离子束生物工程在育种中的应用

内容简介


1.离子束生物工程简介 2. 离子注入诱变的机理 3.生物学研究 4. 离子注入的独特在生物学方面的优势 5.离子注入在作物育种上的应用 6.离子注入技术育种的若干问题及前景 7.离子束生物工程在加速生物诱变肓种进程上的新构想
8.应用实例 ：离子注入小麦诱变育种的回顾与展望



靶室部分设有大小两个靶室。 大靶室体积约1m3，一般用于辐照种子和一些耐真空的微生 物； 小靶室为辐照微生物专用，体积约为0.006m3。因为微生物 的耐真空性能较差，不宜在真空中放臵时间过长，所以，小 靶室采用了特殊的设计，缩短了微生物暴露于真空中的时间。 注入机工作时真空度为3×10-2Pa～5×10-2Pa。 两靶室均有水冷装臵，样品温度通过水冷可控制在50℃以下。



离子注入是新近兴起的一种生物诱变新技术，它是利用加 速的气体离子（等离子体）轰击植物种子、芽胚和微生物 菌种等生物材料，使之产生突变，从而选育出新的品种。 离子注入具有突变率高、变异谱广、优良变异多、稳定快、 安全、方便、无污染等特点，可提早2至3年育成新的作物 品种，从而大大加快作物育种进程和新品种更新速度，促 进农业生产水平的提高。 该技术育成的水稻、玉米、番茄、大豆、小麦等农作物新 品种，普遍有抗逆、高产、优质、抗病等优良特性。
离子束生物工程在育种中的应用

关键词 离子束生物工程Ion Beam Bioengineering 应用Application
前言



离子注入诱变是一种较新的作物诱变育种方法 , 日本、法国、 德国等自60年代就应用重离子注入进行作物改良的报导[1]. 80 年代中期 , 中国科学院等离子体物理研究所及合作单位 [2] 开 始从事离子注入诱变育种及其机理研究 , 且用于水稻、小麦、 棉花、玉米、大豆、山梨豆、白兰瓜、番茄、烟草及洋葱等作 物的改良研究. 离子束生物工程是我国独自开创的一个新技术领域，中国科学 院利亚分院强电研究所制造的 Titan脉冲式 全元素离子源 离子注入机的加速电压10kV～80kV，金属束流0～500mA， 气体束流0～250mA，脉冲频率有50 Hz、50/2 Hz、50/4 Hz、 50/8 Hz，脉冲宽度为400μs，可获得气体离子和金属离子。 常用的气体有氮气和氩气，可供使用的金属有Al、Ti、Cr、 Fe、Co、Ni、Zn等。 在该装臵上可进行气体离子、金属离子的单独注入，气体金属同步注入，多元素复合离子注入。

（3）电荷交换（电荷效应） 当带有正电荷的离子被注入生物体之后会发生电荷交换使细胞 表面的负电性降低而正电性增强（电荷沉积在细胞表面）。 随注入的电荷数增加, 细胞表面束缚的正电荷达到了动态平衡。 细胞电性变化改变了跨膜两边的物理场 , 深刻影响着细胞内外 能量转换、物质运送、信息传递、代谢调控等各种生物学过程。

由于该注入机采用脉冲式注入，因此注入时间比较长。 在束流为200mA、频率为25Hz条件下，要达到 1×1017N+/cm2注入剂量需1小时46分钟。
2. 离子注入诱变的机理


离子注入有能量沉积、动量传递、质量沉积及电荷交换等效 应（或说四种原初反应过程）。 将各种不同的离子注入生物体，通过电、能、质三位一体的 共同作用，不仅可影响植物细胞的生理生化功能，还可使细 胞中的遗传物质发生改变。 低能离子与生物物质相互作用的四个原初反应过程。其作用 机制是相当复杂的，很难用单一模式解释清楚，而以上四个 过程差不多在10-19～10-16秒中同时发生，很难区分各自独立 的作用。

