《生物制药技术》实验指导-实验二

《生物制药技术》实验指导-实验二
《生物制药技术》实验指导
实验二金霉素链霉菌的定向发酵（验证型）
实验目的：
1、学习和掌握无菌操作技术。

2、掌握定向发酵四环素的原理。

实验原理：
定向发酵是指通过改变培养基组分(加入某些物质)改变微生物代谢途径，使发酵按主观要求产生较多的产物。

金霉素、四环素和土霉素，它们的化学结构极为相似：
R1 R2
金霉素Cl H
土霉素H OH
四环素H H
金霉菌原是产生金霉素（Chlortetracycline）的菌种，但因金霉素比四环素只多一个氯离子，所以只要在发酵液中加入某些物质，阻止氯离子进入四环素分子，从而使菌种产生较多的四环素。

另外，金色链霉菌在30℃以下时，合成金霉素的能力较强；当温度超过35℃时则只合成四环素。

本实验中，利用溴离子在生物合成过程中对氯离子有竞争性抑制剂作用的原理，以及加入2-硫醇基苯并噻唑(即M—促进剂，分子式：C7H5NS2，通常作为橡胶硫化促进剂)抑制氯化酶的作用，从而增加四环素的产量。

材料、试剂和器材：
金霉素链霉菌：购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（菌种保藏号：CGMCC4.1043；订单号20111133 550元）。

超净工作台、摇床（250ml、500ml）
酒精灯、酒精棉球、工业酒精、打火机、接种铲、移液枪、剪刀
实验步骤：
前期准备工作：配制孢子培养基
麸皮36.0 g，K2HPO4 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，（NH4）2HPO4 3 g，琼脂15～20 g，定容至1L，pH 7。

1、制备斜面孢子：将保藏的菌种的比例接种于液体培养基中（不加琼脂的斜面培养基），28℃下200 r/min振荡培养，将活化1d后的金霉素链霉菌种接入孢子培养基，28℃培养5～7天，待孢子长成灰色，于4℃冰箱中保藏。

2、种子培养：在斜面上用接种铲挑取1cm2左右生长良好的菌体接入装有50ml四环素种子培养基的250ml锥形瓶中，230 r/min、28℃下振荡培养20～24h。

3、发酵培养：以剪口移液枪头取10 ml种子液接入装有100ml 发酵培养液的500ml锥形瓶中（注意：同一处理组用同一瓶种子液接种），230 r/min、28℃下振荡培养5 d。

用于后面的测定效价和薄层层析实验。

四环素的提取和精制（选作）
一、实验目的
1 ．掌握沉淀法精制四环素的原理、方法和基本操作技术。

2 ．熟悉pH 的控制与产量、质最的关系。

二、实验原理
四环素为两性化合物，其等电点为5.4 。

当溶液pH 等于等电点时，四环素呈游离碱形式，从水溶液中沉淀出来。

利用四环素的这一性质，可将四环素从发酵液中提取出来。

在连续结晶过程中，pH 的高低对产量、质量都有一定的影响。

四环素的等电点为5.4 , 在pH 4.5~7.5 之间，游离碱在水中的溶解度乎不变。

若pH 控制在接近等电点时，沉淀结品虽然比较完全，收率也高，但此时会有大量杂质同时析出，影响产品的色泽和质量；若pH控制得较低一些，对提高产品质量虽有好处，但沉淀结晶不够完全，收率会低些，影响产量。

因此，在选择沉淀结晶pH 时，就必须同时考虑到产
量、质量的效果。

在正常情况下，工艺上控制pH4.8左右。

若沉淀结晶质量较差，pH可控制得稍低些，有利于结晶质量的改善，但不能低于4.5，否则收率低，影响产量。

四环素的提取和精制分酸化、纯化、过滤、结晶和淋洗五个步骤。

(1 ) 酸化加入草酸，使积聚在菌丝体内的四环素尽可能多地成为可溶性盐，而转入液相。

四环素在酸性条件下较隐定，且草酸与钙离子反应生成不溶性的草酸钙，析出的草酸钙能促进蛋白质的凝固，提高滤液的纯度和过滤速度。

( 2 ）纯化纯化剂（黄血盐、硫酸锌和硼砂）与草酸一起混合作用，可以除去发酵液中大量酸溶性蛋白质、铁离子和其他多种离子色素以及其他杂质，从而使滤液纯净，并减少发酵液的粘度，利于过滤。

其中纯化剂黄血盐能与发酵液中的铁离子作用，生成普鲁士盐而除去铁离子。

( 3 ）过滤通过过滤，使四环素溶液与菌丝体以及其他杂质分离，再经过复滤、精滤，进一步提高滤液质址，得到澄清的滤液。

( 4 ) 结晶将滤液的pH调节到等电点，在较低温度下析出纯净的四环素。

( 5 ）淋洗虽然发酵液经酸化后大部分四环素已溶入溶液中，但仍有部分残存在菌渣中，且过滤不可能十分彻底。

所以用酸水淋洗，以提高收率。

三、实验材料及仪器
1．试剂
300 g/L草酸溶液、200 g/L 黄血酸钾溶液、200 g/L 硫酸锌溶液、200 g/L 硼砂溶液、浓氮水、3 g/L草酸溶液。

2．仪器
1000 mL 烧杯、搅拌器、布氏漏斗、抽滤瓶、滤纸、量筒、pH 试纸、酸度计、温度计、水
泵、表面皿。

四、实验步骤
1．酸化
取600ml 四环素发酵液，置装有机械搅拌的1000 mL烧杯中，开始搅拌，待发酵液温度降至20 ℃以下时，缓缓加入草酸溶液，草酸加入量为27～35g/L，并不时测定发酵液的pH。

当发酵液pH为1.7~1. 8 时（用酸度计测定），酸化完毕。

2．纯化
在酸化反应的烧坏中，按酸化的发酵液净体积，搅拌下依次缓慢加入纯化剂（黄血酸钾溶液、硫酸锌溶液、硼砂溶液），每种溶液终浓度均为2 g/L，加入时间间隔15min ，以便作用完全。

3．过滤
将布氏漏斗装于抽滤瓶上，铺好滤纸，开启水泵，用少量水将滤纸湿润，并使滤纸紧贴布氏漏斗。

将纯化后的溶液缓缓倒入布氏漏斗，过滤滤液应完全澄清，否则必须重新过滤，直到完全澄清。

4. 结晶
将抽滤瓶中的滤液倒入装有机械搅拌的1000 mL烧杯中，开动搅拌，并用水或冰水冷却。

待滤液温度冷至5 ～7 ℃时，徐徐加入经过滤的浓氨水，并随时用pH 试纸测定溶液的pH，当pH 达到4 . 6 ～4 . 8 时（用酸度计测定），停止加入氨水，并继续搅拌2 h，使结晶完全。

装好布氏漏斗后，将上述液缓缓倒人布氏漏斗，过滤。

结晶液全部倒入后，抽干。

用35～45 ℃的热水充分洗涤粗碱3 次，抽干，再用0 . 3 ％草酸洗涤，抽干。

五、注意事项
1．纯化搅拌时间不应少于2h，溶液温度保持在15 ℃以下。

2．pH 要调准确。

六、结果与讨论
1 ．计算四环素的得率。

2 ．讨论影响四环素得率和纯度的因素。