HPLC法测定油炸食品中TBHQ的方法学研究

HPLC法测定油炸食品中TBHQ的方法学研究
杜晓楠，刘晓娥
（宁夏建投设计研究总院（有限公司），宁夏银川 750000）
摘 要：特丁基对苯二酚（Tertiary Butylhydroquinone，TBHQ）为人工合成抗氧化剂，本文建立了高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）测定油炸食品中叔丁基对苯二酚含量的测定方法。

以市面上销售的油炸食品作为本次研究对象，采用超声提取方式，以乙腈饱和的正己烷作为提取溶剂，柱温为35 ℃，检测波长280 nm，选用C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，进样量10 μL，流动相为乙腈-水，采用梯度洗脱。

结果表明，TBHQ精密度RSD值为0.52%，TBHQ平均加标回收率为97%，方法快速、准确、灵敏度高。

关键词：高效液相色谱法；油炸食品；特丁基对苯二酚
Methodological Study on the Determination of TBHQ in Fried
Food by HPLC
DU Xiaonan, LIU Xiaoe
(Ningxia Construction Investment Design and Research Institute (Co., Ltd.), Yinchuan 750000, China)
Abstract: Tertiary Butylhydroquinone (TBHQ) is a synthetic antioxidant. A method for the determination of tertiary butylhydroquinone in fried foods by high performance liquid chromatography (HPLC) has been established. Taking the fried food sold on the market as the research object, ultrasonic extraction was adopted, n-hexane saturated with acetonitrile was used as the extraction solvent, the column temperature was 35 ℃, the detection wavelength was 280 nm, and a C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm) chromatographic column was selected, injection volume 10 μL, mobile phase acetonitrile-water, gradient elution. The results showed that the precision RSD value of TBHQ was 0.52%. The average spiking recovery of TBHQ was 97%, and the method was fast, accurate and sensitive.
Keywords: high performance liquid chromatography; fried food; tertiary butylhydroquinone
食品安全问题关系国计民生。

其中，油炸食品中各种抗氧化剂特别是有机合成类抗氧化剂的合理使用，也是需要关注的问题[1]。

当食品暴露在空气中时，会发生不同的反应，而氧化反应会使暴露在空气中的油脂发生变性，缩短保质期，特丁基对苯二酚（Tertiary Butylhydroquinone，TBHQ）可以和自由基发生反应，终止氧化过程，只需要添加少量就可以发挥有效作用。

目前国家有关标准规定TBHQ的最大使用限量为0.2 g·kg-1[2]，过量添加对人体有一定的致癌作用。

因此，加大对油炸食品中抗氧化剂的检测尤为重要[3]。

目前市面上的抗氧化剂有人工抗氧化剂和天然抗氧化剂，天然抗氧化剂有从绿茶中提取的茶多酚、迷迭香的花和叶中提取的迷迭香，以及从植物中提取的维生素C、维生素E等。

其中维生素、茶多酚等属水溶性物质对油脂的抗氧化效果一般；维生素E有一定的抗氧化作用，但是提取工艺复杂，价格昂贵。

油脂中常用的抗氧化剂是TBHQ，在食品中加入少量的TBHQ可以减缓油脂氧化作用，避免产生酸败现象，使油炸食品能够长时间保存。

目前国家有关标准中对油炸食品中TBHQ的限量要求是不大于0.2 g·kg-1，在此范围内对人体健康无害，超出范围则可能存在导致畸形和癌症的风险[4-5]。

因此本实验针对油炸食品中的TBHQ检测研究建立了高效液相色谱法，旨在研究出一种快速、准确、灵敏度高的检测方法。

1 材料与方法
1.1 试剂
TBHQ标准品（≥99%），北京曼哈格科技生物有限公司；甲醇（色谱纯），赛默飞世尔科技有限公司；
作者简介：杜晓楠（1996—），男，宁夏贺兰人，本科，助理工程师。

