酵母双杂交操作手册 by shenao

酵母双杂交操作手册 by shenao Y2H所需材料:
PJ69-4A PJ69-4α or AH109 Y187
pGBKT7 DNA-BD Vector (bait)
pGADT7 AD Vector (prey)
pGBKT7-53 Control Vector
pGBKT7-Lam Control Vector
pGADT7-T Control Vector
pCL1 Control Vector
3' DNA-BD & AD Sequencing Primers
Herring testes carrier DNA
Yeast extract，Dextrose(glucose); SD base; DO Supplement; Peptone，with DMF) TE buffer DMSO PEG/LiAc (10X) TE/LiAc buffer (10X) X-a-
gal(
Yeast Phenotypes
–––Ade, His, Leu, Requires adenine (Ade), histidine (His), leucine (Leu), or tryptophan (Trp) in the
–or Trp medium to grow; is auxotrophic for at least one of these specific nutrients.
Expresses the ADE2 reporter gene; i.e., does not require Ade in the medium to +Ade grow.
+His Expresses the HIS3 reporter gene; i.e., does not require His in the medium to grow.
+LacZ Expresses the lacZ reporter gene; i.e., is positive for b-galactosidase activity.
+Mel1 Expresses the MEL1 reporter gene; i.e., is positive for a-galactosidase activity. Miscellaneous
Ade2p Protein encoded by the yeast ADE2 gene.
3-AT 3-amino-1,2,4-triazole; a competitive inhibitor of the His3 protein.
CHX Cycloheximide
Dropout (supplement or solution); a mixture of specific amino acids and nucleosides
DO used to supplement SD base to make SD medium; DO solutions are missing one or
more of the nutrients required by untransformed yeast to grow on SD medium.
His3p Protein encoded by the yeast HIS3gene.
Minimal Synthetic Dropout medium; comprised of a nitrogen base, a carbon source SD medium (glucose or galactose), and a DO supplement.
YPH Yeast Protocols Handbook
SD/–Ade SD/–Met SD/–His SD/–Ura YPDA YPD/CHX SD/–Leu SD/–Trp Strain
PJ69-4A – + – + + –––
––– + + ––– PJ69-4α
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SD/–Ade SD/–Met SD/–His SD/–Ura YPDA YPD/CHX SD/–Leu SD/–Trp Strain
AH109 – + – + + –––
––– + + ––– Y187
Yeast selection Bacterial selection Fusion Epitope
Cloning vectors
pGBKT7 DNA/bait c-Myc TRP1 kanamycin
pGADT7 AD/library HA LEU2 ampicillin Control vectors
pCL1 GAL4 LEU2 ampicillin
pGADT7-T AD/T-antigen HA LEU2 ampicillin pGBKT7-53 DNA-BD/p53 c-Myc TRP1 kanamycin pGBKT7-Lam DNA-BD/lamin C c-Myc TRP1 kanamycin .
缩写:
Ade腺嘌呤(adenine) His组氨酸(histidine) Leu亮氨酸(leucine) Trp色氨酸(tryptophan)
培养基成分及配制方法:
YPD & SD Base from CLONTECH already contains a carbon
source(Dextrose(glucose))
YPD: 20g/L Peptone, 10g/L Yeast extract, 2% Dextrose(20g/L), 20 g/L Agar (for plates only) 加入上述药品，加水至1L，调节PH值到6.5。

121:C 15分钟。

或者Dextrose溶液单独108:C 15分钟，YP配成溶液121:C 20分钟。

用前混合。

YPDA: YPD + adenine
1LYPD培养基中加15mL过滤除菌的0.2% adenine hemisulfate，终浓度
0.003%。

(Adenine hemisulfate 其实可以耐高温，可以混在YPD中灭菌;或者先灭YP，再加D和A。

)
SD:
6.7 g Yeast nitrogen base without amino acids，2%dextrose (glucose)，20 g Agar (for plates
only)，850 ml H2O，100 ml of the appropriate sterile 10X Dropout Solution
• Adjust the pH to 5.8 if n ecessary, and autoclave. Allow medium to cool to ~ 55:C before adding 3-AT, cycloheximide, additional adenine, or X-gal.
• If you wish to add excess adenine to SD medium, add 15 ml of 0.2% adenine hemisulfate solution per liter of medium.
(若用clontech公司的粉剂，SD base 加上相应的 DO supplement，121:C 15分钟)
• 10X Dropout (DO) Solution
多数的常用DO可从CLONTECH公司买到。