（3）生物学效应 物理效应和化学效应都发生在分子水平上，由此造成的损伤 是基本的微观损伤，再经过一个不可逆的生物放大过程，就 会产生宏观的生物效应。

生物学效应涉及到因生物大分子受到损伤而导致：能量代谢 紊乱，生物合成的前体物质供应不足，许多重要的生化代谢 受到干扰，细胞质膜或细胞核膜遭到破坏，分生组织不能进 行正常的有丝分裂，生长发育受到刺激或抑制，引起生物体 发生性状变异等等。
3.生物学研究
3.1微核率及畸变率随剂量的变化 3.2同工酶分析 3.3分子生物学研究 3.4离子束对作物生长发育的刺激作用 3.5离子束诱变小麦遗传新规律
3.1微核率及畸变率随剂量的变化(颉红梅等，2001) 细胞学实验主要对当代萌发种子的根尖细胞进行染色体观测， 统计其微核率与总畸变率。从镜检结果来看： 染色体的微核率与畸变率都与辐射剂量有关，剂量增大，微核 率与畸变率增高，基本呈现正相关性。

同时，呈现激发态的分子会自发地与邻近的其它分子进行 碰撞，生成具有很高反应能量的次生代谢产物 ( 新的分子 ) ， 经过反应产物的不断作用，会生成大量的自由基，由此引 起连锁反应直至形成稳定的分子产物为止。 在化学反应中涉及到细胞内遗传物质的损伤和修复、酶的 激活或失活、许多生化反应受到干扰等等。
余增亮（中科院等离子体所离子束生物工程室主任） 1986 年发现离子束注入生物效应，提出能量沉积、质量沉 积、电荷转移“三因子”假说，不断得到实验证实，开辟 了辐射生物学的一个新领域——低能重离子生物学； 兴起了一个新的技术学科——离子束生物工程学； 提出了环境低能离子束对健康和进化影响的新观点，三次 出席相关领域国际会议并做邀请报告； 开辟了离子束在生命科学中应用的新的学科增长点。
崔海瑞用离子束辐照四倍体黑麦，中期I在赤道板上形成一条染 色体链，这是染色体连续易位的结果。

利用这一原理，发明了： 离子束诱变技术 转基因技术 细胞加工技术
1.2离子注入装臵 Titan和TNV-RU离子注入装臵均有四部分组成： 离子源部分（ion source） 控制部分（control part包括束流的测量系统） 靶室(vacuum chamber) 真空机组 (pumping system)
1.离子束生物工程简介


1.1离子束生物工程 1.2离子注入装臵
1.1离子束生物工程

离子束生物工程: 就是利用低能重离子注入（Low energy heavy ion implantation）
生物体、组织或细胞，使其产生生物学效应的科学。




由于加速后的重离子具有质量、能量和电荷 3 种作用势，因 此，注入生物体后会产生质、能、电共同作用于生物体的集 体效应。 例如，使染色体产生各种变异，改变细胞的跨膜电位、对细 胞的膜或壁进行刻蚀加工产生可修复的微孔或洞等。 这就决定了注入离子的质、能、电联合作用的生物学效应比 核辐射产生的生物学效应具有更丰富的内容和更宽广的诱变 图谱。 其次，注入离子具有射程的可控性、集束性和方向性，并且 随着加速技术的日臻完善，使单个离子注入技术已成为可能。 这就大大地克服了核辐射诱变的盲目性并降低辐射诱变的负 效应，使定向诱变成为可能。 再者，注入离子作用于细胞表面的动量效应具有冷作用的特 点，这也使其显著优于电子束、激光束等热诱变源。同时， 它对细胞表面的加工和修饰就像手术刀那样能精确地对细胞 进行刻蚀，从而为转基因提供了优越条件。 离子束生物工程正是基于这些基本原理得以广泛应用的。
（1）物理效应 在离子束注入生物体的最初阶段会产生物理效应 载能离子束会使生物体的局部产生刻蚀，由此形成特定的 通道； 同时，离子会将携带的能量转移给生物体细胞，引起细胞 中特定分子的电激发，电荷发生交换； 最后导致分子的构型发生改变。
（2）化学效应 在产生物理效应之后 ，活化分子的级联碰撞仍在进行， 从而促进原子移位，慢化后的注入离子会发生沉积扩散， 再通过沉积离子和本底离子的重排和化合，产生出新的分 子。
（4）次级作用 有学者提出离子注入生物器官(种子)的还具有次级作用,如： 离子注入引起的二次电子、软 X 射线（能量和穿透力较低的一 种X射线）、大量自由基（原来完整的分子，其共价键中配对 的电子因故欠一个或增加一个，成为残缺不全的自由基）等， 是引起生物诱变的原因之一。
诱变机理的另一种表述： 在研究中发现，将带电的离子束注入生物体之后，其效应 涉及到多个方面，其中包括物理效应、化学效应和生物效应。
（2）质量沉积