研究方向：食品安全、仪器分析。

乙腈（色谱纯），赛默飞世尔科技有限公司；正己烷（分析纯），国家计量科学研究院；氯化钠（分析纯），廊坊天科生物科技有限公司；薯片，编号为1、2，市售；薯条，编号为1、2，市售；方便面，编号为1、2，市售。

1.2 仪器
高效液相色谱仪（Aglient 1260 DAD），美国安捷伦科技有限公司；紫外分光光度计（TU-1810PC），北京普析通用仪器有限责任公司；超声仪（As3120），天津奥特赛恩斯仪器有限公司；高速离心机（TGL-16G/TDL80），上海安亭科学仪表厂；分析天平（CP214），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；漩涡混匀器（MX-F），天津奥特恩斯仪器有限公司；固相萃取装置（ASE-24），天津奥特赛恩斯仪器有限公司；旋转蒸发仪（RE-52A），上海亚荣生化仪器厂。

1.3 试验方法
1.3.1 溶液配制
TBHQ储备液（1 000 μg·mL-1）：准确称取TBHQ标准品0.01 g（精确至0.1 mg），将其倒入棕色容量瓶中，用乙腈冲洗残渣至10 mL容量瓶中并定容至刻度线，摇匀，配制成1 000 μg·mL-1的储备液，于0～4 ℃避光保存。

TBHQ工作液：分别吸取TBHQ储备液（1 000 μg·mL-1）0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容至刻度线，配成50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1L、300 μg·mL-1、400 μg·mL-1的标准工作液。

乙腈饱和的正己烷溶液：正己烷中加入乙腈至饱和状态。

正己烷饱和的乙腈溶液：乙腈中加入正己烷至饱和状态。

饱和氯化钠溶液：水中加入氯化钠至饱和。

乙腈甲醇混合液：取100 mL的乙腈和50 mL的甲醇混合。

1.3.2 色谱条件的优化
取50 mL的洁净离心管，加入5 mL乙腈饱和的正己烷溶液，加入已知含量的TBHQ的储备液，涡旋1 min，加入5 mL正己烷饱和的乙腈溶液，涡旋2 min，4 000 r·min-1离心5 min，收集下层清液，上机检测，分别考察检测波长、色谱柱种类、柱温及进样量、洗脱方式等因素对测定的影响，选出最佳的色谱条件。

1.3.3 样品前处理
样品的制备：将固体样品粉碎，混合均匀，用四分法取具有代表的样品，装入容器，贴上标签，密封保存。

提取：准确称取1 g制备好的试样于25 mL比色管中。

加入5 mL乙腈饱和的正己烷溶液，混匀1 min，然后加入5 mL饱和NaCl溶液，再加用5 mL饱和的乙腈溶液，涡旋2 min，4 000 r·min-1离心5 min，收集下层清液于离心管，上述操作2次，将3次提取液合并，然后净化。

净化：分别用5 mL的甲醇活化C18固相萃取柱，再用乙腈平衡萃取柱，将上述提取液液倒入柱中，弃去初滤液，用5 mL乙腈和甲醇的混合溶液洗脱。

收集洗脱液于旋蒸瓶中，40 ℃下旋转蒸发至干，用2 mL乙腈溶解残渣，过0.22 μm有机微孔滤膜，供液相色谱仪测定，同时做空白实验。

1.3.4 方法学验证
筛选出合适的色谱条件后，在此条件下对高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）测定油炸食品中TBHQ的方法进行验证，从线性、精密度、检出限与定量限、样品的测定等方面对该方法进行考察。

2 结果分析
2.1 色谱条件的确定
2.1.1　检测波长
在180～1 200 nm波长范围，用紫外分光光度计对TBHQ标准溶液进行光谱扫描，扫描后发现TBHQ在280 nm处吸光度最大，所以本次实验选择280 nm为TBHQ的检测波长。

2.1.2　色谱柱的确定
本实验分别用C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）和C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）两种色谱柱进行实验，发现C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）的色谱柱出峰时间早于C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，但分离能力不如C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，所以选取后者为本次实验色谱柱。