或者可以结合下面营养成分列表中标明的浓度，自己配制10XDO溶液。

10XDO溶液中含有除一种或少数几种之外的其他所有下面列举的营养成分。

注意，serine(丝氨
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酸), aspartic acid(天冬氨酸)和 glutamic acid(谷氨酸)不被包括在下面的列表中。

因为它们将使培养基过酸，而且酵母可以内源性合成这几种氨基酸。

10XDO溶液可被高压灭菌，4:C保存一年以上。

Example: To make one liter of 10X –Leu/–Trp DO Solution, combine the following:
• 200 mg adenine hemisulfate 腺嘌呤
• 200 mg arginine HCl 精氨酸
• 200 mg histidine HCl monohydrate 组氨酸
• 300 mg isoleucine 异亮氨酸
• 300 mg ly sine HCl 赖氨酸
• 200 mg methionine 甲硫氨酸
• 500 mg phenylalanine 苯丙氨酸
• 2000 mg threonine 苏氨酸
• 300 mg tyrosine 酪氨酸
• 200 mg uracil 尿嘧啶
• 1500 mg valine 缬氨酸
1 L Dissolve components in 1 L deionized H2O. Autoclave.
X-gal:5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。

(X-β-gal)
X-a-gal:用DMF溶解X-a-gal，浓度为20mg/ml。

-20?避光保存。

对于平板，1L缺陷培养基中冷却至55?后加入1ml X-a-gal(20mg/ml)再倒平板。

或者每块冷却后的10cm/15cm平板上涂100ul/200ul X-a-gal(2mg/ml)。

注意:若想要快速(1,24小时)确定某个酵母株是否含有MEL1，在平板上以上述体积涂20mg/ml的X-a-gal。

酵母菌株的保藏和培养:
酵母菌株可以于含25%甘油的YPD培养基中保藏在-70?，若温度始终保持在-55?以下，至少可以保藏1年以上。

转化后的酵母菌最好保藏在对应的SD培养基内，以始终保持选择压力。

酵母甘油菌种的制备:
a. 无菌操作，从平板上刮下一个酵母单克隆。

b. 1.5ml无菌EP管中，用200–500 ,l YPD培养基或适宜的SD培养基重悬菌落。

剧烈震荡，完全分散细胞。

加入50%的甘油等体积，使甘油终浓度为25%。

c. 盖紧盖子，再次混匀EP管。

-70?包藏。

酵母甘油菌的复苏:
a. 少量冻存的甘油菌在YPD或适宜的SD平板上划线。

b. 30:C培养3,5天，直到菌落直径为2mm以上。

将这些作为“工作菌”平板。

c. 将平板用封口膜封好，4:C可保藏2个月以上。

每过1,2个月重新从冻存的甘油菌中划平板。

d. 甘油菌可被反复冻融有限的几次而不影响细胞。

如果没有活化出来，或许是细胞沉淀在EP管底部。

这时候可以将EP管置于冰上解冻后，剧烈震荡，再重新划线。

过夜液体培养酵母菌:
a. 从“工作菌”平板上取新鲜的(<2-months)克隆用于实验。

每5ml培养基接种一个较大的克隆(直
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径2–3-mm) ;若菌落较小或者使用了更多的培养基，可以取多个克隆。

注意:充分地剧烈振荡培养基1min以上，以彻底分散酵母细胞。

b. 30:C培养16,18小时，230–270 rpm。

对于大多数的菌株，培养物将达到生长的平台期(OD600 > 1.5)。

注意: 不同的酵母株系的生长速率不同。

同时在一些转化子中，生长速率还会受到融合蛋白的影响。

另外，大多数株系在SD培养基中的加倍时间要比在YPD中长两倍左右。

c. 如果需要对数生长期的培养物，转移足够的过夜培养物到新鲜的培养基中，使OD600 = 0.2–0.3。

30:C培养3,5小时，230–250 rpm。

对于大多数的菌株，OD600将为0.4,0.6 。

注意:在这个活化
步骤中通常使用YPD或者YPDA。

因为在这种较短的活化时间下，质粒的丢失并不明显。

酵母转化方法:
A(储存液
• 鲱鱼精 carrier DNA (10 mg/ml)
已被超声过的鲱鱼精carrier DNA溶液可以被单独地购买，或者采用下面的标准方法:将溶解后的carrier DNA(10 mg/ml)在沸水浴中煮20min，再迅速放到冰上冷却。