如果注入细胞的是活性离子，慢化后它将与周围的移位原子、 本底原子发生化学反应，产生新的分子或基团，这就是所谓 “质量沉积效应” 。 若这些反应发生在细胞的遗传物质上则将直接导致DNA的损伤
和突变。







生物体在能量和质量沉积作用下的效应 如果荷能粒子击中染色体某个部位，使染色体发生断裂，造成 染色体缺失或重复。 如果2条非同源染色体都被注入离子击中断裂，染色体断片可 能易位联接。 如果1条染色体两处都被注入离子击中断裂，中间的染色体断 片可能发生倒位。 慢化离子的健合可能发生在断位或缺失处，慢化离子会取代或 补充DNA大分子的某一成分和缺失部分。 此外，离子注入所产生的质量沉积在DNA分子上形成无法切除 修复的产物，从而造成DNA损伤修复的抑制。 进一步研究还发现， 生物分子中大量氢健、碳-氧健、碳-碳健被打断，注入的氮离 子主要和氢健结合成各种形态的非稳定态氨基基团，少量形成 C≡N基团； 这些新的基团会取代DNA分子中原来被打断的位点，从而改变 了DNA的某些性质，引起了基因突变。

低能离子束对植物细胞和组织的刻蚀主要表现在： 减薄细胞壁；损伤细胞膜；增加膜的通透性；在剂量较大时 甚至使细胞破裂。 由于生物组织结构的空间分布具有高度的特异性，离子束对 空间各点的刻蚀速率差异很大。 在电镜下可观察到不仅样品表面细胞的细胞壁减薄 , 而且细 胞间还存在着深的孔和洞。


3）Bragg峰 在注入离子能量沉积过程中,在其射程末端存在一个尖锐的能量 损失峰,即Bragg峰（在注入离子的径迹内,随着带电粒子能量的 减少 ,在射程的末端 , 其能量损失率急剧上升从而形成一个密度 很高的电离峰）,它的值高于前段坪区能损值几倍至十几倍。因 而,可以选择辐照位臵。 电离峰反映了生物体受到幅照损伤的范围、程度和带电粒子入 射的深度及带电粒子入射方向上剂量分布的特征。
（1）能量沉积

1）原子重排 离子携带的能量 ,在注入生物体时 ,不断把能量沉积下来 ,注入 离子与靶原子分子发生一系列碰撞及能量传递过程,使靶原子 分子发生键断裂。 生物分子键的断裂不再遵从“从最弱的键开始断裂”的原则, 而是与离子(包括反冲原子)动量传递方向有关。 当离子能量较高时,在入射离子径迹上, 原子分子被击出原位， 产生大量的移位原子，留下断链或缺陷。这些移位原子在新 的位臵上与周围的原子重排,或复合,或填隙。




离子注入前，首先将样品装入特制的样品盘中，放入靶室中 抽真空。 达到注入机工作时的真空度后，通入工作气体； 这时加在气体阴极和阳极间的点火脉冲使电离室的工作气体 电离，产生弱等离子体，这些弱等离子体在漂移电势的作用 下，向阳极运动。 在这个过程中，阴阳两极间的电阻率变大，在随后的气体弧 脉冲的作用下，在阴阳两极间发生剧烈的弧放电，产生强等 离子体，工作气体被电离。 电离气体进入中空阳极，负离子通过阳极被吸收，正离子通 过加在阳极上的加速电压的加速，获得能量发射出来，引入 到靶室，注入到放在靶室中的样品中。






2）离子束溅射（离子溅射、电子溅射） 离子注入生物材料后, 一方面，一部分离子能量转换成靶原子的动量，引起表面二 次离子发射，即所谓离子溅射。 另一方面，由于电荷交换，或者入射离子能量转移给靶原子 电子，引起入射离子径迹上靶原子电离，这种瞬时的电荷积 累在库仑斥力（原子外围负电子之间的库仑斥力）作用下， 引起“库仑爆炸”，将生物分子或碎片抛射出来，这就是所 谓的“电子溅射”。 离子束的溅射好比一把手术刀 ,对生物体进行细微加工 ,使生 物体表面层层剥离（即刻蚀）； 后来的离子就可穿行较长的距离，落在预定的位臵上。 溅射过程不伤害邻近未被照射的组织