疫抑制剂，同时给予大剂量静脉注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）和利妥昔单抗（抗CD20抗体）[5]。

1.6 研究方法
DSA动态监测频率为术前1次，术后1个月内每周1次，术后1～6个月每月检测1次，术后6个月后每3个月检测1次，并在疑有排斥反应及肾功能不稳定的情况下随时增加检测。

治疗效果评价指标主要是DSA免疫荧光强度和免疫球蛋白下降水平[7]。

观察肾移植术后肾功能变化情况和急性排斥反应发生情况，计算人、肾存活率。

记录治疗和随访期间不良反应的发生情况，不良反应评价指标为白蛋白下降水平及全身反应。

1.7 统计学方法
采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。

正态分布的计量资料以均数±标准差表示，比较采用t检验；偏态分布的计量资料采用中位数（四分位间距）表示，比较采用秩和检验；计数资料以率表示。

P<0.05为差异有统计学意义。

第６期廖琪等．双重膜滤过式血浆置换清除肾移植受者供体特异性抗体的临床观察·４５７·
2 结果
2.1 移植肾功能的变化和排斥反应发生情况
例1、2、3受者，术后多尿期明显，肾功能在术后4～26 d恢复正常，平均12 d。

例4受者术前预存DSA阴性，术后出现尿量减少、血清肌酐逐渐升高，B超显示移植肾血供丰富，阻力指数增高，诊断为急性排斥反应，经2次DFPP治疗、肾上腺皮质激素冲击治疗、IVIG和利妥昔单抗治疗，移植肾功能于术后17 d恢复正常。

4例患者随访4～19个月，1年人、肾存活率均为100%。

术后4个月平均血清肌酐值为（107±15）μmol/L。

2.2 DFPP治疗情况
4例受者共进行了7例次DFPP治疗，其中受者移植术前治疗3例次，术后发生急性排斥反应治疗4例次。

置换血浆量为（4 549±490）mL，弃浆（933±111）mL，补充白蛋白40～60 g。

2.3 治疗过程中DSA和免疫球蛋白的变化情况
4例受者的DSA特异性分析及其对应供者的HLA基因分型见表1。

DFPP治疗前DSA的MFI为6 446（2 999～12 905），治疗后DSA的MFI为1 036（0～4 113），差异有统计学意义（Z=-2.503，P=0.012）。

例1受者术前预存DSA为抗DQ5抗体，MFI为2 182，术前经1次DFPP治疗后，DSA下降为0；术后9 d检测到新生DSA，为抗A24（9）抗体，MFI为9 589，经第2次DFPP治疗以及IVIG处理后得以逆转，MFI下降为0。

例2受者术前预存DSA为抗DR16、DRw51抗体，MFI为13 287。

术前经1次DFPP治疗后，MFI降低至2 829，术后9 d MFI降低至1 700，术后17 d MFI 下降为0。

例3受者术前预存DSA为抗A2抗体，MFI为2 999。

经第1次DFPP治疗后，下降为0；术后10 d 原有的DSA转强阳性，并检测到新生DSA，为抗DR15（2）、DQ6（1）、DQ9（3）、DR51和DR53抗体，MFI为12 905；经第2次DFPP治疗以及调整免疫抑制方案，MFI降为1 036。

例4受者术前DSA阴性，术后10 d出现血清肌酐升高、尿量减少、发热，诊断为急性排斥反应，检测到新生DSA，为抗A2、DR15（2）、DRw51、DQ6（1）和DQ7（3）抗体，MFI为6 446。

经第1次DFPP、甲泼尼龙冲击、IVIG和利妥昔单抗治疗后，MFI降低至4 257；术后18 d原有的DSA转强阳性，MFI 为5 754；经第2次DFPP治疗，MFI降低至4 113。

4例受者接受7例次DFPP治疗后，免疫球蛋白IgG、IgA、IgM和补体C3、C4水平均较治疗前明显下降（均为P<0.05，表2）。

2.4 DFPP治疗的不良反应
在已补充白蛋白（40～60 g）的情况下，4例受者接受7例次DFPP治疗后，血清白蛋白由（40.6±2.5）g/L 下降至（33.5±6.3）g/L，治疗前后比较，差异有统计学意义（Z=3.618，P=0.003）。

例3受者在DFPP 治疗中出现低血压，治疗后1 h出现内瘘闭塞，予扩容、补充白蛋白处理后血压恢复正常，其余病例未见其他不良反应发生。

3 讨论
抗HLA抗体是针对HLA的一种免疫球蛋白，能杀伤相对应HLA的有核细胞。

传统做法是在肾移植围手术期监测受者体内抗HLA抗体水平，评估受者的免疫状态，并在HLA组织配型时避开受者预致敏的特异性抗体，尽可能减少移植排斥反应发生。

DSA 的出现在肾移植的早期阶段是一个警示信号，术前预存DSA是术后早期发生肾移植排斥反应和移植物功能丧失的主要危险因素[6-7]。

国外资料表明，动态监测抗HLA抗体和DSA可以预测移植肾功能的状态，
表1　4例受者的DSA特异性分析及其对应供者的HLA基因分型
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器官移植
对预防急性排斥反应起着重要的作用[8-9]。