必须使用高品质的carrier DNA，不要使用nicked calf thymus DNA。

• PEG/L iAc solution (polyethylene glycol/lithium acetate) Prepare fresh just prior to use.
Final Conc. To prepare 10 ml of solution
PEG 4000 40% 8 ml of 50% PEG3350
TE buffer 1X 1 ml of 10X TE
LiAc 1X 1 ml of 10X LiAc
50% PEG 3350 (avg. mol. wt. = 3,350) 无菌的去离子水溶解;如果必要，可以加热溶液到50?帮助PEG溶解。

10X TE buffer: 0.1 M Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.5。

高压灭菌。

10X LiAc: 1 M lithium acetate (Sigma)，用稀醋酸调节pH值到7.5，高压灭菌。

B. 所需试剂和材料(全部要求无菌～)
• YPD or the appropriate SD liquid medium
• Sterile 1X TE/1X LiAc (Prepare immediately prior to use from 10X stocks)
• Sterile 1.5-ml microcentrifuge tubes for the transformation • Appropriate SD agar plates (10cm diameter) • Herring testes carrier DNA • Sterile PEG/LiAc solution (Prepare only the volume needed, immediately prior to use, from
10X stocks)
• 100% DMSO (Dimethyl sulfoxide; Sigma)
• Sterile 1X TE buffer (Prepare from 10X TE buffer) • Sterile glass rod, bent Pasteur pipette, or 5-mm glass beads for spreading cells on plates.
C. 成功转化小贴士
• Fresh (one- to three-week-old) colonies will give best results for liquid culture inoculation. A
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single colony may be used for the inoculum if it is 2–3 mm in diameter. Scrape the entire colony into the medium. If colonies on the stock plate are smaller than 2 mm, scrape several
colonies into the medium.
• Vigorously vortex liquid cultures to disperse the clumps before using them in the next step.
• The health and growth phase of the cells at the time they are harvested for making competent cells is critical for the success of the transformation. The expansion culture (Step
E.6) should be in log-phase growth (i.e., OD600 between 0.4 and 0.6) at the time the cells are harvested.
• When collecting cells by centrifugation, a swinging bucket rotor results in better recovery of
the cell pellet.
• For the highest transformation efficiency (as is necessary for
library screening), use
competent cells within 1 hr of their preparation. If necessary, competent cells can be stored (after Step E.11) at room temperature for several hours with a minor reduction in
competency.
• To obtain an even growth of colonies on the plates, continue to spread the transformation
mixtures over the agar surface until all liquid has been absorbed. Alternatively, use 5-mm
sterile glass beads (5–7 beads per 100-mm plate) to promote even spreading of the cells.
E. LiAc小量酵母转化方法(得到1.5 ml感受态细胞，可做14–15个小量转化)
1. 1ml YPD(或SD)培养基中接种几个克隆，直径2–3 mm。

