嘧肽霉素一种新的生物活性组分分离纯化研究

嘧肽霉素一种新的生物活性组分分离纯化
研究
摘要：通过生物活性检测发现Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｔｚ９２菌株嘧肽霉素发酵液中一种新的抗细菌生物活性物质，为了明确其适宜的分离纯化工艺，试验研究了利用大孔吸附树脂，硅胶柱层析和分子筛层析分离纯化该组分的条件和效果。

试验结果显示，发酵液经过大孔树脂ＳＰ８２５Ｌ吸附５０％甲醇洗脱、硅胶柱层析氯仿∶正丁醇∶甲醇∶乙酸＝42∶2∶4∶2洗脱、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０７０％甲醇洗脱可以得到该组分纯品。

关键词：嘧肽霉素；分离纯化；生物活性
中图分类号：Ｓ４８２．２；Ｒ９７８．７文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11418－3728-04
Isolation and Purification of A New Bio-active Ingredient in Cytosinpeptidemycin Fermentation Broth
ＭＵＬｉｎｇ－ｘｉａｏ，ＦＵＹｉｎｇ，ＺHAO Ｘｉｕ－ｘｉａｎｇ，ＷU Ｙｕａｎ－ｈｕａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａnew ａｎｔｉ－ｂａｃｔｅｒｉａｂｉｏ－ａｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎＣｙｔｏｓｉｎｐｅｐｔｉｄｅｍｙｃｉｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｗａｓｆｏｕｎｄｂｙｂｉｏａｓｓａｙａｎａｌｙｓｉｓ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｄｅｖｅｌｏｐａｐｒｏｐｅｒｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒｔｈｅｃｏｍｐｏｕｎｄ，ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｎｄｅｆｆｅｃｔｓｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｂｙｓｉｌｉｃａｇｅｌｃｏｌｕｍｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｉｅｖｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｗｉｔｈｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓａｄｓｏｒｐｔｉｖｅｒｅｓｉｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｐｕｒｅｃｏｍｐｏｕｎｄｃould ｂｅｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｒｏｕｇｈａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｏｆＳＰ８２５Ｌａｎｄｅｌｕｔｅｄｂｙ５０％ｍｅｔｈａｎｏｌ，ｓｉｌｉｃａｇｅｌｃｏｌｕｍｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｗｉｔｈＣｈｌｏｒｏｆｏｒｍ∶１－ｂｕｔａｎｏｌ∶ｍｅｔｈａｎｏｌ∶ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ＝42∶2∶4∶２，ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０７
０％ｍｅｔｈａｎｏｌａｓｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Cytosinpeptidemycin；isolation and purification；bio-activity
自从２０世纪４０年代青霉素问世以来，抗生素的研究和应用引起了人们极大的兴趣，陆续开发出了一系列针对人类和动物疾病的抗生素品种，其影响也逐渐涉及到农业及其他领域。

最早研究农用抗生素的是美国和欧洲，随后日本迅速崛起，并形成了四大新农用抗生素品种――灭瘟素Ｓ、春日霉素、多氧霉素和有效霉素，在农业生产中得到广泛应用［１－３］。

嘧肽霉素是由土壤中分离筛选出来的不吸水链霉菌辽宁变种产生的次生代谢产物［４］，可作为一种新型、高效的抗病毒［５－８］和抗真菌［９］生物农药。

目前已经报道的２种从嘧肽霉素产生菌发酵液中分离的具有抗病毒作用的物质［１０，１１］，都是胞嘧啶核苷肽类化合物。

沈阳农业大学植物保护学院植物病毒实验室以烟草赤星病菌为颉颃对象进行筛选，新发现了一种生物活性物质。

本研究明确了分离方法，为进一步确定该物质的结构、生物功能和应用研究奠定了基础。

１材料与方法
１．１仪器
慧德易Ｑｕｉｃｋｓｅｐ５０中压层析系统，Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＬＣ／ＭＳＤＴｒａｐ型液质联用系统；ＤＩＫＭＡＤｉａｍｏｎｓｉｌⅡＣ１８反相柱；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＬａｍｂｄａ２５紫外可见分光光度计；ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＢａｒｎｓｔｅａｄＮａｎｏｐｕｒｅ超纯水系统。

１．２菌种和培养基
菌种：嘧肽霉素产生菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｔｚ９２，分离指示菌为烟草赤星病菌，均由沈阳农业大学植物保护学院植物病毒实验室分离保存。

斜面和平板培养基：烟草赤星病菌培养基；高氏麦麸培养基；发酵培养基：可溶性淀粉４７ｇ，花生饼粉２２ｇ，酵母粉２ｇ，２ＳＯ４２．７ｇ，ＮａＣｌ２．７ｇ，ＣａＣＯ３２．７ｇ，去离子水１０００ｍＬ，ｐＨ值７．２。

所有培养基均１２１℃灭菌３０ｍｉｎ备用。

１．３试验方法
１．３．１菌株发酵粗提液制取菌株的发酵采用二级发酵，无菌条件下，用无菌水制成菌株Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｔｚ９２的孢子悬浮液，高氏麦麸培养基上每皿加入０．５ｍＬ菌悬液，铲刮均匀，置于２８℃恒温培养箱中培养４ｄ，待菌落表面颜色变为深灰色，表明大部分孢子
已成熟，即可用于发酵。

将培养皿中菌株Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｔｚ９２孢子刮下，配成约为１×１０８个／ｍＬ的孢子悬浮液。

２５０ｍＬ三角瓶装发酵培养基４０ｍＬ，接孢子悬浮液４ｍＬ，用透气封口膜封口，２８℃、１４０ｒ／ｍｉｎ振荡培养９６ｈ。

４０００ｒ／ｍｉｎ常温离心１５ｍｉｎ，草酸酸化得到的发酵液上清液至ｐＨ值为３，６０℃水浴６ｈ，充分沉淀杂质，冷却至室温，滤除杂质，即为粗提液。

１．３．２大孔树脂提取活性物质供试树脂分别为ＳＰ８２５Ｌ、ＨＰ２０、ＸＡＤ１６、ＸＡＤ７ＨＰ。

１）树脂预处理。

将树脂用无水乙醇浸泡２４ｈ，充分溶胀，沉淀后弃去细小颗粒及破碎树脂，再用去离子水反复洗涤，直到完全洗去醇味。

２）静态吸附。

将粗提液分别调ｐＨ值至３、６、９。

称取处理好并滤除水分的湿树脂３ｇ，装入三角瓶中，分别加入３０ｍＬ不同ｐＨ值的粗提液，摇床振摇２ｈ，然后取吸附余液调整ｐＨ值至６，进行生物活性测定，以粗提液为对照，试验设３个重复。

３）洗脱。

取静态吸附中效果最好的处理，完全倾去吸附余液，将树脂平均分成３份，分别加入１０ｍＬ的５０％甲醇，５０％乙醇和５０％丙酮溶液，置摇床振摇洗脱，然后取洗脱液去除有机溶剂并定容至原体积，调整ｐＨ值至
６，测定生物活性。

以粗提液为对照，试验设３个重复。