本研究使用Luminex技术检测抗HLA抗体，结合供、受者的配型情况判断出现的抗体是否为DSA，明确DSA的强度，更准确地判断DSA的动态变化。

研究证实，Luminex技术检测抗HLA抗体水平，其特异度和灵敏度都远远超过酶链免疫吸附试验（ELISA）[10]。

目前治疗AMR的关键在于快速有效地降低或清除血液中的DSA，同时联合抗CD20抗体等药物来阻止B细胞进一步产生抗体[11-12]。

免疫抑制剂主要作用于淋巴细胞的增殖周期，抑制淋巴细胞的增殖；IVIG可封闭网状内皮系统，抑制补体系统，减少DSA的合成；抗CD20抗体可破坏B细胞，使抗体生成迅速减少。

所有免疫抑制剂和抗体免疫抑制诱导治疗，都是通过各种方式减少抗体的产生，但不能清除体内已存在的抗体。

目前最好的方式是通过血液净化的方式快速清除体内致敏抗体来降低AMR的发生率[13]。

血液净化清除抗体的技术已比较成熟，最常见的是血浆置换，从体内分离出1.0～1.5倍的血浆，用白蛋白、血浆或其他胶体代替。

但血浆置换的缺点在于：需要大量的血浆、白蛋白，在血制品紧张的医疗环境下，极大限制其开展，而且血浆中大量生理成分丢失，包括凝血因子、各类激素、IgG和IgM等[14]，加上血浆置换为非选择性清除抗体，血浆置换后血浆中部分有益成分被清除后导致患者免疫力低下，移植术后使用免疫抑制剂，感染的机会大大增加。

经改进的DFPP治疗技术，将血浆从全血中分离出来，经过二次过滤，大分子物质如IgG（170 000 D）、IgM（1 000 000 D）截流而清除，而分子量相对较小的物质如白蛋白（70 000 D）、氨基酸等重新回到体内。

DFPP技术的作用是直接清除已存在的DSA，其效果主要反映在单次DFPP治疗后DSA的MFI下降程度，不会因免疫抑制剂的使用而掩盖。

在排斥反应的治疗中，药物治疗和血液净化技术是相互补充的。

现存的抗体与移植物细胞膜表面相应抗原结合后，形成复合物激活补体经典途径，导致移植肾损伤。

在出现亚临床的排斥反应时，出现新生的DSA和DSA水平不断升高，可应用DFPP抢先治疗，加上药物治疗可预防DSA的产生；当出现排斥反应，可应用DFPP直接清除已存在的DSA，加上药物治疗可抑制DSA的活性，减少DSA的产生。

本组4例肾移植围手术期DSA阳性的患者，共进行了7例次DFPP治疗，其中移植术前3例次，术后进行4例次，患者DSA的MFI均明显下降，IgG 水平也显著下降。

3例患者肾移植手术后出现新生DSA，但经及时DFPP治疗及药物干预，病情平稳，未发生排斥反应，提示清除DSA能有效地预防肾移植术后出现排斥反应。

另外1例患者在肾移植术后发生急性排斥反应，经2次DFPP治疗，同时加强药物治疗，DSA的MFI均明显下降，临床表现为尿量逐渐增多，血清肌酐逐渐下降至正常，说明有效清除了DSA，显著改善肾移植后急性排斥反应受者的预后。

由于DFPP治疗只能清除循环中现存的致敏抗体，但是不能抑制继续生成致敏抗体，等待肾移植的患者DFPP治疗后为避免抗体的反跳应尽快进行肾移植手术；肾移植术后体内仍存有DSA的患者，除了接受DFPP治疗外，同时应予大剂量IVIG和利妥昔单抗，抑制致敏抗体继续产生。

本组治疗中在补充白蛋白40～60 g的情况下，白蛋白水平仍明显下降。

在AMR中起重要作用的DSA 是IgG3免疫球蛋白[15]，为中等大小的免疫球蛋白，选择血浆成分分离器EC-30W（孔径为0.02 μm，对IgG和白蛋白的筛系数分别为0.33和0.51）的二级膜。

双重膜滤过血浆分离时，白蛋白的丢失取决于二级膜，其孔径越大，白蛋白被截流越少，丢失也越少。

膜孔的不均一性导致小分子物质的截流，厂家提供的膜孔径只是个平均值，还有大量膜孔小于该值而导致小分
表2　4例受者7例次DFPP治疗前后免疫球蛋白和补体的变化
IgG14.71(9.63～18.62) 3.32(2.87～4.86)-3.9810.001 IgA 2.88(1.48～3.89)0.50(0.21～1.63)-2.9580.003 IgM0.99(0.75～2.50)0.22(0.17～1.16)-2.1130.035 C3 1.03(0.75～1.32)0.37(0.32～0.77)-2.9580.003 C40.32(0.14～0.52)0.07(0.01～0.12)-2.5510.011
第６期廖琪等．双重膜滤过式血浆置换清除肾移植受者供体特异性抗体的临床观察
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子物质被截流。

综上所述，DFPP 治疗对肾移植受者体内DSA 的影响，笔者检索国内数据未见相关报道。

本研究证实DFPP 降低DSA 效果显著确切，能有效预防和治疗肾移植术后的急性排斥反应，对已出现的急性排斥反应，能减少不良预后，治疗过程中并发症少。

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（收稿日期：2017–08–08）（本文编辑：邬加佳 朱佩玲）。