注意:对于那些已
经转化了另一种可
以自主复制的质粒的酵母宿主株，使用对应的SD培养基，以保持这个质粒不
丢失。

2. 剧烈振荡5min，彻底分散细胞。

3.将其转移到含有50ml YPD或(或SD)的小瓶中。

4. 30:C，250 rpm培养16,18小时，使菌液生长到达稳定期 (OD600>1.5)。

5. 转移30ml的过夜培养物到含有300ml YPD的小瓶中。

检查该稀释培养物的OD600值，如果必
要，加入更多的过夜培养物，直到OD600为0.2–0.3。

6. 30:C，230 rpm培养3小时，此时OD600应为0.4–0.6。

若OD600<0.4，培养物中必定出现了某
种问题。

7. 将培养物倒入50ml离心管中，1, 000 x g ，5 min ，室温 (20–21:C)。

8. 弃去上清，用无菌的TE或者蒸馏水彻底重悬细胞，将细胞倒入一个试管中(最后体积为25–50
ml)。

9. 1,000 x g ，5 min ，室温(20–21:C)。

10. 弃去上清。

11. 用1.5ml新鲜配制的无菌1X TE/1X LiAc彻底重悬细胞。

12. 在一个新的1.5ml EP管中加入0.1 ,g质粒和0.1 mg 鲱鱼精carrier DNA，混合均匀。

注意:同时共转化两种不同质粒时，每种质粒取0.1 ,g (摩尔比大致相同)，外加0.1 mg 鲱鱼精carrier DNA。

13. 每个EP管中加入0.1ml 酵母感受态细胞，振荡混匀。

(枪头吹打即可)
14. 每个EP管中加入0.6ml 无菌的PEG/LiAc溶液，高速振荡10秒以混匀。

15. 30:C ，30 min ，200 rpm。

16. 加入70ul DMSO。

反复轻柔颠倒混匀。

不要振荡。

17. 42:C水浴，热休克15min。

18. 冰上放置1,2min。

19. 14,000 rpm，室温，5秒。

弃去上清。

5
20. 0.5ml 无菌1X TE buffer重悬细胞。

(振荡或枪头吹打)
21. 每块相应的SD平板上涂100ul 。

为了确保获得有效分离生长的克隆，同时还按1:1000、
1:100、和1:10稀释后各涂100ul 到SD平板。

这个也可以作为(共)转化效率的对照。

(预实验
获得大致转化效率后，就可以知道应该用多少体积重悬后涂100ul 才比较合适了)
注意:如果是共转化，涂对照平板以检验共转化的效率和每种质粒的效率。

在10cm平板上，采用每次只选
择一种质粒的培养基，将1ul 转化液稀释到100ul 水中后涂平板。

22. 倒置平板，30:C培养直到克隆出现。

通常需要2,4天。

23. 为了确定转化的效率，计算稀释后平板上的克隆数(cfu)，选择30,300cfu 的平板进行统
计。

cfu x total suspension vol. (,l) = cfu/,g DNA
Vol. plated (,l) x dilution factor x amt. DNA used (,g)*
* In a cotransformation, this is the amount of one of the plasmid types, not the sum of them. If you have used unequal
amounts of two plasmids, use the amount of the lesser of the two. 统计示例:
• 100 colonies grew on the 1:100 dilution plate (dilution factor = 0.01)
• plating volume: 100 ,l
• resuspension volume = 0.5 ml
• amount of limiting plasmid = 0.1 ,g
35100 cfu x 0.5 ml x 10 ,l/ml = 5 x 10 cfu/,g DNA
100 ,l x 0.01 x 0.1 ,g
24. 选取最大的克隆，在相同的选择培养基平板上重新划线，得到master plates。

用封口膜封好，
4:C 可储藏3–4周。

Plating and Screening Transformation Mixtures
You can select AH109 transformants using high-, medium-, or low-stringency media .Less
stringent screens increase the number of false positives, while more stringent screens may
result in false negatives.
• High-stringency: Plate transformations on SD/–Ade/–His/ –Leu/–Trp/X-,-Gal medium to
screen for ADE2, HIS3, and MEL1 expression. This screen virtually eliminates false positive
interactions; however, low-affinity protein interactions may be missed. • Medium-stringency: Plate library transformations on SD/–
His/–Leu/–Trp medium to screen for expression of HIS3. Plan to screen at least 1.5–3 times the number of independent clones in the library. Subsequently, replica plate His+ colonies onto SD/–Ade/–His/ –Leu/–Trp/X-,-Gal
medium to screen for ADE2 and MEL1 expression.
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Z buffer: Na2HPO4• 7H2O 16.1 g/L
NaH2PO4• H2O 5.50 g/L
KCl 0.75 g/L
MgSO4 • 7H2O 0.246 g/L
Adjust to pH 7.0 and autoclave. Can be stored at room temperature
for up to 1 year.
Z buffer/X-gal solution(显色液)
100 ml Z buffer
0.27 ml ,-mercaptoethanol
1.67 ml X-gal stock solution(20 mg/ml)
1. PJ69-4A和PJ69-4α分别涂板SD/-His，如果有白色小菌落长出，则说明有背景。

需要加3-AT，并且做梯度浓度，选取最低的抑制浓度。

2. 每个质粒转化进酵母后，先要进行毒性测试&自激活实验。

例如，pGBKT7-Y转化进PJ69-4α后，就涂板SD/–Trp/X-a-gal。

如果没有菌落长出，则说明表达的外源蛋白对细胞有毒性。

如果有，但是为蓝色，说明可以自激活。

同时，再顺序转化pGADT7空载体到PJ69-4α/pGBKT7-Y。

涂板SD/–
Leu/–Trp/X-a-gal，如果长出的菌落显蓝色，则也说明外源蛋白可以单独激活GAL4调控的下游报告基因。

pGADT7-X转化进PJ69-4A后，就涂板SD/–Leu，同理检测毒性和自激活。

(但是为什么论文“Y2H Tegument Proteins of HSV-1”里面仅仅检测了Bait的，而忽略了Prey的,见System3手册，VIII B和C的说明。

)
3. 为了节约，也可不涂X-a-gal。

改用液氮破菌后，X-gal显色。

7。