2.1.3　柱温
本次柱温选择30 ℃、35 ℃、40 ℃分别进行实验，其中设置30 ℃接近室温，到中午天气升温，屋内温度大于柱温，柱温失效，不利于控制色谱柱温度，设置40 ℃时，TBHQ目标峰与梯度洗脱出来的溶剂峰挨得过近，不利于分离目标化合物，最终实验发现35 ℃时效果最佳。

2.1.4　进样量
本次选择5 μL、10 μL、50 μL 3个进样量进行实验，在进样量为5 μL时，最低点的浓度出峰不明显，
低浓度值检测不准确，在进样量为50 μL 时，色谱峰峰型过宽，容易包峰，导致检测不准。

最终发现 10 μL 时进样效果最佳，所以确定柱温为35 ℃、进样量10 μL 。

2.1.5　洗脱方式
本实验对梯度洗脱和等度洗脱进行对比实验，发现采用梯度洗脱时，分离效果好、出峰速度快、采用等度洗脱时出峰时间较晚且分离度不如梯度洗脱，故选择梯度洗脱为本次实验条件，流动相为乙腈-水，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱表
时间/min
乙腈/%水/%0109020901025901026109030
10
90
2.2 方法学验证
2.2.1　标准曲线
按照确定好的色谱条件，分别配制50 μg·mL -1、100 μg·mL -1、200 μg·mL -1、300 μg·mL -1和400 μg·mL -1的标准工作液，将配制好的溶液装入进样瓶中，设置好色谱条件，依次上机检测，以配制的浓度为横坐标，所对应浓度的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到f （y ）=0.002 8x +986、相关性系数为0.999
9的线性回归方程，线性范围50～400 μg·mL -1， 见图1。

2.2.2 精密度
选取薯片作为基质样品，称取7份，其中一个为空白样品，剩下6个分别编号1～6分别加入 0.6 mL 的标准储备液（1 000 μg·mL -1），按照样品处理步骤，进行样品处理，然后上机检测，在减去空白值后所测得含量值分别为201 mg·kg -1、
203 mg·kg -1、202 mg·kg -1、200 mg·kg -1、201 mg·kg -1、202 mg·kg -1，精密度为0.52%，实验精密度小于2%，实验结果良好。

2.2.3 回收率
称取18份粉碎好的薯片，分为低中高3组，每组6个，分别按表2中的添加量加入对应浓度的储备液，然后按照确定好的方法进行前处理，最后上机检测。

实验结果表明薯片中TBHQ 的回收率为96%～98%，相对标准偏差（RSD ）不大于2%，实验结良好，表明方法可靠.
2.2.4 检出限和定量限
检出限和定量限结果如表3所示。

2.2.5 样品的测定
对市场上销售的薯片、方便面、薯条按照所建立方法进行测定，检测产品是否符合国家标准。

由表4的数据可知，市面上常见的油炸食品TBHQ 均未检出，产品合格。

y = 0.002 8x +986R 2=0.999 9
500
1 000峰面积
1 500
050100150
200TBHQ浓度/μg·mL -1
250
300350400450
图1 TBHQ 校准曲线图表2 
加标回收率试验数据添加量/mg·kg
-1
测定值/mg·kg -1
平均回收率/%
RSD/%123456平均值10096939795
95989696 1.8320019220119319219819719698 1.91600581586
572
586582
571
580
97
1.15
表3 
检出限定量限结果
名称高度浓度/μg·mL -1
噪音检出限/μg ·mL -1
定量限/μg ·mL -1
TBHQ
41 793
50
72.99
0.26
0.79
3 结论
本文建立了HPLC法测定油炸食品中TBHQ样品预处理方法，采用C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，检测波长为280 nm，以乙腈和水作为流动相，采用梯度洗脱方式，柱温35 ℃，进样量为10 μL，选取正己烷去油脂，乙腈提取，C18固相萃取柱净化，紫外检测器检测，外标法定量，得到TBHQ 平均加标回收率为97%，精密度为0.52%，检出限为0.26 μg·mL-1，定量限为0.79 μg·mL-1。

该方法快速、准确、灵敏度高，具有推广应用价值。

参考文献
[1]韩焕美,闫荣军,张爱霞,等.高效液相色谱法测定食用植物油中6种合成抗氧化剂[J].化学分析计量,2019,28(2):89-93.
[2]尹淑涛,薛文通,张惠,等.油脂中合成抗氧化剂检测技术的研究进展[J].中国油脂,2009,34(6):75-79.
[3]周延培,朱盼盼,崔玲君,等.高效液相色谱法测定食用油中多种抗氧化剂的研究[J].粮食与油脂,2020,33(8):56-59.
[4]晁桂梅.高效液相色谱法测定食用油中9种抗氧化剂[J].分析仪器,2020(6):28-31.
[5]刘年丰,涂一名,夏虹,等.高效液相色谱法测定油脂中抗氧化剂BHA、TBHQ[J].分析科学学报,2003,19(6):549-551.
表4 样品测定结果
序号样品种类测得值/g·kg-1国家限量值/g·kg-1结论
1薯片-1未检出
TBHQ≤0.2合格
2薯片-20.051 2合格3薯条-1未检出合格4薯条-20.041 9合格5方便面-1未检出合格6方便面-2未检出合格
3.4　提高资金投入水平，引入先进的管理模式
当前该地区农产品的生产模式仍然是比较粗放的模式，建议引入先进的管理理念及方式，如良好农业规范、危害分析临界控制点、农产品质量安全追溯系统等。

近几年，我国在农产品安全追溯系统方面的投入不断加大，目前江苏省已建立省级农产品质量安全信息追溯平台，宿迁市宿城区暂未开发相关的追溯平台，后期建议政府加大资金投入，开发宿城区的农产品质量安全信息追溯平台，并与省级和国家级追溯平台接轨，同时在全区各个监管站和规模种植主体配备合格证自助开具一体机及二维码打印机，可以实现对二维码信息识别，读取追溯信息[6]，包括产品生产过程中的用药记录、种植记录、产品检测报告等信息，保证农产品身份可识别，源头可追溯、信息可查询。

这一措施不但能实现从生产到餐桌的全程管理，更能提高消费者安全消费水平，让消费者能快捷地了解所购买产品的生产和流通全过程[7]。

4 结论
农产品质量安全是最基本的也是最重要的民生福祉，与广大消费者的身体健康和生命安全息息相关，也与产业发展和社会经济发展安全密切关联，
对社会稳定乃至政府形象都有巨大影响。

解决农产品质量安全问题，需进一步完善农产品质量安全监管的标准和制度，切实增加投入，强化制度建设，形成“政府保障有力、部门监管到位、社会公众广泛参与、社会舆论有效监督”的农产品质量安全长效监管机制[8]。

参考文献
[1]黄进斌,吴朝霞.福建省农产品质量安全现状分析与监管对策[J].福建农业科技,2010(2):75-78.
[2]廉华,刘敏.基层农产品质量安全监管体系存在的问题及对策[J].中国食品,2022(16):56-58.
[3]赵炜丽.潍坊市农产品质量安全监管问题及对策研究[D].济南:山东大学,2014.
[4]尹喆,刘东骄.唐山市食用农产品质量安全现状及对策探析[J].现代食品,2021(24):158-161.
[5]刘瑜.我国农产品质量安全监管问题及对策分析[J].农业经济,2020(4):136-138.
[6]陈杰,杨俊,吴军辉,等.农产品安全追溯系统发展现状与趋势[J].农学学报,2018,8(9):89-94.
[7]韩星,李学工.中国农产品安全追溯系统建设成就及未来发展建议[J].农业展望,2014,10(6):74-79.
[8]叶青.我国农产品质量安全监管对策研究:以上海绿叶菜产业为例[D].重庆:西南大学,2014.
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